高糖高脂促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

寧宇陽(yáng),堯 青,徐 魁,劉 超**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院內(nèi)二科)

內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition,End-MT)是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過(guò)程,在一定的生理和病理?xiàng)l件下,內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,降低內(nèi)皮特性,獲得間充質(zhì)特征[1]。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于所有的血管腔表面,是一個(gè)重要的功能性界面。在各種內(nèi)外因素如高血壓,吸煙的刺激下,內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),使內(nèi)皮細(xì)胞更容易脫離原來(lái)的位置,影響血管內(nèi)膜層完整性[2];此外,內(nèi)皮細(xì)胞維護(hù)血管收縮舒張平衡的功能在此情況下明顯受損。因此,可以說(shuō)End-MT損傷了內(nèi)皮細(xì)胞的物理及生化等多方面功能。

目前,End-MT的發(fā)生發(fā)展常用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行研究。通常,原代內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)或ECs系通過(guò)化學(xué)或物理刺激誘導(dǎo)發(fā)生End-MT。有研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)與IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子可引起End-MT,參與內(nèi)皮功能障礙[3-4]。在其中應(yīng)用最廣泛的是TGF-β1刺激5～8d[5],從而引發(fā)End-MT。隨著研究的不斷深入,End-MT在動(dòng)脈粥樣硬化,心臟和腎臟纖維化、肺動(dòng)脈高壓、癌癥等多疾病中的作用被逐漸重視[6-7]。

慢性高糖(high glucose,HG)是糖尿病血管并發(fā)癥的主要誘因,糖尿病患者因胰島素抵抗可致能量利用與消耗的失衡,造成糖脂代謝紊亂,使得內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)從而轉(zhuǎn)化成為平滑肌細(xì)胞,導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚,管腔狹窄,引發(fā)血管病變[8]。目前高糖高脂是否對(duì)End-MT有刺激效果,以及是否參與內(nèi)皮功能障礙尚不確定。本文擬探究高糖高脂刺激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的End-MT作用,為未來(lái)間充質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器:倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Eppendorf公司);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

試劑:游離脂肪酸游離牛血清白蛋白(BSA,批號(hào)SRE0098)、棕櫚酸(PA,批號(hào)P0500)為Sigma公司產(chǎn)品;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM(Cat No.1001)為Sciencell公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)和胰酶為Gbico公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)P0012S)、RIPA細(xì)胞裂解物(批號(hào)P0023A)均為碧云天公司產(chǎn)品;一抗稀釋液(武漢塞維爾生物);一抗,兔抗VE-Cadherin (批號(hào)A22659);兔抗α-Smooth Muscle Actin(ACTA2)(批號(hào)A7248);兔抗Platelet endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1/CD31)(批號(hào)A0378);兔抗N-Cadherin(批號(hào)A19083)等為ABclonal公司產(chǎn)品;β-actin(批號(hào)58169)為CST公司產(chǎn)品。

細(xì)胞:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞,武漢華聯(lián)科生物公司)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞,武漢華聯(lián)科生物公司),37℃ 5.0%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度鋪滿約90%培養(yǎng)皿底時(shí),采用0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代。從第6代HUVEC細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行刺激,先將培養(yǎng)細(xì)胞所用的ECM培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基,然后隨機(jī)分組。分別采用20ng/mL的TGF-β1或者33mmol/L高糖加0.15mmol/L棕櫚酸,來(lái)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行轉(zhuǎn)化刺激。根據(jù)處理?xiàng)l件的不同,第6代HUVEC將細(xì)胞分為CON組、HG+HP組(33mmol/L高糖加0.15mmol/L處理)、TGF-β1組(20ng/mL處理)。

1.2.2 Western blot法

對(duì)HG+HP組和CON組的HUVEC細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液,冰上裂解10～15min然后刮下細(xì)胞離心提取蛋白,使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)濃度。校正濃度后,每組以校正后體積進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳,后將蛋白以350mA、90min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂牛奶封閉后,在4℃孵育所需的一抗(1∶1000)12～16h,然后用TBST洗膜,加入相對(duì)應(yīng)的二抗(1∶5000),以ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色后成像,ImageJ軟件分析測(cè)試結(jié)果。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)

選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,消化、重懸后將懸液接種于含有細(xì)胞爬片的24孔板中,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h,采用20ng/mL的TGF-β1或者33mmol/L高糖加0.15mmol/L棕櫚酸進(jìn)行刺激,72h后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),甲醛室溫固定10min,0.1%Triton處理10min,3%BSA室溫封閉1h,加入一抗4℃避光過(guò)夜,二抗室溫避光孵育1h,加入適量DAPI染色5min,以上各步驟之間均用PBS緩沖液洗滌3～4次,5min/次,然后用抗熒光淬滅劑封片,并在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 高糖高脂刺激對(duì)HUVEC細(xì)胞形態(tài)的影響

CON組細(xì)胞邊界清晰,胞質(zhì)豐富,形態(tài)為圓形、短梭形或扁平形,細(xì)胞間連接緊密,可融合成片呈鋪路石樣。在經(jīng)過(guò)TGF-β1或高糖高脂處理72h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變。TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)逐漸向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變,細(xì)胞間連接變少,間隙變大,HG+HP組細(xì)胞形態(tài)與TGF-β1組相似,且細(xì)胞更加稀疏(圖1)。

圖1 高糖高脂刺激對(duì)于HUVEC細(xì)胞的影響

2.2 高糖高脂對(duì)HUVEC細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響

高糖高脂刺激后,HUVEC間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白表達(dá)增加,內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化特征就是內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)相應(yīng)減少,而對(duì)應(yīng)的是間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物相應(yīng)增加。如圖2A、B、C所示,與CON組相比,HG+HP組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)丟失,表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。同時(shí)與CON組相比,HG+HP組血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31表達(dá)下調(diào)(P<0.05),而神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。證明經(jīng)高糖高脂的刺激后HUVEC細(xì)胞發(fā)生了明顯間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。

與CON組相比,*P<0.05,n=3。

2.3 免疫熒光測(cè)定高糖高脂刺激后HUVEC間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)情況

采用免疫熒光檢測(cè)高糖高脂干預(yù)72h后細(xì)胞蛋白CD31、α-SMA及VE-cadherin的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示高糖高脂組和TGF-β1組較正常組血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31表達(dá)下調(diào)(圖3),間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)明顯上調(diào)(圖4)。同時(shí)如圖5,TGF-β1組與高糖高脂組較正常組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)表達(dá)明顯下調(diào)。證明經(jīng)高糖高脂刺激后,HUVEC細(xì)胞發(fā)生了明顯間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。

圖3 免疫熒光測(cè)定CD31表達(dá)情況(標(biāo)尺:5μm)

圖4 免疫熒光測(cè)定α-SMA表達(dá)情況(標(biāo)尺:5μm)

圖5 免疫熒光測(cè)定VE-cadherin表達(dá)情況(標(biāo)尺:5μm)

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變是血管病變發(fā)生的重要因素。正常血管內(nèi)皮不僅覆蓋在血管腔表面保護(hù)血管平滑肌,而且是重要的內(nèi)分泌器官和效應(yīng)器官[9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞參與機(jī)體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等重要的生命活動(dòng),可以產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性因子,起調(diào)節(jié)血管張力、血管生長(zhǎng)、血小板功能和凝血功能等作用。同時(shí)內(nèi)皮功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致血管舒縮性受損,增加炎癥細(xì)胞黏附[10]。內(nèi)皮功能失調(diào)在心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,同時(shí)也是糖尿病高血糖損傷血管的重要靶標(biāo)[11]。糖尿病造成的持久性高血糖會(huì)對(duì)血管造成彌散、廣泛損傷,導(dǎo)致血管結(jié)締組織基質(zhì)成分顯著改變,平滑肌細(xì)胞增殖,膠原過(guò)度表達(dá),血管壁纖維化、硬化、管腔狹窄,并且可能引發(fā)血流紊亂,最終造成血流動(dòng)力學(xué)障礙[12],這種血流動(dòng)力學(xué)障礙成為動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病發(fā)生發(fā)展的力學(xué)基礎(chǔ)。綜上所述,糖尿病血管病變基礎(chǔ)是可能是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷所致,因此,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療非常重要。

內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制復(fù)雜,End-MT可部分參與內(nèi)皮功能障礙的過(guò)程,且內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的血管功能障礙與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切[13]。而動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是心血管疾病共同的病理基礎(chǔ),這種血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的前期病變因素[14]。有研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞在剪切應(yīng)力、促炎因子、缺氧等生理或病理因素的刺激下,相關(guān)通路包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β,Notch、Ras等被激活,進(jìn)而促進(jìn)End-MT的發(fā)生發(fā)展,End-MT在血管疾病發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段——早期內(nèi)皮功能紊亂、斑塊形成、斑塊不穩(wěn)定性及晚期血管鈣化都發(fā)揮重要作用[15]。

本文研究發(fā)現(xiàn)高糖高脂刺激可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,發(fā)生表型轉(zhuǎn)化;同時(shí),在該刺激下內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)。值得注意的是,本文中的HUVEC在經(jīng)歷細(xì)胞傳代6代,給予TGFβ1和高糖高脂刺激會(huì)取得最好的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化效果。糖尿病血管并發(fā)癥是否由高糖高脂刺激引發(fā)的End-MT而造成尚未明確,同時(shí),高糖高脂引起End-MT的具體分子機(jī)制和作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。未來(lái)可進(jìn)一步探索End-MT與糖尿病血管并發(fā)癥之間的聯(lián)系,為減輕糖尿病血管病變提供新策略和理論依據(jù)。