電針對失神經(jīng)肌萎縮大鼠自噬相關(guān)因子的影響*

張淑芳,李 童

(湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430072)

目前,對于失神經(jīng)病變導(dǎo)致的骨骼肌萎縮,在臨床上尚無有效的藥物治療措施。而針刺,尤其是電針,是現(xiàn)在治療肌萎縮的一種常用方法,有著較好的療效。電針刺激“陽陵泉”和“足三里”穴后,能夠上調(diào)糖尿病肌病模型中萎縮肌肉IGF-1、Akt及p70S6k的表達,緩解因糖尿病引起的骨骼肌萎縮,促進肌肉再生[1]。電針干預(yù)還可上調(diào)衰老性肌萎縮大鼠骨骼肌中mTOR和磷酸化mTOR的表達水平,繼而阻止肌萎縮的進一步發(fā)生[2]。在周圍神經(jīng)損傷大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)電針能夠提高細胞自噬反應(yīng),有利于坐骨神經(jīng)功能及組織形態(tài)的修復(fù),從而延緩其靶器官骨骼肌的萎縮[3]。但在失神經(jīng)肌萎縮狀態(tài)下,自噬會過度激活,而電針可通過抑制自噬相關(guān)基因,下調(diào)自噬水平,從而達到維持骨骼肌細胞穩(wěn)態(tài)并延緩肌萎縮的發(fā)生[4]。因此,自噬活性適度與過度的界定是針刺防治骨骼肌萎縮進一步深入研究和探討的方向。

1 材料與方法

1.1 研究對象及試劑儀器

由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供的雄性SD大鼠36只,SPF級,體質(zhì)量為(350±10)g,代養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房。

主要儀器:華佗牌無菌針灸針,為蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn);HANS-200A穴位神經(jīng)刺激儀為聯(lián)創(chuàng)科技(集團)南京濟生醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。主要試劑:蘇木素染液(AS1055A)、伊紅染液(AS1094),均來自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 失神經(jīng)肌萎縮動物模型的建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為3組:假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=12)、和模型電針組(n=12)。參考并復(fù)制朱正威等[5]的造模方法,制備大鼠失神經(jīng)性肌萎縮模型。

1.2.2 電針干預(yù)方法

造模后第2d,將電針組大鼠置于固定器上,取穴方法依照《實驗針灸學(xué)》[6],選取大鼠右側(cè)“足三里”穴和“環(huán)跳”穴進行電針干預(yù),使用一次性無菌針灸針直刺5～7mm,然后接上電子針療儀,使用連續(xù)波,頻率2Hz,電流強度1.0mA,每次10min,1次/d,共干預(yù)14d。假手術(shù)組和模型組大鼠每日采取相同方法固定,但無電針干預(yù)。

1.2.3 取材

電針干預(yù)14d后,將各組大鼠進行腓腸肌標本取材。手術(shù)完整剝離雙側(cè)腓腸肌,PBS冰浴后,用濾紙吸干表面殘液,剔除其表面多余肌腱及血管,于電子天平器上稱取雙側(cè)腓腸肌濕重并記錄數(shù)據(jù)(反復(fù)稱量3次,選擇平均值);隨后將標本放置凍存管中于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blotting法

剪切0.3g組織+800μL裂解液+8μL蛋白酶抑制劑,放入打樣管,加入磁珠,勻漿機充分勻漿,進行蛋白總樣品的制備。隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育和免疫反應(yīng)等,最后加入發(fā)光劑,拍攝成像。本實驗所用一抗來源為Bax(CST,2772)、LC3(CST,12741)、Atrogin-1(Ls-c18343)、Bcl2(SC-492)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗所得數(shù)據(jù)用GrapdhPad Prism 7統(tǒng)計處理,數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示。使用單因素方差分析,對各組間進行比較,P<0.05設(shè)定為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 電針干預(yù)提高了失神經(jīng)肌萎縮大鼠骨骼肌濕重比值

如表1所示,與假手術(shù)組相比,模型組與電針組的濕重比顯著下降(P<0.05),電針組與模型組相比,濕重比顯著性上升(P<0.05),表明電針干預(yù)有利于腓腸肌肌萎縮的修復(fù)。

表1 電針干預(yù)后失神經(jīng)肌萎縮大鼠腓腸肌質(zhì)量變化(n=12)

2.2 電針對肌纖維結(jié)構(gòu)的影響

通過HE染色發(fā)現(xiàn),電針使肌肉組織形態(tài)學(xué)發(fā)生了改變。具體表現(xiàn)為:假手術(shù)(C)組腓腸肌肌纖維形態(tài)規(guī)則,細胞核分布正常,胞質(zhì)染色均勻。而在模型組(M)中,可觀察到其肌纖維的橫切面上形態(tài)大小不一,細胞邊界不清晰,同時伴有肌束間結(jié)締組織的增生。電針組(E)與模型組(M)相比,其肌組織受損程度減輕,見圖1。

C.假手術(shù)組;M.模型組;E.電針組。

2.3 電針使失神經(jīng)肌萎縮大鼠中腓腸肌組織細胞自噬和細胞凋亡水平下降

如圖2所示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腓腸肌組織中Bcl2顯著下降(P<0.05),同時Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Atrogin-1的表達上升(P<0.05)。與模型組相比,電針組大鼠腓腸肌組織中Bcl2表達增加(P<0.05),而Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Atrogin-1的表達下降(P<0.05)。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的下降,反映了電針降低了失神經(jīng)肌萎縮大鼠腓腸肌組織中的自噬水平。Bcl2表達增加和Bax的下降,反映電針降低了失神經(jīng)肌萎縮大鼠腓腸肌組織中的凋亡水平。

C.假手術(shù)組;M.模型組;E.電針組(與C組比較,*P<0.05;與E組比較,#P<0.05,n=12)。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將失神經(jīng)性肌萎縮歸為“痿癥”范疇,失去神經(jīng)支配后的骨骼肌肌纖維變細甚至消失為其典型的病理特征[7]。在本實驗中,采用離斷坐骨神經(jīng)的方法制備了右側(cè)腓腸肌失神經(jīng)肌萎縮模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組與假手術(shù)組相比,腓腸肌質(zhì)量患側(cè)/健側(cè)顯著性下降,同時可觀察到模型組骨骼肌肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。說明此坐骨神經(jīng)離斷方法可導(dǎo)致大鼠骨骼肌肌纖維的損失,能較好地模擬失神經(jīng)肌萎縮模型。

大量研究表明[8-9],泛素連接酶MAFbx/Atrogin-1在各種萎縮狀態(tài)中被激活,如長時間的肌肉制動、sarcopenia和癌癥惡病質(zhì)。誘導(dǎo)肌萎縮后,肌肉特異性泛素酶Atrogin-1和MuRF1的缺失會減輕肌肉萎縮的發(fā)生。與之前的報告相同,本研究中發(fā)現(xiàn),與對照組相比,去神經(jīng)支配的大鼠腓腸肌組織Atrogin-1表達顯著增加。Atrogin-1是重要的肌肉特異性E3連接酶,它通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在肌肉收縮蛋白的降解中發(fā)揮重要作用。而通過針刺治療后,Atrogin-1表達顯著下降,腓腸肌濕重比相對模型組顯著上升。表明電針可能通過下調(diào)肌萎縮蛋白Atrogin-1以減輕肌肉收縮蛋白的降解,緩解失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)生。LC3是第一個被發(fā)現(xiàn)的自噬體標記蛋白。當(dāng)自體吞噬發(fā)生時,Ⅰ型LC3經(jīng)泛素樣加工修飾過程,與自噬表面的磷脂乙醇胺(PE)結(jié)合,形成Ⅱ型LC3。LC3-Ⅱ結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上,其含量與自噬泡數(shù)量呈正比,因此,LC3的表達強度與自噬活性密切相關(guān)。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)是自噬激活的典型標志。

Bcl-2家族可以分為兩類:一類為抗細胞凋亡蛋白,其代表是Bcl2蛋白;另一類是促細胞凋亡蛋白,其代表是Bax蛋白。它們通過一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用[10]。Beclin1是自噬體形成過程中的一個必需分子,它能夠介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡從而調(diào)控哺乳動物自噬體的形成與成熟[11]。Bcl2家族蛋白與Beclin1結(jié)合并破壞Beclin1和Vps34之間的相互作用,從而抑制自噬體的形成。Beclin1-Bcl2復(fù)合物在細胞內(nèi)發(fā)揮變阻器功能,保證細胞自噬水平維持在生理穩(wěn)態(tài)范圍內(nèi),而不會超出非生理性范圍誘發(fā)細胞死亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn),去神經(jīng)支配后大鼠腓腸肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl2上調(diào),Bax蛋白含量下降,表明去神經(jīng)支配后骨骼肌自噬水平上調(diào),這可能會造成細胞過度的自我消化和重要的細胞內(nèi)組分的降解,從而導(dǎo)致細胞死亡。而針刺可能通過抑制蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)來減輕去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的細胞過度死,以減輕骨骼肌的萎縮過程。