阿司匹林抑制胃癌干細(xì)胞的機(jī)制研究*

王子昂,馬洪杰,王騰飛,武 倩,周 紅,寧志豐,沈 昕,吳 喆,

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生及健康學(xué)院;3.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;4.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部口腔與眼視光學(xué)院)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球常見的惡性腫瘤疾病,據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)告的全球癌癥患病現(xiàn)狀調(diào)查顯示,2012年中國GC發(fā)病數(shù)占全球GC發(fā)病數(shù)的42.6%,其死亡率45.0%居第六位[1]。近年來研究表明[2-3],非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以有效干預(yù)腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,對胃癌具有潛在的預(yù)防和治療效果。阿司匹林是非甾體抗炎藥的代表性藥物,幾十年來臨床上廣泛用于治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕、心血管等疾病。阿司匹林有抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4],長期服用阿司匹林可以顯著降低胃癌的死亡率[5]。本研究以人胃癌細(xì)胞株SGC7901為研究對象,探討阿司匹林對胃癌干細(xì)胞有無抑制作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司,雙抗購買自碧云天生物技術(shù)公司,Transwell小室購買自Costar公司,低黏附6孔板以及96孔板購自Corning公司,Matrigel基質(zhì)膠購買自BD公司。人表皮生長因子EGF、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF、神經(jīng)生長因子B27、阿司匹林(批號:A2093)、MTT(批號:M2128)、二甲基亞砜(DMSO)(批號:472301)購自SIGMA公司。天逸510S-07ICB型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司、BCA蛋白定量檢測試劑盒(批號:KGPBCA)、蛋白提取試劑盒(批號:KGP1050)和SDS-PAGE凝膠試劑盒(批號:KGP113K)均購自南京凱基生物。EPS600型電泳儀購自美國Bio-Rad公司,TH4-200型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。其他試劑為生化分析純。

A.不同濃度阿司匹林對胃癌SGC7901細(xì)胞48h增殖的影響;B.不同時(shí)間段阿司匹林(0.4mmol/L)對胃癌SGC7901細(xì)胞增殖影響(與空白對照相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。

A.不同濃度的阿司匹林對胃癌SGC7901細(xì)胞的克隆形成圖;B.不同濃度阿司匹林對胃癌SGC7901細(xì)胞的克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)圖(與空白對照組比較,**P<0.01,n=3)。

A.不同濃度的阿司匹林對胃癌SGC7901細(xì)胞縱向遷移情況與縱向遷移能力統(tǒng)計(jì)圖;B.不同濃度的阿司匹林對胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲能力與侵襲能力統(tǒng)計(jì)圖(與空白對照組比,***P<0.001,n=3)。

A.經(jīng)不同濃度阿司匹林干預(yù)24h后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;B.E2F1灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C.Sox2灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果(與對照組比較,***P<0.001,n=3)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞在普通完全培養(yǎng)基(10%的FBS、90% RPMI-1640、1%的青霉素鏈霉素雙抗)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待培養(yǎng)約48h后換液1次;待貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時(shí),以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,將細(xì)胞吹打分離,離心重懸后以1∶2比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 阿司匹林藥物濃度的配制

稱取1800mg阿司匹林溶于2.5mL DMSO,制成4mol/L的阿司匹林原液,按照實(shí)驗(yàn)要求用培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需的濃度梯度:0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L。

1.2.3 微球體的培養(yǎng)

取處于對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞,用PBS洗掉殘留的血清。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,1000轉(zhuǎn)5min離心、計(jì)數(shù)、懸浮培養(yǎng)基重懸、取10 000個(gè)細(xì)胞接種于Poly-hema包被的25cm的2個(gè)培養(yǎng)瓶中,放于37℃、5% CO2、恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24h后加入懸浮培養(yǎng)基2mL。懸浮培養(yǎng)基的組成為:無血清DMEM/F12(1∶1)中添加20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF、2% B27,2d半左右培養(yǎng)液顏色變?yōu)槲ⅫS時(shí)半量換液。取生長至10d左右的微球體開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 MTT法

取懸浮培養(yǎng)的微球體,離心,經(jīng)胰酶消化吹打成單細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),放入普通培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。將微球體細(xì)胞接種于96孔板中,培養(yǎng)24h,將96孔板中的原培養(yǎng)液棄去,用PBS洗兩遍,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,邊緣孔用無菌PBS充填即(空白對照)和只加入普通完全培養(yǎng)基不加藥(調(diào)零孔)以及(實(shí)驗(yàn)組)即各孔以0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L阿司匹林填充,定容至200μL,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在終止培養(yǎng)前4h,每孔加入20μL MTT,3～4h后,小心吸去原培養(yǎng)液,每孔加入150μL DMSO,37℃溫箱孵育10min,隨后用酶標(biāo)儀檢測490nm處各孔的吸光度(A)值。藥物抑制率為(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對照組OD)×100%。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

第四，加強(qiáng)水利財(cái)務(wù)工作，是深化水利重點(diǎn)領(lǐng)域改革、創(chuàng)新水利科學(xué)發(fā)展體制機(jī)制的迫切需要。改革創(chuàng)新是水利事業(yè)發(fā)展的引擎和動(dòng)力。當(dāng)前，水利改革已經(jīng)進(jìn)入攻堅(jiān)階段，深層次矛盾日益顯現(xiàn)，推進(jìn)難度不斷加大。必須從水利改革發(fā)展全局出發(fā)，抓住重點(diǎn)，突破難點(diǎn)，力求在建立水利投入穩(wěn)定增長機(jī)制、推進(jìn)水價(jià)綜合改革上取得新進(jìn)展，同時(shí)，積極協(xié)調(diào)落實(shí)好現(xiàn)有政策，著力穩(wěn)定管理經(jīng)費(fèi)渠道和規(guī)模，為水資源管理、水利工程管理、基層水利服務(wù)體系建設(shè)等提供強(qiáng)有力的資金保障。

取處于懸浮培養(yǎng)的微球體,胰酶消化后,離心重懸,細(xì)胞計(jì)數(shù),加入6孔板中,每孔約接種1000個(gè)微球體細(xì)胞,隔天換液,加入阿司匹林濃度梯度為0、0.2、0.8mmol/L的完全培養(yǎng)基,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,3～4d換液一次,10～14d鏡下觀察,克隆形成后終止培養(yǎng),將原培養(yǎng)液棄去,PBS洗2遍,1mL甲醇室溫固定30min,每孔1mL 0.1%結(jié)晶紫染色30min,細(xì)流水沖洗,干燥后拍照,計(jì)算陽性克隆數(shù)?？寺÷蕿榭寺?shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

將保存于-20℃的matrgel基質(zhì)膠預(yù)先4℃環(huán)境下解凍,成液態(tài)后與無血清培養(yǎng)基按1∶5的比例混勻,每小室加入100μL放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱,3～4h后至其完全凝固備用,使用前用無血清培養(yǎng)基潤濕。取微球體,胰酶消化、離心、吹打其至均勻,用無血清培養(yǎng)基將其重懸、計(jì)數(shù),每小室接種20 000個(gè)微球體細(xì)胞,加入阿司匹林(濃度為0、0.2、0.8mmol/L),下室加入500μL含20%FBS的普通培養(yǎng)基,每一濃度梯度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24h后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)取出小室,PBS洗3遍,每孔加入4℃預(yù)冷的甲醇固定30min,用0.1%結(jié)晶紫染色,吸出結(jié)晶紫并用超純水清洗2遍,室溫風(fēng)干,拍照。每小室取3個(gè)角度進(jìn)行拍攝,計(jì)數(shù)。

1.2.7 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)

收集懸浮培養(yǎng)的微球體細(xì)胞,胰酶消化,離心,將其吹打均勻,計(jì)數(shù),無血清培養(yǎng)基重懸,每一小室加入20 000個(gè)細(xì)胞,阿司匹林濃度梯度為0、0.2、0.4、0.8mmol/L,且上室每孔最終總體積為200μL,設(shè)3個(gè)復(fù)孔,放置細(xì)胞孵箱培養(yǎng)17h取出小室,PBS洗兩遍,用0.1%結(jié)晶紫染色20min,清洗風(fēng)干,于鏡下觀察記錄膜背面遷移的細(xì)胞數(shù),每小室取3個(gè)角度進(jìn)行拍攝計(jì)數(shù)。

1.2.8 Western blot法檢測Sox2和E2F1的蛋白表達(dá)情況

RIPA強(qiáng)裂解液提取微球體細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,以每孔15μg蛋白量上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,PBS-T將兔抗人E2F1單克隆抗體(1∶1000,Abclonal,產(chǎn)品編號:A19579)、兔抗人Sox2單克隆抗體(1∶1000,Abclonal,產(chǎn)品編號:A19118)進(jìn)行稀釋,4℃孵育PVDF膜過夜,次日PBS-T洗膜,用抗體稀釋液(碧云天)稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶10 000),37℃搖床孵育1h。用TBST充分洗滌PVDF膜4～5次,每次5min,滴加ECL工作液于PVDF膜上,充分反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光條帶明顯后,沖洗膠片,顯影。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以卡方檢驗(yàn)表示,多組間比較采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè)),當(dāng)P<0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細(xì)胞的增殖

阿司匹林作用48h后對人胃癌細(xì)胞株SGC7901的增殖具有抑制作用,其抑制程度隨阿司匹林濃度的增加而增強(qiáng),呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1A)。隨著時(shí)間的推移,0.4mmol/L阿司匹林呈時(shí)間依賴性抑制人胃癌細(xì)胞株SGC7901的增殖(圖1B)。

2.2 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細(xì)胞的克隆形成能力

與一定濃度梯度的阿司匹林(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L)孵育后,抑制了SGC7901微球體細(xì)胞的克隆形成能力呈劑量依賴性(P=0.0035),如圖2。

2.3 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細(xì)胞的遷移和侵襲能力

我們發(fā)現(xiàn),與一定濃度梯度的阿司匹林(0、0.2、0.8mmol/L)孵育后,抑制了SGC7901微球體細(xì)胞的縱向遷移和侵襲能力,呈濃度依賴性(P均<0.001)。如圖3。

2.4 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細(xì)胞E2F1和Sox2的蛋白表達(dá)

為了驗(yàn)證阿司匹林對E2F1和Sox2蛋白表達(dá)的影響,我們從經(jīng)阿司匹林孵育后的微球體中提取總蛋白,實(shí)施了western blot,發(fā)現(xiàn)阿司匹林劑量依賴性(0、0.2、0.8mmol/L)下調(diào)了胃癌SGC7901微球體細(xì)胞E2F1和Sox2的蛋白表達(dá),說明阿司匹林通過下調(diào)干性相關(guān)基因抑制了胃癌干細(xì)胞(P<0.001),如圖4。

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,也是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的第三大原因[6]。據(jù)資料顯示[7],胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散與胃癌干細(xì)胞有較為密切的關(guān)系,而干細(xì)胞是一類具有自我更新和增殖分化能力的細(xì)胞。Okumura等[8]研究表明,在人胃癌細(xì)胞株中存在具有干細(xì)胞特性的胃癌細(xì)胞,且這些細(xì)胞在體外無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),可形成球形的細(xì)胞集落,該集落具有干細(xì)胞樣特性。阿司匹林即NSAIDs類藥物,具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓等藥理作用。阿司匹林作為老藥新用的代表,是應(yīng)用最為廣泛的藥物之一。近年來,根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示[9],常規(guī)服用非甾體抗炎藥(NSAIDS)可降低結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。即非甾體抗炎藥對胃腸道類的腫瘤疾病具有潛在的防治效果。Moon等[10]研究表明,阿司匹林可通過抑制Cox-2/PTGS2信號通路,激活體內(nèi)r受體(r-PPAR)的表達(dá),改善抗腫瘤藥物的耐藥性,對結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新起抑制作用。Sox2基因是最基本的干細(xì)胞基因之一,其編碼的Sox2蛋白具有維系胚胎干細(xì)胞的重要作用以及調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新能力[11]。E2F1即腫瘤相關(guān)因子,轉(zhuǎn)錄因子E2F1是E2F家族重要成員之一,它為細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子,可使G1期向S期轉(zhuǎn)變[12]。有資料表明[13],E2F1基因在胃部組織中的表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),但其蛋白表達(dá)與各類臨床病理變化間不存在必要聯(lián)系[14]。本實(shí)驗(yàn)通過采用人胃癌細(xì)胞株SGC7901在僅含上皮生長因子(EGF)和基本成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)為具有胃癌干細(xì)胞特性的微球體,探討不同濃度阿司匹林對人胃癌細(xì)胞株SGC7901微球體的細(xì)胞侵襲及遷移的影響。結(jié)果表明,高濃度阿司匹林對腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲具有抑制作用,且呈劑量相關(guān)性?？瞻捉M與對照組相比,人胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞微球體采用阿司匹林作用后,E2F1和Sox2蛋白的表達(dá)量均有下降,并且E2F1和Sox2基因均作為腫瘤組織中促腫瘤組織發(fā)生、增長的一小部分。由此,可以將E2F1和Sox2蛋白作為胃癌治療中的靶點(diǎn)。