非洲豬瘟疫苗研究現(xiàn)狀

金貴兵 楊 丁 金仕強 鄒仲航 牟燕平 古從偉 楊 倩*

(1 宜賓市敘州區(qū)動物疫病預防控制中心，四川宜賓 644600；2 宜賓市動物疫病預防控制中心，四川宜賓 644000；3 西南醫(yī)科大學實驗動物中心，四川瀘州 646000；）

1921年，非洲豬瘟病毒（ASFV）首次在肯尼亞被報道，隨后經(jīng)西歐、東歐傳入東亞。2018年，非洲豬瘟病毒蔓延到我國，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的損失[1]。從發(fā)現(xiàn)至今，非洲豬瘟已有上百年的流行歷史，為了根除該病毒，人們采用了諸如生物防控、撲殺、隔離等策略，雖然取得了階段性的成功，但在缺乏非洲豬瘟病毒商業(yè)化疫苗的情況下，還是難以控制其蔓延和反復發(fā)生[2]。疫苗接種一直被認為是控制傳染性疾病最有效的方法，通過疫苗接種得到徹底根除的傳染病有天花、牛瘟等[3]。20世紀我國研制的脊髓灰質炎“糖丸”口服減毒活疫苗，就成功控制和消滅了脊髓灰質炎在我國的流行[4,5]。

自20世紀60年代以來，全世界范圍就開始了非洲豬瘟病毒疫苗的開發(fā)與研究，但研究成果一般都處于實驗室階段，距離實際應用還有一定差距。導致非洲豬瘟病毒疫苗開發(fā)滯后的主要因素在于非洲豬瘟病毒復雜的基因組結構和多變的基因型。非洲豬瘟病毒基因組是一個線性且共價封閉的雙鏈DNA 分子，長度在170～190 kbp 之間，可編碼大量的蛋白質參與逃避宿主的防御系統(tǒng)[6]。而且非洲豬瘟病毒基因組結構也不夠穩(wěn)定，常因病毒間的基因重組和基因突變發(fā)生遺傳改變[7]，這無疑加大了非洲豬瘟病毒疫苗的研究難度。截至目前，根據(jù)B646L（p72）基因末端的核苷酸差異，已鑒定出24 種非洲豬瘟病毒的基因型[8]。這24 種基因型在非洲均有流行報道，且主要分布在東非和南非。目前大多數(shù)試驗階段研究的非洲豬瘟病毒疫苗主要針對基因Ⅰ型（歐洲）和基因Ⅱ型（亞洲）流行毒株。從部分研究結果來看，多種疫苗僅對同源毒株感染具有保護作用，因此，不太可能針對其他系統(tǒng)發(fā)育差異較大的毒株提供交叉保護，這也阻礙了疫苗的進一步開發(fā)與利用。此外，疫苗開發(fā)通常還受到接種策略、抗原免疫原性、毒株類型、免疫劑量、攻毒劑量、接種動物個體差異、接種途徑等多種因素影響。因此，非洲豬瘟病毒疫苗的開發(fā)還需要大量的研究來解決以上各種問題。

雖然現(xiàn)在的研究已證實多種類型的疫苗可以對感染非洲豬瘟病毒后提供強保護，但對其保護性免疫的了解和定義還十分有限。本文對現(xiàn)有不同類型的非洲豬瘟病毒疫苗研究現(xiàn)狀進行初步的概述，以期更好地了解該病毒，為非洲豬瘟的預防、控制和根除提供參考。

1 非洲豬瘟病毒滅活疫苗

一直以來，滅活疫苗都是一種較為安全、廉價且成熟的疫苗。因為在滅活過程中，各類物理或化學作用有效消除了病毒向毒性表型的逆轉，使病毒不再具備潛在傳染能力。雖然滅活疫苗具有較高的安全性，但過去的研究表示，針對非洲豬瘟病毒的滅活疫苗無法提供很好的免疫保護，即使聯(lián)合了刺激細胞免疫的佐劑[9]。非洲豬瘟病毒滅活疫苗雖然在某些情況下能夠誘導體液免疫反應，但產(chǎn)生的抗體在感染中很難實現(xiàn)有效的病毒中和[10]，而且非洲豬瘟病毒滅活疫苗通常不會引發(fā)完整的細胞免疫反應。因此，滅活疫苗可能不是開發(fā)有效非洲豬瘟病毒疫苗的可行策略。

2 非洲豬瘟病毒亞單位疫苗

亞單位疫苗是一類不含有核酸的重組蛋白或合成肽疫苗，這些蛋白和肽類通常是能夠誘導保護性免疫反應的特定病毒表位。此類疫苗的關鍵是篩選能夠誘導產(chǎn)生中和抗體的抗原或抗原表位[10]，旨在誘導中和血清學反應。非洲豬瘟病毒編碼多達170 多種蛋白質，其中包括結構蛋白和宿主免疫調節(jié)蛋白，因此，在篩選免疫性較好的抗原蛋白上存在一定難度。目前已經(jīng)評估了幾種非洲豬瘟病毒抗原的保護潛力，包括結構蛋白p54、p30、p72 和血凝素CD2v 等。第一個被證明對非洲豬瘟病毒攻擊具有保護作用的重組病毒蛋白是桿狀病毒表達的非洲豬瘟病毒血凝素（HA）蛋白--CD2v，其產(chǎn)生的中和抗體能抑制病毒對宿主血細胞的吸附和單核細胞的侵染，可部分抵御同源毒株的感染[11,12]。p54、p30 和p72是非洲豬瘟病毒的結構蛋白，均能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，其中針對p72 和p54 的抗體可以阻斷非洲豬瘟病毒的吸附，針對p30 的抗體可以阻斷病毒的內化[13]。桿狀病毒中表達的重組p54 和p30 蛋白單獨使用時，不能保護免疫豬免受非洲豬瘟病毒的攻擊，然而二者同時使用能讓50%的免疫豬抵御非洲豬瘟病毒強毒株E75 的致死性攻擊，而且病毒血癥癥狀出現(xiàn)的時間延遲，癥狀也有所減輕[14]。此外，用桿狀病毒表達的p54/p30 融合蛋白進行免疫，也減輕了非洲豬瘟病毒血癥癥狀，并保護接受免疫的豬免受E75 的攻擊[15]。

Neilan 等[16]采用桿狀病毒表達的p54、p30、p72 和p22 蛋白組合免疫豬時，盡管檢測到高滴度的ASFV 特異性中和抗體，但卻不能抵御毒株Pretoriuskop/96/4（Pr4）的攻擊，說明在非洲豬瘟病毒感染中，抗體介導的免疫反應似乎不能提供足夠的免疫保護。Oura 等[17]的研究證明細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）介導的細胞免疫反應在抵御非洲豬瘟病毒感染方面發(fā)揮著至關重要的作用，表明除了中和抗體外，還需要能夠刺激CTL 的疫苗來抵御非洲豬瘟病毒的感染。

3 非洲豬瘟病毒核酸疫苗

核酸疫苗免疫主要是將DNA 或信使RNA（mRNA）序列遞送進宿主細胞內生成抗原蛋白，模擬疾病抗原刺激免疫應答。核酸疫苗可產(chǎn)生具有翻譯后修飾天然構象的內源性蛋白，并通過MHC Ⅰ類和Ⅱ類復合物進行抗原遞呈，從而激活CD8＋T 和CD4＋T 細胞。因此，與基于抗原蛋白的亞單位疫苗相比，核酸疫苗能夠誘導CTL免疫反應。

2011年，Argilaguet 等[18]構建了表達p54/p30 融合蛋白的質粒DNA（pCMV-PQ），pCMV-PQ 不能在豬體內誘導可檢測的免疫反應，但在小鼠體內可以。為了改善這一狀況，他們將編碼豬白細胞抗原Ⅱ的特異性抗體單鏈可變區(qū)與pCMV-PQ 融合構建pCMV-APCH1PQ。然而，pCMV-APCH1PQ 雖然誘導了廣泛的免疫應答，但卻對非洲豬瘟病毒的攻擊無效，而且還加重免疫豬的病毒血癥癥狀。2012年，Argilaguet 等[19]又構建了表達CD2v/p54/p30 融合蛋白的質粒DNA（pCMV-sHAPQ），發(fā)現(xiàn)pCMV-sHAPQ 能夠在體內誘導特異性的B 細胞和T 細胞反應，但無法提供免疫保護。此后，繼續(xù)在pCMV-sHAPQ 質粒的基礎上融合泛素蛋白，構建了pCMV-UbsHAPQ 質粒，用于靶向體內Ⅰ類抗原呈遞。pCMV-UbsHAPQ 誘導了強烈的CTL 反應，在缺乏特異性抗體的情況下，為超過50%的免疫豬提供了保護，文章作者推測這種保護作用與血液中大量CD2v 特異性CD8+T 細胞相關。

為了篩選更多參與ASFV 保護性免疫的T 細胞靶點抗原，2014年，Lacasta 等[20]基于ASFV 毒株Ba71v，構建了與泛素融合的DNA 表達文庫（ASFVUblib），ASFVUblib 激發(fā)了大量ASFV 特異性CD8＋T 細胞，CD8＋T 細胞在缺乏特異性抗體的情況下，保護了60%的免疫豬免受毒株E75 的致命攻擊。該研究進一步支持了CTL 細胞反應在抗非洲豬瘟病毒中的重要性，同時揭示了多種具有潛在誘導T 細胞反應能力的非洲豬瘟病毒抗原的存在。因此，在隨后的研究中，該實驗室研究者們繼續(xù)篩選和鑒定不同基因型非洲豬瘟病毒的T 細胞靶點抗原[21,22]。

4 非洲豬瘟病毒重組病毒載體疫苗

除了核酸疫苗，病毒載體疫苗也能誘導體液免疫和細胞免疫。通過將目標病毒的免疫原基因導入載體病毒基因組中實現(xiàn)。此外，病毒載體疫苗可以很好地區(qū)分感染動物和接種動物（DIVA），即病毒載體疫苗自身編碼的免疫原可作為疫苗標記。

2013年，Argilaguet 等[23]在BacMam 載體（一種基于桿狀病毒的載體，具有轉染哺乳動物細胞表達靶基因的能力）上導入非洲豬瘟病毒的CD2v/p54/p30 融合基因構建了BacMam-sHAPQ 病毒載體疫苗，Bac-Mam-sHAPQ 可保護2/3 的豬免受同源亞致死性毒株的攻擊，免疫豬的血清中沒有檢測到特異性抗體，保護作用可能與病毒特異性T 細胞反應相關。

通過“雞尾酒”免疫方式，人們評估了病毒載體遞送的多種非洲豬瘟病毒抗原的免疫原性。其中，腺病毒載體遞送的非洲豬瘟病毒抗原混合物（p32、p54、pp62 和p72 抗原，以及A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R 和A104R 抗原），均誘導了特異性抗體和細胞免疫反應[24,25]。改良安卡拉痘病毒載體（MVA）遞送的p72、CD2v 和C- 型凝集素抗原雖然沒有誘導特異性抗體產(chǎn)生，但卻檢測到特異性T細胞反應[26]。隨后Lokhandwala 等[27]將上述非洲豬瘟病毒腺病毒載體疫苗重新組合，測試了其攻毒后的保護效果。在與佐劑BioMize 的組合免疫下，不僅沒有提高免疫保護率，還出現(xiàn)了疾病加重的現(xiàn)象。而與佐劑ZTS-01 組合免疫有較好的存活率，但沒有很好控制臨床癥狀?？傊瑳]有一種抗原產(chǎn)生了具有統(tǒng)計學意義的保護作用。

為了增強免疫保護效果，研究者們又采用了初次免疫和加強免疫的接種策略。Goatley 等[28]克隆了OURT88/3 毒株的B602L、p72、p30、p54、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R 基因，導入腺病毒載體后進行初次免疫，隨后又將以上抗原基因導入MVA載體進行加強免疫，最后獲得100%的同源攻毒保護。

5 非洲豬瘟病毒減毒活疫苗

減毒活疫苗（live-attenuated vaccines,LAVs）大致可分為天然減毒活疫苗、傳統(tǒng)人工減毒活疫苗和人工基因缺失減毒活疫苗。相比于亞單位疫苗和核酸疫苗只能提供部分同源保護，非洲豬瘟病毒減毒活疫苗可以提供完全同源和部分異源感染保護[29]。

5.1 天然減毒活疫苗

天然減毒活疫苗是從自然界中分離到的毒性降低或無紅細胞吸附（non-HAD）能力的自然減毒毒株。NH/P68 和OURT88/3 是非洲豬瘟病毒的2 個天然弱毒株，由葡萄牙科學家分離得到，屬于non-HAD 基因Ⅰ型。早期的研究發(fā)現(xiàn)，NH/P68 接種豬主要表現(xiàn)為非洲豬瘟慢性病變或是無癥狀反應，且這些無癥狀的免疫豬能100%抵抗毒株L60 和Arm07 的攻擊[30]，期間所產(chǎn)生的免疫保護與NK 細胞的活性呈正相關[31]。King 等[32]用OURT88/3 對歐洲家豬進行初次免疫，隨后用同基因型的OURT88/1 加強免疫，發(fā)現(xiàn)85.7%和100%的免疫豬可以免受非洲株Benin 97/1 和Uganda 1965 的攻擊，其中分別有超過78%和50%的豬，在受到Benin 97/1和Uganda 1965 攻擊時，沒有表現(xiàn)出任何病毒血癥的跡象。Mulumba 等[33]用OURT88/3 弱毒株免疫豬后，50%的免疫豬可以抵御OURT88/1（基因型Ⅰ）的攻擊，而且存活下來的免疫豬還能繼續(xù)抵御DRC085/10（基因型Ⅰ）的攻擊。隨后，又有研究者比較了不同劑量和不同接種途徑接種OURT88/3 后的保護情況，結果發(fā)現(xiàn)鼻內接種（100%）比肌肉注射（50%～66%）顯示出更高的保護率[34]。

2017年，人們在拉脫維亞的野豬身上又分離到1 株non-HAD 基因Ⅱ型ASFV 天然弱毒株，命名為Lv17/WB/Rie1[35]。在對抗強毒株Arm07 的致死性感染時，Lv17/WB/Rie1 對野豬的口服免疫保護率達到了92%[36]。2021年，中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所報道了國內non-HAD 低致死率自然變異株，雖然毒力明顯降低，但仍然具有很強的水平傳播能力[37]。總的來說，天然弱毒株不太可能直接作為LAVs 使用，由于殘余毒力，部分豬在一定劑量下接種弱毒株后會出現(xiàn)副反應。通過基因重組技術進一步刪除弱毒株的相關毒力基因可能會提高其作為LAVs 的安全性。

5.2 傳統(tǒng)人工減毒活疫苗

傳統(tǒng)人工減毒活疫苗是病毒在體外細胞系或通過非宿主動物連續(xù)傳代而形成的。20世紀60年代，研究者們就通過細胞傳代的方式進行了ASF 減毒活疫苗的研制。早期的這些研究已經(jīng)證實非洲豬瘟病毒可以在豬骨髓細胞、Vero 細胞、豬腎細胞（PK-2a）等傳代細胞系上繁殖，而且連續(xù)傳代后的毒株接種豬時，臨床癥狀大大減輕并能不同程度抵御強毒株的攻擊[38]。1960年，西班牙和葡萄牙大范圍使用非洲豬瘟病毒弱毒活疫苗（豬骨髓細胞上連續(xù)傳代所得）進行田間試驗，結果導致了免疫失敗事件，動物出現(xiàn)肺炎、流產(chǎn)和死亡等不良反應[39]。這也表明非洲豬瘟病毒細胞傳代致弱毒株雖然是疫苗研究的一個重要方向，但是依然存在很多不確定性，其安全性和有效性還很難得到保障。

通過一系列研究發(fā)現(xiàn)，增加傳代次數(shù)雖然降低了病毒毒力，但也容易導致病毒的免疫原性降低，而且受不同毒株和細胞系的影響，也很難摸索到合適的傳代次數(shù)進行后續(xù)的動物免疫試驗，因而非洲豬瘟病毒細胞傳代致弱毒株的研制具有一定的盲目性和隨機性，很難預判其攻毒后的免疫保護效果。2015年，Krug 等[40]將非洲豬瘟病毒格魯吉亞株（ASFV-G）在Vero 細胞中連續(xù)傳代110 次，發(fā)現(xiàn)毒力完全消失，接種家豬后無任何臨床反應，但攻毒后卻發(fā)現(xiàn)沒有任何免疫保護作用。同樣，Balysheva 等[41]將Stavropol 01/08 強毒株分別在A4C2細胞、CV 細胞和豬腎細胞（PSGK-60）上連續(xù)傳代，結果發(fā)現(xiàn)A4C2 細胞的第14 代毒和PSGK-60 細胞的第20 代毒毒力依然很強，接種豬全部死亡。A4C2 細胞的第24/33 代毒和CV 細胞的第20 代毒毒力明細減弱，接種豬全部存活，但接種后的豬無法抵御強毒株的攻擊。

比起疫苗研制，細胞傳代致弱毒株在基因組功能和致病機理研究等方面發(fā)揮了更大的作用。Krug 等[40]通過對ASFV-G 細胞傳代致弱毒株突變基因區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)ASFV-G 在Vero 細胞上連續(xù)傳60 代后，其I177L基因第42 位脯氨酸變成絲氨酸。傳至110 代時，M1249L 基因第471 位的Arg 變成Gln，CP2475L 基因第200 位的Glu 變成Gly。這不僅能很好地了解突變基因與病毒毒力和免疫原性的相關性，對基因缺失減毒活疫苗的研制也更具有指導意義。

5.3 人工基因缺失減毒活疫苗

人工基因缺失減毒活疫苗是通過敲除病毒的某些毒力基因而形成的。早期研究較多的與非洲豬瘟病毒毒力和感染宿主范圍相關基因有TK、MGF505、MGF360、CD2v（EP402R）、9GL（B119L）、NL（DP71L）等[42]。在這些基因中，TK 和9GL 可以通過調控宿主的蛋白去磷酸化酶1α 來阻止宿主細胞蛋白合成的關閉，TK 和9GL 基因缺失的非洲豬瘟病毒在豬巨噬細胞中無法正常復制[43,44]。MGF505/360 基因能抑制宿主I 型IFN 應答，該類基因的缺失不僅會降低非洲豬瘟病毒的毒力，還能抑制其體外復制[45]。敲除這些基因不僅可以降低非洲豬瘟病毒的致病性，還能誘導針對同源非洲豬瘟病毒感染的保護性反應[46,48]。

除了誘導同源保護外，非洲豬瘟病毒基因缺失減毒活疫苗還具有良好的免疫交叉保護。缺失CD2v 基因的非洲豬瘟病毒毒株BA71ΔCD2，不僅對親本株BA71 的致命攻擊具有保護作用，而且對異源毒株E75（基因Ⅰ型）和Georgia 2007/1（基因Ⅱ型）也具有100%保護作用，且大部分豬沒有表現(xiàn)出非洲豬瘟病毒感染癥狀，這也是基因缺失減毒活疫苗抵抗異源非洲豬瘟病毒毒株的首次報道[49]。在隨后的擴展研究中，Lopez 等[50]繼續(xù)深入探究了BA71ΔCD2 的交叉免疫保護，采用106PFU 劑量的 BA71ΔCD2 免疫豬后，用毒株RSA/11/2017（基因XIX 型）和Ken06.Bus（基因Ⅸ型）進行攻擊，分別有83.3%和33.3%的免疫豬存活。BA71ΔCD2 的加強免疫可以使抗Ken06.Bus 的保護率提高至50%，存活下來的豬有輕微的非洲豬瘟臨床癥狀。如果用BA71ΔCD2 進行初次免疫，BA71 進行加強免疫，則可獲得100%的抗Ken06.Bus 保護率，所有豬幾乎不表現(xiàn)非洲豬瘟的任何臨床癥狀。該研究結果證實，交叉保護可能是一種多因素現(xiàn)象，不僅取決于基因序列相似性。

雖然非洲豬瘟病毒基因缺失減毒活疫苗與其他類型的疫苗相比具有很好的免疫交叉保護，但非洲豬瘟病毒的基因修飾結果同樣不可預測。首先，不同非洲豬瘟病毒毒株即使缺失相同的基因，產(chǎn)生的致病性和誘導的免疫保護效果可能不同。例如，毒株BA71 缺失CD2v 基因后，毒力降低，并誘導了很好的免疫交叉保護。而同樣缺失了CD2v 基因的Georgia2010（基因Ⅱ型）致死性卻與親本無異[51]。毒株E70 缺失DP71L 基因后毒力明顯下降，所有接種動物均未出現(xiàn)死亡。而毒株Malawi Lil-20/1（Mal）在缺失DP71L 基因后，致死率仍高達100%[52,53]。馬拉維毒株和格魯吉亞毒株在缺失TK 基因后均表現(xiàn)出減毒，但只有馬拉維毒株誘導了免疫豬的保護反應[54,55]。其次，某些天然弱毒株在刪除特定毒力基因后，其免疫保護率會明顯降低。從OURT88/3 中刪除DP71L 和DP96R 基因后，毒力雖然減弱，但是保護效力降為原來的66%[56]。同樣，從NH/P68 中刪除A238L或是EP153R 基因后，無法再抵抗異源毒株Arm07 的攻擊[30]。此外，為了提高LAVs 的安全性，研究者試圖通過多重基因缺失來完全去除非洲豬瘟病毒的毒力。發(fā)現(xiàn)Georgia 2007 毒株除了缺失9GL 和UK 基因的ASFV-G-Δ9GL/ΔUK[48]毒株外，其他缺失多個基因毒株均不具備誘導保護性反應的能力[57-59]。這些研究證實，基因缺失誘發(fā)的免疫保護在很大程度上受毒株特異性的影響。

2020年，中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所以我國第1 株非洲豬瘟病毒分離株Pig/HLJ/2018 為骨架，利用DNA 同源重組技術，通過刪除7 種不同蛋白質的基因片段構建的非洲豬瘟病毒弱毒活疫苗HLJ/18-7GD，對家豬（包括懷孕母豬）具有最好的安全性和有效性[60]。該疫苗可能是目前國內最具備實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用的疫苗。同年，Borca 等[61]通過刪除非洲豬瘟病毒Georgia 2007 毒株的一個未知基因I177L，構建的ASFV-G-ΔI177L 可以100%保護家豬免受親本株感染，該疫苗既可以肌肉注射也可以經(jīng)口鼻給藥[62]，同時還開發(fā)了能夠大規(guī)模生產(chǎn)的衍生株ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR，該衍生株具有同樣的免疫原特性和保護效力[63]。后續(xù)的試驗還證明ASFV-G-ΔI177L 能抵抗越南強毒株TTKN/ASFV/DN/2019的致死攻擊[64]。于是，2022年，越南農業(yè)和農村發(fā)展部批準了ASFV-G-ΔI177L 在越南的上市，但其實際應用效果和安全穩(wěn)定性還有待長期觀察考證。

6 結語

綜上所述，疫苗接種是控制非洲豬瘟的一種有效策略。不同種類的疫苗存在其各自的優(yōu)勢，但也顯示出不足。滅活疫苗雖然具有制作簡單、安全性高等特點，但卻無法保護豬免受非洲豬瘟病毒的侵害。亞單位疫苗能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生體液免疫，誘導產(chǎn)生中和抗體，但針對非洲豬瘟病毒感染產(chǎn)生的保護性免疫并不理想。多項研究指證細胞免疫，尤其是細胞毒性CD8+T 細胞，才是宿主抵抗非洲豬瘟病毒感染的關鍵。核酸疫苗和病毒載體疫苗的優(yōu)勢在于能夠很好地誘導體液免疫反應和細胞免疫反應，但試驗階段呈現(xiàn)出的免疫保護還有待進一步提高。從目前的研究來看，非洲豬瘟病毒重組減毒活疫苗免疫保護效果相對較好，但其也存在病毒返強、疫苗生物脫落、慢性感染等系列安全性問題。近期已有多個非洲豬瘟病毒弱毒疫苗獲得了專利認證，并進入臨床測試。這給非洲豬瘟商業(yè)化疫苗的誕生提供了希望，希望這些疫苗在經(jīng)過長期的臨床試驗和優(yōu)化改良后能克服一系列安全和生產(chǎn)問題成功上市。