剩余污泥熱堿脫水過程中胞內(nèi)外抗生素抗性基因豐度變化分析*

姚鵬城 尤愛菊

(浙江省水利河口研究院(浙江省海洋規(guī)劃設(shè)計研究院),浙江 杭州 310020)

剩余污泥是污水處理系統(tǒng)中生物處理單元的副產(chǎn)物[1],據(jù)統(tǒng)計,2019年中國城市剩余污泥產(chǎn)量達(dá)到4 000萬t[2]。剩余污泥中通常含有大量的有毒有害物質(zhì)以及抗生素抗性基因(ARGs),如果不進(jìn)行妥善處理,將對環(huán)境造成直接或間接影響。目前,剩余污泥的處理主要分為兩大類:處置(填埋、焚燒)和再利用(土壤修復(fù))。而污泥脫水是剩余污泥處理中關(guān)鍵的一環(huán),污泥的含水率需要降低至60%以下[3]。經(jīng)污水處理系統(tǒng)中污泥脫水機(jī)處理后的剩余污泥,其含水率高達(dá)80%,無法滿足填埋要求,需要進(jìn)行進(jìn)一步處理。

研究表明,熱堿預(yù)處理(TAP)能夠有效提高污泥脫水率[4]。與其他高溫預(yù)處理技術(shù)相比,TAP可以有效規(guī)避操作風(fēng)險,并且其能源需求更少,據(jù)研究報道,高溫和堿性條件能夠產(chǎn)生協(xié)同作用,促進(jìn)污泥脫水率的提升[5]196。CAMPO等[6]對加熱、熱堿等污泥減量技術(shù)進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在堿性、90 ℃條件下,其污泥脫水率達(dá)到32%。ZHENG等[7]通過低溫?zé)釅A處理剩余污泥,污泥脫水率增加至44.17%。剩余污泥有效脫水的關(guān)鍵限制因素為胞外聚合物(EPS)和細(xì)胞壁[8],TAP能夠有效破壞細(xì)胞壁,溶解EPS,釋放細(xì)胞內(nèi)與EPS結(jié)合的水分[5]200。

然而,處理后的剩余污泥濾液中,有毒有害物質(zhì)增加,特別是ARGs,這可能對污水處理系統(tǒng)生物單元和周邊生態(tài)環(huán)境造成潛在風(fēng)險。ARGs作為一種新興污染物,受到公眾的重點(diǎn)關(guān)注[9]。同時,intI 1作為ARGs水平轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì),與環(huán)境中ARGs豐度呈現(xiàn)較高正相關(guān)[10]。intI 1通過其特有的3個關(guān)鍵部分(整合酶基因、重組位點(diǎn)和啟動子)[11],可以編碼抗生素耐藥性,實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移[12]。由于污泥脫水后的濾液中殘留著大量胞外ARGs(eARGs)和intI 1,通過基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制可在微生物群落中迅速擴(kuò)散[13]。污泥脫水產(chǎn)生的濾液將會回流至生物單元或外溢至環(huán)境中,導(dǎo)致ARGs的傳播擴(kuò)散,給微生物或環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)帶來巨大的風(fēng)險。然而,目前剩余污泥脫水產(chǎn)生的濾液對ARGs傳播風(fēng)險鮮有關(guān)注。

本研究選擇環(huán)境中廣泛存在的tetA、tetC、sulⅠ、sulⅡ、ermB、dfrA1和dfrA13這7種ARGs及intI 1作為研究對象。探究剩余污泥經(jīng)過TAP后,其脫水率、胞內(nèi)ARGs(iARGs)和eARGs豐度變化趨勢,并采用響應(yīng)曲面法(RSM)高效準(zhǔn)確地達(dá)到參數(shù)優(yōu)化效果,確定TAP最佳工況條件。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

剩余污泥取自北京某中水回用系統(tǒng),其生物處理單元為缺氧—MBR工藝,日處理量為1 500 m3/d。缺氧池和MBR膜池水力停留時間分別為3、7 h,污泥質(zhì)量濃度為9.2～11.2 g/L。污泥樣本儲存于預(yù)先清洗的鋁盒中,立刻運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 含水率測定

將定量濾紙放于烘箱中烘至恒重并稱質(zhì)量,記為m1,取質(zhì)量為m的污泥樣品,經(jīng)過分液漏斗進(jìn)行固液分離,將濾水后的污泥連同定量濾紙在105 ℃干燥2 h,直至污泥保持恒重,質(zhì)量為m2。污泥的含水率(ω,%)計算參照式(1)。

(1)

式中:m1、m2和m的單位均為g。

污泥破壁率(D,%)計算參照文獻(xiàn)[14],見式(2)。

(2)

式中:ρS1、ρS0、ρT分別為污泥中TAP后可溶性COD(SCOD)、初始SCOD、總COD質(zhì)量濃度,mg/L。

1.3 胞內(nèi)和胞外脫氧核糖核酸(DNA)提取及ARGs檢測

為了能夠更全面、準(zhǔn)確地分析ARGs變化趨勢,將所有預(yù)處理前后樣品進(jìn)行iARGs、eARGs提取。胞內(nèi)DNA提取:樣品通過0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾,截留足夠的細(xì)胞,保證成功提取DNA。通過PowerSoil DNA分離試劑盒提取樣品DNA,并使用NanoDrop 2000超微量紫外—可見分光光度計檢測提取DNA的濃度。

本研究中胞外DNA主要通過沉淀法[15]提取,方法如下:將樣品置于4 ℃取上清液,將上清液通過0.22 μm濾膜去除殘留固體和細(xì)胞。取330 mL已過濾溶液加入至726 mL無水乙醇和33 mL 3 mol/L醋酸鈉溶液的混合溶液中,將混合溶液置于-20 ℃ 12 h以上,將沉淀后的溶液置于1 000 r/min離心10 min,去除上清液,并風(fēng)干10 min,干燥后按照PowerSoil DNA分離試劑盒提取樣品DNA,并檢測DNA濃度。

本研究中,采用SYBR Green Ⅰ法,借助Bio-Rad CFX96熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)儀檢測目標(biāo)ARGs和intI 1,使用的引物如表1所示,反應(yīng)過程可分為預(yù)變、變性、退火和延伸4個部分。20 μL qPCR混合溶液包括10 μL SYBR Premix Ex Taq、2 μL 模板DNA、7.2 μL雙蒸水和0.4 μL上下游引物。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以10倍梯度稀釋獲得[16],本研究中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均超過0.99,放大效率為85%～110%。所有qPCR分析樣本均重復(fù)3次。

表1 目標(biāo)ARGs與intI 1的引物片段序列Table 1 Premiers sequences of target ARGs and intI 1

1.4 RSM試驗(yàn)設(shè)計與數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用RSM中的Box-Behnken設(shè)計(BBD)方法對工藝進(jìn)行優(yōu)化。由于RSM試驗(yàn)存在擬合誤差,本研究采用方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行評估,研究各參數(shù)對響應(yīng)的影響,驗(yàn)證模型的顯著性。在試驗(yàn)設(shè)計中,選取3個影響因子作為TAP的變量,以污泥脫水率(Y,%)為響應(yīng)值,試驗(yàn)過程中,自變量范圍和水平如表2所示。

表2 試驗(yàn)自變量的范圍和水平Table 2 Experimental range and level of the process independent variables

1.5 ARGs去除效率

取污泥上清液,在不同熱堿條件下,進(jìn)行ARGs去除效率(r,%)檢測,計算公式如式(3)所示。

(3)

式中:n0、n1分別為反應(yīng)前、后ARGs濃度(單位為拷貝數(shù)/mL)的常用對數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TAP的脫水率與工藝優(yōu)化

2.1.1 方差分析

TAP三因素三水平BBD試驗(yàn)和預(yù)測結(jié)果如表3所示,TAP污泥脫水率與其試驗(yàn)條件密切相關(guān),試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測結(jié)果較吻合。預(yù)測模型(見式(4))的決定系數(shù)為0.982 3,p<0.000 1,即98.23%的脫水率變化可以通過方程的自變量解釋;變異系數(shù)僅為1.78%,說明模型和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高;此外,模型的失擬系數(shù)小,p=0.441 3,也說明模型準(zhǔn)確。反應(yīng)時間系數(shù)、溫度系數(shù)、pH與溫度的相互作用系數(shù)以及溫度的二次系數(shù)均滿足p<0.05,說明脫水率可以通過pH、溫度和反應(yīng)時間等變量進(jìn)行表達(dá)。

表3 TAP的BBD試驗(yàn)與預(yù)測結(jié)果Table 3 Experimental design and results of TAP

(4)

2.1.2 TAP最優(yōu)條件分析

如圖1所示,污泥脫水率與溫度、pH之間呈現(xiàn)出明顯的交互作用。當(dāng)pH為11,溫度從70 ℃升高至90 ℃時,脫水率從29.91%提高到40.53%。溫度保持90 ℃,隨著污泥溶液pH從10增加至11,脫水率從31.97%緩慢增加至40.26%,并且隨著pH繼續(xù)升高,脫水率反而呈現(xiàn)下降趨勢。此外,污泥脫水率隨著反應(yīng)時間的不斷增加而增加。最終,通過RSM,得到TAP反應(yīng)時間為80 min時,最佳工藝參數(shù)為pH=11.2,溫度88 ℃,其脫水率高達(dá)40.71%。實(shí)際操作中,考慮到便捷性,取pH=11,溫度為90 ℃。

注:反應(yīng)時間為80 min。圖1 溫度、pH與污泥脫水率的變化關(guān)系三維響應(yīng)曲面Fig.1 Three-dimensional response surface plot of dewatering efficiency,temperature and pH

污泥中的水分主要包括胞內(nèi)水和EPS結(jié)合水,細(xì)胞壁中磷脂的正磷酸鹽鍵易在堿性、高溫條件下被破壞[17],細(xì)胞壁的分解加速,將胞內(nèi)水轉(zhuǎn)化為胞外水[18]。本文結(jié)果與前人研究結(jié)果一致,即熱堿結(jié)合工藝的脫水率顯著高于單純熱處理[19]。

2.2 污泥脫水后ARGs的變化趨勢

TAP可以使污泥中的細(xì)胞破裂,將胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為胞外物質(zhì),增加了濾液中的有機(jī)物含量。未預(yù)處理污泥的SCOD為120 mg/L,總COD為8 230 mg/L。在pH=11、溫度為90 ℃條件下,污泥經(jīng)過TAP后,隨著反應(yīng)時間的增加,SCOD大體不斷上升(見圖2),總COD基本保持穩(wěn)定,略有下降。在反應(yīng)至100 min時,SCOD已增加至3 320 mg/L,總COD為7 680 mg/L。

圖2 TAP污泥SCOD與污泥破壁率、脫水率的關(guān)系Fig.2 The relationship between changes of SCOD and cracking efficiency,dewatering efficiency for sludge after TAP

污泥濾液中的SCOD可以一定程度反映污泥細(xì)胞的破壁程度。污泥在TAP反應(yīng)開始至80 min內(nèi),污泥脫水率與破壁率均上升,且污泥脫水率達(dá)到最高值(41.0%),因此最優(yōu)TAP工況為pH=11、溫度90 ℃,反應(yīng)時間80 min;反應(yīng)至80～100 min,污泥脫水率下降,破壁率上升。研究表明,TAP有助于SCOD的溶解,是一種有效的污泥脫水技術(shù)[5]198-199。反應(yīng)初期,在高溫、強(qiáng)堿作用下,胞內(nèi)水由于細(xì)胞壁破裂釋放至胞外,該階段脫水率與細(xì)胞破壁率呈正相關(guān);隨著細(xì)胞壁不斷破裂,大量胞內(nèi)有機(jī)物轉(zhuǎn)化為EPS,EPS與胞外水結(jié)合,導(dǎo)致脫水率降低。本研究也證實(shí)過度破壁對污泥脫水效果反而不佳,高濃度EPS將會影響脫水率[20]。

圖3 經(jīng)過TAP后污泥中iARGs、eARGs、intI 1和16S rDNA絕對豐度分布變化Fig.3 The trend of absolute abundance of iARGs,eARGs,intI 1,and 16S rDNA in sludge after TAP

表4 ARGs和intI 1、16S rDNA的相關(guān)性分析1)Table 4 Correlation analysis between ARGs and intI 1,16S rDNA

從圖4可以看出,隨著污泥破壁率的不斷上升,eARGs的絕對豐度先升高后降低最終趨于穩(wěn)定,這可能與微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,胞內(nèi)DNA釋放有關(guān)[21]7。TAP進(jìn)行40 min后,eARGs絕對豐度達(dá)到最高值。污泥經(jīng)過TAP后,部分iARGs轉(zhuǎn)化為eARGs,將增加ARGs的水平轉(zhuǎn)移風(fēng)險。TAP通過破壁方式產(chǎn)生大量eARGs和EPS,EPS的存在一定程度上也會導(dǎo)致eARGs去除效率不佳[22]。

圖4 eARGs絕對豐度與污泥破壁率變化趨勢Fig.4 The trend of absolute abundance of eARGs and sludge cracking efficiency

3 結(jié) 論

TAP具有良好的脫水率,在最優(yōu)工況下(pH=11、溫度為90 ℃,反應(yīng)時間為80 min),其污泥脫水率高達(dá)41.0%,顯著提高了污泥脫水率。隨著污泥破壁率的上升,SCOD濃度也不斷增大,但污泥脫水率先升高后降低。TAP去除iARGs和胞內(nèi)intI 1的同時,eARGs和胞外intI 1的絕對豐度均呈現(xiàn)不同程度上升。eARGs絕對豐度隨著污泥破壁率升高,先升高后降低最終趨于穩(wěn)定。