2-脫氧葡萄糖修飾共載siPD-L1及替莫唑胺脂質(zhì)納米粒的腦靶向性研究

羅靜遠(yuǎn)，楊 靜，李 雪，周四元，劉道洲

(空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)與藥事管理學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的腦部原發(fā)性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的35%～61%[1-2]。GBM侵襲能力強(qiáng)，在周圍正常腦組織浸潤生長，導(dǎo)致GBM組織與周圍正常腦組織無明顯界限，具有病死率高、復(fù)發(fā)率高及治愈率低等特點(diǎn)[3-4]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是第二代口服烷化劑，是目前治療GBM最有效的化療藥物[5-6]。TMZ本身沒有直接的抗GBM活性，只有水解為5-(3-甲基-三嗪-1-基)咪唑-4-甲酰胺[5-(3-methyltriazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide，MTIC]后，才能發(fā)揮抗GBM作用。TMZ在血液循環(huán)中極易水解為MTIC，但是MTIC幾乎不能通過血腦屏障[7-8]。另據(jù)報(bào)道，GBM細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡蛋白-配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)高表達(dá)，與T細(xì)胞上程序性細(xì)胞死亡蛋白1結(jié)合后，能夠抑制T細(xì)胞激活并減少T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，使GBM細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷，促進(jìn)GBM的生長[9-10]。因此，當(dāng)采用特定序列的PD-L1特異的siRNA(siPD-L1)抑制GBM細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，就能夠增強(qiáng)機(jī)體自身免疫系統(tǒng)對(duì)GBM的殺滅，與TMZ發(fā)揮協(xié)同作用。但是siPD-L1在血液循環(huán)中不穩(wěn)定[11-12]。因此，提高TMZ和siPD-L1在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，增加它們?cè)谀X內(nèi)的蓄積，是TMZ和siPD-L1發(fā)揮協(xié)同作用的關(guān)鍵。

腦組織需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)維持正常的生理功能，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的各類轉(zhuǎn)運(yùn)體可以介導(dǎo)這些營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦組織[13-14]。研究顯示，在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面大約存在30種不同營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，用來運(yùn)送糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦組織。因此，直接將藥物制成氨基酸和糖的類似物，或在納米粒表面修飾氨基酸或糖類，就可以在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體的介導(dǎo)下穿過血腦屏障，到達(dá)病灶部位，實(shí)現(xiàn)藥物的腦內(nèi)靶向遞送[15-16]。基于此，我們采用2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)修飾脂質(zhì)納米粒，共載siPD-L1和TMZ，以期提高siPD-L1和TMZ在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性及其在腦組織的分布，提高siPD-L1和TMZ治療GBM的效果[17]。本文通過研究2-DG修飾共載siPD-L1及TMZ脂質(zhì)納米粒(TMZ/siPD-L1@GLPN)給藥后，TMZ在血漿中的消除動(dòng)力學(xué)以及在小鼠腦內(nèi)的分布動(dòng)力學(xué)，旨在闡明2-DG修飾對(duì)脂質(zhì)納米粒腦靶向性的影響，為腦靶向遞藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平(AL104型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC，2695/2996，美國Waters公司)；活體成像儀(Caliper IVIS Lumina Ⅱ，美國Caliper Life Sciences公司)；摩爾超純水機(jī)(1810D型，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)；低溫離心機(jī)(5427R型，德國Eppendorf公司)；恒溫磁力攪拌器(GL-325B型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 膽固醇、TMZ(Lot：FCB055744)、二油酰磷脂酰乙醇胺(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)等購自北京百靈威科技有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺購于上海炎怡生物技術(shù)有限公司；siPD-L1購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；PBS緩沖液、色譜甲醇、色譜乙腈、冰乙酸、2-DG等購自西安科昊生物工程有限責(zé)任公司；2-DG-PEG-DSPE、聚天冬氨酸-g-聚乙烯亞胺(PASP-g-PEI1800)由本課題組自行合成。TMZ/siPD-L1@GLPN和TMZ/siPD-L1@LPN的制備方法如下：取siPD-L1(330 μg)溶于2 880 μL HEPES(10 mmol/L，pH=7.4)緩沖溶液中，獲得濃度為8.7 μmol/L的siPD-L1溶液；稱取2 mg PASP-g-PEI1800連接物，溶于1 mL HEPES(10 mmol/L，pH=7.4)緩沖溶液中，配制成濃度為4.5 μmol/L的PASP-g-PEI1800溶液。取配制好的siPD-L1和PASP-g-PEI1800溶液各125 μL，混勻，渦旋30 s，室溫放置30 min，制備氮磷比(N/P)為9的siPD-L1聚合物納米粒(siPD-L1@PASP-g-PEI1800)。稱取DOPE 31.6 mg、膽固醇5.4 mg、2-DG-PEG-DSPE 21.0 mg，加入2 mL氯仿/甲醇(V/V=3∶1)的混合溶液，溶解后35 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除氯仿/甲醇溶液，使其形成均勻薄膜。將N/P=9的siPD-L1@PASP-g-PEI1800(2 mL，包含siPD-L1 50 μg)以及飽和TMZ水溶液(2 mL)加入到脂質(zhì)薄膜中，室溫下攪拌過夜，超聲1 min，隨即將脂質(zhì)納米粒轉(zhuǎn)移到截留Mr為1 000的透析袋中，在蒸餾水中透析2 h，每0.5 h更換一次蒸餾水，于-80 ℃冰箱中放置24 h，冷凍干燥24 h，即得共載siPD-L1與TMZ的脂質(zhì)納米粒TMZ/siPD-L1@GLPN固體粉末。采用PEG-DSPE制備沒有2-DG修飾的脂質(zhì)納米粒TMZ/siPD-L1@LPN。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理要求，并通過空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：KY20194106)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma)，檢測波長為329 nm，流動(dòng)相為甲醇/水(1 mL/L醋酸溶液)=20/80(V/V)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為室溫。

1.2.2 小鼠血漿及組織樣品的處理 ①血漿樣品的處理：小鼠尾靜脈注射給藥后，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)摘除眼球取全血，并加入肝素鈉抗凝，于室溫條件下5 000g離心5 min，吸取上清液300 μL，加入到2 mL離心管中，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋30 s后，于12 000g、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，取10 μL注入HPLC系統(tǒng)，測定血漿樣品中TMZ的濃度。②組織樣品的處理：小鼠尾靜脈注射給藥后，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，獲取小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎等器官組織，稱取組織質(zhì)量，向每個(gè)組織中加入1 mL生理鹽水(肝臟加入2 mL)，勻漿后取勻漿液500 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋30 s后，于12 000g、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，取10 μL注入HPLC系統(tǒng)，測定組織樣品中TMZ的濃度，最終計(jì)算出每克組織中TMZ的含量。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 獲取小鼠的空白血漿及腦組織勻漿液，加入一定量的TMZ溶液，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和腦組織勻漿液樣品，按“1.2.1”液相條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取TMZ 30 mg，充分溶解后加入到50 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線。吸取不同體積的上述TMZ溶液，加入蒸餾水稀釋成5、10、50、100、200、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取900 μL空白血漿及各組織勻漿液，加入TMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，渦旋30 s，配制成濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的含藥血漿、腦、心、肝、脾、肺及腎組織勻漿液，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和各組織勻漿液樣品，按“1.2.1”液相條件進(jìn)樣，獲取峰面積，以峰面積(Y)作為縱坐標(biāo)，TMZ濃度(X)作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液中檢測TMZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 量取TMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白血漿、腦、心、肝、脾、肺及腎組織勻漿液，渦旋30 s，配制成濃度分別為2、11、40 mg/L的含藥樣品，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和組織樣品，按“1.2.1”液相條件進(jìn)樣，獲取峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算TMZ濃度。1 d內(nèi)間隔相同時(shí)間后，重復(fù)上述操作3次，計(jì)算方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d在相同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)上述操作，計(jì)算方法的日間精密度。

1.2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 量取TMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白血漿、腦、心、肝、脾、肺及腎組織勻漿液，渦旋30 s，配制成濃度分別為2、11、40 mg/L的含藥樣品，按照“1.2.2”方法處理血漿及各組織勻漿液樣品，按“1.2.1”液相條件進(jìn)樣，獲取峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TMZ濃度，計(jì)算分析方法的回收率。

1.2.4 血漿及組織樣品中TMZ含量測定 將小鼠分成3組，分別尾靜脈注射游離TMZ、TMZ/siPD-L1@GLPN及TMZ/siPD-L1@LPN，每組中TMZ的給藥劑量均為50 mg/kg，于給藥后1、5、15、30 min及1、2、4、8、12、24 h，摘除眼球取小鼠全血，并加入肝素鈉抗凝，處死小鼠后獲取腦、心、肝、脾、肺、腎，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和組織樣品，按“1.2.1”液相條件進(jìn)樣，獲取峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求取各時(shí)間點(diǎn)血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎內(nèi)的TMZ含量。

1.2.5 活體成像觀察脂質(zhì)納米粒在正常體內(nèi)的分布 取正常小鼠，尾靜脈注射Cy7.5標(biāo)記的TMZ/siPD-L1@GLPN以及Cy7.5標(biāo)記的TMZ/siPD-L1@LPN，在12、24 h后，用異氟烷麻醉小鼠，采用活體成像儀觀察脂質(zhì)納米粒在小鼠體內(nèi)的分布。

2 結(jié)果

2.1 TMZ檢測的HPLC方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的色譜條件下，TMZ的保留時(shí)間約為4.3 min，血漿以及腦勻漿液基質(zhì)對(duì)TMZ的測定無干擾，提示建立的HPLC方法專屬性良好(圖1)。

A：含TMZ血漿；B：含TMZ腦組織勻漿液。TMZ：替莫唑胺。圖1 血漿以及腦組織勻漿液中TMZ的高效液相色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)峰面積，以峰面積(Y)作為縱坐標(biāo)，TMZ濃度(X)作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液中檢測TMZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，峰面積與TMZ濃度之間線性關(guān)系良好(表1)。

表1 血漿及不同組織勻漿液中TMZ檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測高、中、低3個(gè)TMZ濃度，其日內(nèi)精密度以及日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，表明測定方法精密度良好，符合新藥臨床前研究要求(表2)。

表2 HPLC測定血漿及不同組織勻漿液中TMZ的日內(nèi)精密度和日間精密度(n=3)

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測高、中、低3個(gè)TMZ濃度的回收率大于98%，小于103%，RSD均小于5%，符合新藥臨床前研究要求，能夠用于TMZ含量測定(表3)。

表3 HPLC測定血漿及不同組織勻漿液中TMZ的回收率(n=3)

2.2 血漿及組織樣品中TMZ含量測定

TMZ在小鼠體內(nèi)血藥濃度隨時(shí)間變化的曲線顯示，相較于游離TMZ，小鼠尾靜脈注射TMZ/siPD-L1@GLPN和TMZ/siPD-L1@LPN后，TMZ的消除速度明顯減慢，TMZ在血液中的循環(huán)時(shí)間顯著延長(圖2)。

TMZ：替莫唑胺；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡蛋白-配體1；siPD-L1：PD-L1特異的圖2 尾靜脈注射TMZ、TMZ/siPD-L1@GLPN和TMZ/siPD-L1@LPN后，小鼠血漿中TMZ濃度時(shí)間變化曲線

給予游離TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN和TMZ/siPD-L1@GLPN后，TMZ在小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎等組織內(nèi)的分布結(jié)果顯示，小鼠靜脈注射游離TMZ后，TMZ能夠迅速分布于腦組織；小鼠靜脈注射TMZ/siPD-L1@LPN和TMZ/siPD-L1@GLPN后，TMZ進(jìn)入腦組織的速度減慢；與游離TMZ和TMZ/siPD-L1@LPN相比，TMZ/siPD-L1@GLPN能顯著提高TMZ在腦組織內(nèi)的蓄積。尾靜脈注射TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN和TMZ/siPD-L1@GLPN后，血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎等組織中TMZ濃度-時(shí)間曲線下面積(area under the curve，AUC)如表4所示，與游離TMZ相比，TMZ/siPD-L1@GLPN能夠顯著提高TMZ在血漿及腦組織內(nèi)的AUC，且效果顯著優(yōu)于TMZ/siPD-L1@LPN。以上結(jié)果表明TMZ/siPD-L1@GLPN能夠增加TMZ在血液中的循環(huán)時(shí)間，增加TMZ在腦組織內(nèi)的分布及滯留。

表4 小鼠尾靜脈注射TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN及TMZ/siPD-L1@GLPN后TMZ在各組織內(nèi)的AUC

2.3 活體成像儀觀察脂質(zhì)納米粒在正常體內(nèi)的分布

取正常小鼠，尾靜脈注射Cy7.5標(biāo)記的TMZ/siPD-L1@GLPN以及Cy7.5標(biāo)記的TMZ/siPD-L1@LPN，在12、24 h后，異氟烷麻醉小鼠，采用活體成像儀觀察脂質(zhì)納米粒在小鼠體內(nèi)的分布。結(jié)果顯示，TMZ/siPD-L1@LPN幾乎不能穿過血腦屏障，在12 h和24 h時(shí)，僅有很少量的脂質(zhì)納米粒在腦組織內(nèi)蓄積；而TMZ/siPD-L1@GLPN在腦組織內(nèi)的蓄積明顯增多，在12 h時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到6.83×107，且24 h后，在腦部仍舊能觀察到TMZ/siPD-L1@GLPN在腦組織內(nèi)的蓄積，熒光強(qiáng)度為2.35×107(圖3)。小鼠被處死后，將腦、心、肝、脾、肺、腎等器官組織取出，活體成像儀觀察納米粒在小鼠各器官組織的蓄積。結(jié)果顯示，TMZ/siPD-L1@GLPN在腦組織內(nèi)能夠大量蓄積，蓄積量顯著高于TMZ/siPD-L1@LPN給藥組(P<0.01，圖4)。以上結(jié)果表明，TMZ/siPD-L1@GLPN不僅能高效跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，而且能夠在腦組織中滯留較長時(shí)間。

A：TMZ/siPD-L1@GLPN及TMZ/siPD-L1@LPN在小鼠體內(nèi)分布的活體成像觀察結(jié)果；B：腦組織內(nèi)平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。TMZ：替莫唑胺；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡蛋白-配體1；siPD-L1：PD-L1特異的圖3 TMZ/siPD-L1@GLPN及TMZ/siPD-L1@LPN在正常小鼠體內(nèi)的分布

3 討論

TMZ是目前治療GBM最為有效的化療藥物，但是TMZ在血液循環(huán)中極易水解為MTIC，MTIC幾乎不能通過血腦屏障，從而極大地降低了TMZ在腦內(nèi)的蓄積。本研究以2-DG-PEG-DSPE、膽固醇及DOPE等構(gòu)成的脂質(zhì)薄膜為外層殼，采用前期合成的新型陽離子聚合物PASP-g-PEI1800壓縮siPD-L1，采用薄膜分散法將siPD-L1及TMZ共同負(fù)載在脂質(zhì)納米粒TMZ/siPD-L1@GLPN中。研究結(jié)果顯示，相較于游離TMZ，TMZ/siPD-L1@LPN及TMZ/siPD-L1@GLPN均可以降低TMZ的水解，從而減慢TMZ在體內(nèi)的清除，顯著提升TMZ在血液中的循環(huán)時(shí)間。

研究顯示，DOPE是一種常用的助磷脂，在制備陽離子脂質(zhì)體過程中具有很強(qiáng)的協(xié)同作用。DOPE能夠干擾類脂膜，降低內(nèi)涵體膜的穩(wěn)定性，并增加脂質(zhì)納米粒與質(zhì)膜的融合，從而使脂質(zhì)納米粒從內(nèi)涵體逃逸[18]。前期研究結(jié)果顯示，TMZ/siPD-L1@GLPN能夠從溶酶體高效逃逸，將包裹在脂質(zhì)納米粒內(nèi)的藥物釋放到細(xì)胞漿內(nèi)[17]。由于血腦屏障的存在，大多數(shù)藥物難以進(jìn)入到腦組織[19-20]。我們前期研究結(jié)果顯示，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1高表達(dá)[17]，因此，HPLC及活體成像儀檢測結(jié)果顯示，相較于TMZ/siPD-L1@LPN，TMZ/siPD-L1@GLPN在小鼠腦組織內(nèi)蓄積及滯留時(shí)間顯著延長，表明2-DG修飾可以顯著增加脂質(zhì)納米粒的腦靶向性，從而更好地發(fā)揮抗GBM活性。