RPA-毛細(xì)管電泳檢測(cè)人腺病毒55型的方法建立及初步應(yīng)用

袁若棟，董陽(yáng)超，武福星，段 甜，薛 潘，張 劍，袁明城，薛智豐，張海軍，張欠欠，雷迎峰，高小朋

(1延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000；2空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

腺病毒主要有A～G 7個(gè)血清學(xué)組，是導(dǎo)致人呼吸道感染的重要病原體。人腺病毒(human adenovirus，HAdV)現(xiàn)有100多個(gè)亞型，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸系統(tǒng)疾病、腸胃炎和結(jié)膜炎，在低免疫功能患者中，可能會(huì)導(dǎo)致呼吸衰竭，出現(xiàn)彌漫性感染、血性膀胱炎，引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至?xí)?dǎo)致死亡[1]。HAdV55屬于B血清組，是HAdV11和HAdV14的重組體，我國(guó)最早從2006年陜西省岐山縣暴發(fā)的疫情中分離獲得[2]。HAdV55主要通過(guò)飛沫傳播，感染后易出現(xiàn)急性呼吸道感染癥狀，例如發(fā)熱、咳嗽、頭痛、咽喉腫痛、支氣管炎、肺炎、肝炎等，可發(fā)展成為重癥肺炎[3]。HAdV的主要易感人群是嬰兒、學(xué)生、新兵和免疫功能低下的患者[4-5]。目前臨床上尚無(wú)針對(duì)腺病毒的特異治療藥物，多采用對(duì)癥治療。因此，早期診斷是HAdV55型防控的重點(diǎn)。

目前關(guān)于HAdV55的檢測(cè)方法，主要包括病毒分離培養(yǎng)、鼻黏膜上皮脫落細(xì)胞直接免疫熒光檢測(cè)病毒抗原、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方法[6]。前三種方法過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，不適合早期診斷，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等分子生物學(xué)方法具有快速靈敏等優(yōu)勢(shì)，在臨床檢測(cè)中備受青睞[7]。但現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測(cè)方法還只是基于Hexon基因部分序列進(jìn)行分子分型的做法，主要是對(duì)各類臨床樣本進(jìn)行核酸提取，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，采用PCR進(jìn)行檢測(cè)，雖然市面上也已出現(xiàn)大量呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒，但無(wú)特異性針對(duì)HAdV55的檢測(cè)試劑盒。而傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)特異性引物對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，包括巢式PCR、探針?lè)ê腿玖戏▽?shí)時(shí)熒光定量PCR等，這些技術(shù)具有高靈敏度、高特異性，技術(shù)較為成熟，適合早期臨床診斷，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、試劑成本、工作人員的技術(shù)要求高?；诨蛐酒突驕y(cè)序技術(shù)在腺病毒檢測(cè)方面也有報(bào)道[8-10]，LI等[11]就采用了可獲得更高的序列準(zhǔn)確性的高通量測(cè)序：將納米孔測(cè)序技術(shù)和華大基因平臺(tái)應(yīng)用于2019年5月中國(guó)湖北省HAdV55暴發(fā)的鑒定和基因組分析，但這兩種主要適用于復(fù)雜感染情況下的鑒別診斷，且技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度低，尚未在臨床診斷HAdV55中廣泛應(yīng)用[12]。重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)是一種可以替代傳統(tǒng)的PCR核酸探測(cè)技術(shù)，即在單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶的參與下，利用重組酶進(jìn)行恒溫核酸擴(kuò)增。該技術(shù)能夠在15 min內(nèi)進(jìn)行常溫條件下的單分子核酸檢測(cè)[13]。毛細(xì)管電泳技術(shù)與核酸擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合使用已經(jīng)在多種病原體檢測(cè)中顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[14]。

本研究以HAdV55為研究對(duì)象，利用RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，針對(duì)Hexon基因篩選特異高效的RPA引物，建立了快速、特異檢測(cè)HAdV55的RPA-毛細(xì)管電泳的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原樣本和臨床樣本 本試驗(yàn)所使用的臨床常見(jiàn)的呼吸道病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品，包括人冠狀病毒(human coronavirus，HCoV；HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1)、甲型和乙型流感病毒(influenza A/B virus，F(xiàn)luA/B)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、腺病毒(HAdV3、HAdV4、HAdV7、HAdV16、HAdV21、HAdV55)，均保存于本實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)中使用的咽拭子樣本來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科。

1.1.2 主要試劑和儀器 Epoch酶標(biāo)儀、質(zhì)粒小提試劑盒、病毒DNA提取純化試劑盒采購(gòu)于天根生化科技有限公司，TwistAmpTM試劑盒購(gòu)自南京沃博生物科技有限公司，多槽擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州柏恒科技有限公司，QlAxcel毛細(xì)管電泳儀購(gòu)自凱杰生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)HAdV55-Hexon保守部分基因序列，利用SnapGene軟件，設(shè)計(jì)RPA引物，交由擎科生物工程股份有限公司合成。

1.2.2HAdV55-Hexon質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站搜索到的HAdV55的Hexon基因序列，位于腺病毒全基因組的19 000 bp附近，長(zhǎng)度為2 874 bp，合成HAdV55的Hexon基因，在基因兩端加入EcoR Ⅰ &SalⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)EcoR Ⅰ和SalⅠ雙切后與經(jīng)EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙切pCAGGS載體連接，即獲得HAdV55-Hexon質(zhì)粒。

1.2.3 病毒DNA提取 按照TIANGEN磁珠法提取病毒DNA試劑盒的操作說(shuō)明，從臨床HAdV55患者的咽拭子中提取病毒DNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RPA反應(yīng)體系和條件 本反應(yīng)使用TwistAmpTM試劑。將RPA凍干酶粉反應(yīng)管置于冰上，加入溶解性緩沖液29.5 μL、上下游引物(10 mol/L)各2.4 μL、核酸模板13.2 μL(模板量不低于1 000 copies/mL)等能充分混合均勻，并加入280 mmol/L的醋酸鎂溶液2.5 μL，共50 μL。在把上述反應(yīng)液分配好后，立即放入恒溫?cái)U(kuò)增儀，并選取39 ℃的反應(yīng)溫度和20 min的反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳分析 選擇高分辨率卡夾(SKC105102)。Alignment Marker選擇MA1(C109100)，Size Marker選擇MA2(C109200)，樣本注入電壓4 kV 10 s，分離壓6 kV 330 s(最佳分辨率2～4 bp)。將RPA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，操作過(guò)程按照設(shè)備說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6 引物篩選 根據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原則，比對(duì)了常見(jiàn)腺病毒的Hexon區(qū)域，針對(duì)HAdV55-Hexon基因的保守區(qū)[15]，設(shè)計(jì)四對(duì)長(zhǎng)度不同引物，擴(kuò)增位置位于HAdV55-Hexon基因的1 211～1 329 bp處。擴(kuò)增長(zhǎng)度約為118 bp，以HAdV55-Hexon質(zhì)粒為模板，分組進(jìn)行RPA檢測(cè)，篩選較優(yōu)引物組合(表1)。

表1 靶向HAdV55-Hexon基因的RPA擴(kuò)增引物核苷酸序列

1.2.7 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用上述篩選最優(yōu)的引物建立的RPA-毛細(xì)管電泳的方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的HAdV3、HAdV4、HAdV7、HAdV16、HAdV21、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、FluA/B、PIV、RSV等標(biāo)準(zhǔn)品核酸模板進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)RPA-毛細(xì)管電泳進(jìn)行特異檢測(cè)，采用HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照。

1.2.8 靈敏度試驗(yàn) 將HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10-10～10-4的7個(gè)梯度作為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，每管反應(yīng)體系取20 μL進(jìn)行毛細(xì)管電泳，由此可以判斷這種方法的最低檢測(cè)極限。同時(shí)，參照張然等[16]建立的AdV實(shí)時(shí)熒光PCR算法，對(duì)兩種方法的靈敏度進(jìn)行了平行檢測(cè)。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 選取HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品3個(gè)稀釋梯度(10-3、10-2、10-1)作為模板，利用已建立的RPA-毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)和分析。

1.2.10 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的方法對(duì)來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院HAdV55患者的咽拭子樣品進(jìn)行測(cè)試，設(shè)置HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O作為陰性對(duì)照，同時(shí)采用張然等[16]建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法測(cè)試，比對(duì)分析兩種方法的一致性。

2 結(jié)果

2.1 HAdV55-Hexon質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

Hexon基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR Ⅰ和SalⅠ雙切后與同樣雙切的pCAGGS載體連接，獲得HAdV55-Hexon質(zhì)粒，PCR鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)酶切分析，并由擎科生物工程有限公司合成并測(cè)序，電泳結(jié)果顯示，經(jīng)雙切的質(zhì)粒，Hexon約為2 874 bp，載體大小約為5 000 bp，未經(jīng)雙切的質(zhì)粒大小約為7 874 bp，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。

M：Marker標(biāo)準(zhǔn)品；1：經(jīng)雙酶切的HAdV55-Hexon質(zhì)粒，目的片段大小；2：未經(jīng)酶切的HAdV55-Hexon質(zhì)粒。圖1 HAdV55-Hexon質(zhì)粒鑒定的電泳分析

2.2 引物的篩選

選擇稀釋度10-10～10-4的7個(gè)HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別使用不同引物進(jìn)行RPA-毛細(xì)管電泳。結(jié)果表明，引物F2-R2擴(kuò)增效率最高，產(chǎn)生非特異性條帶最少，其他三對(duì)引物條帶擴(kuò)增不穩(wěn)定，出現(xiàn)非特異性條帶(圖2)。

A：用引物F1-R1擴(kuò)增稀釋度為10-10～10-4的HAdV55-Hexon的陽(yáng)性質(zhì)粒，條帶大小在118 bp附近，與目的條帶大小均一致，但條帶之間差異性較大；B：用引物F2-R2擴(kuò)增稀釋度為10-10～10-4的HAdV55-Hexon的陽(yáng)性質(zhì)粒，條帶均在118 bp附近，與目的條帶大小均一致，條帶之間bp差值很??；C～D：用引物F3-R3、F4-R4擴(kuò)增稀釋度為10-10～10-4的HAdV55-Hexon的陽(yáng)性質(zhì)粒，條帶與目的條帶大小均不相符，出現(xiàn)大量引物二聚體。NC：陰性對(duì)照。圖2 F1-R1、F2-R2、F3-R3、F4-R4擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管凝膠成像圖

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

以未稀釋的HAdV55-Hexon質(zhì)粒、HAdV55質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和常見(jiàn)HAdV3、HAdV4、HAdV7、HAdV16、HAdV21、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、FluA/B、PIV、RSV的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用建立的RPA聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法擴(kuò)增及檢測(cè)。結(jié)果顯示，HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和HAdV55質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)了典型的目的條帶，目的片段大小與預(yù)期相符；其他呼吸道病原核酸樣本和空白對(duì)照均未出現(xiàn)與目的大小相符的條帶(圖3)。表明本方法特異性較強(qiáng)，能準(zhǔn)確檢測(cè)到HAdV55，與其他病原核酸無(wú)交叉反應(yīng)，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。

以HAdV3、HAdV4、HAdV7、HAdV16、HAdV21、HCoV-229e、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、FluA/B、RSV、PIV、HAdV55、HAdV55-Hexon標(biāo)準(zhǔn)品為擴(kuò)增對(duì)象，無(wú)酶水為陰性對(duì)照，應(yīng)用建立的RPA聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法擴(kuò)增及檢測(cè)。NC：陰性對(duì)照；PC：陽(yáng)性對(duì)照；RPA：重組酶聚合酶擴(kuò)增。圖3 特異性實(shí)驗(yàn)測(cè)定試驗(yàn)的電泳凝膠成像圖譜

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)中HAdV55-Hexon陽(yáng)控質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為2.9×1011copies/mL，由拷貝數(shù)的計(jì)算方法(6.02×1023copies/mol)×(質(zhì)粒濃度g/mL)/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660 g/mol)將質(zhì)粒的質(zhì)量轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)(copies/mL)。選擇HAdV55-Hexon標(biāo)準(zhǔn)品7個(gè)稀釋度10-10～10-4作為模板，使用建立的RPA聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，HAdV55-Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋度為10-8時(shí)檢測(cè)仍有目的條帶檢出，對(duì)應(yīng)最低檢測(cè)濃度為2.9×103copies/mL(圖4A～B)。同時(shí)，使用張然等[16]建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法開(kāi)展檢測(cè)，結(jié)果顯示，HAdV55-Hexon標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋度為10-9、Cq<33時(shí)，熒光強(qiáng)度仍然超過(guò)閾值，可認(rèn)為有目的基因檢出，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為2.9×102copies/mL。雖然本研究建立的RPA-毛細(xì)管電泳方法比實(shí)時(shí)熒光定量PCR法低1個(gè)數(shù)量級(jí)的靈敏度，但由于RPA-毛細(xì)管電泳技術(shù)有其優(yōu)勢(shì)，全程只需要30 min即可完成，且不需要大規(guī)模設(shè)備，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間不會(huì)超過(guò)熒光實(shí)時(shí)PCR時(shí)間的1/3，因而檢測(cè)效率較高。

A：電泳凝膠成像圖譜；B：靈敏度實(shí)驗(yàn)毛細(xì)管電泳信號(hào)圖譜。PC：陽(yáng)性對(duì)照；NC：陰性對(duì)照。圖4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將濃度為2.9×1011copies/mL的HAdV55-Hexon質(zhì)粒進(jìn)行10-3、10-2、10-1梯度稀釋后分別用RPA法重復(fù)檢測(cè)3次，部分條帶出現(xiàn)不一致的情況推測(cè)為反應(yīng)體系存在不穩(wěn)定情況，但差值很小，均可得到相應(yīng)目的條帶，相同模板檢測(cè)結(jié)果基本一致，能表明本方法重復(fù)性能夠滿足檢測(cè)需要(圖5)。

A：毛細(xì)管電泳凝膠成像圖；B：毛細(xì)管電泳信號(hào)圖譜：毛細(xì)管電泳的信號(hào)圖譜縱坐標(biāo)表示DNA吸光值，橫坐標(biāo)為條帶大小，反映出在稀釋度10-3、10-2、10-1均有條帶檢出，且與目的條帶大小基本一致，第二泳道出現(xiàn)條帶大小不穩(wěn)定以及雜帶是由于電泳儀對(duì)齊標(biāo)記物的降解。NC：陰性對(duì)照。圖5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.6 臨床樣品檢測(cè)

采用建立的RT-RPA方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)來(lái)自于西京醫(yī)院檢驗(yàn)科的18份滅活臨床HAdV55型患者咽拭子臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別以HAdV55-Hexon質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，HAdV55有18份陽(yáng)性核酸出現(xiàn)典型擴(kuò)增，11號(hào)樣本可能由于病毒滴度很低，提取的病毒核酸很少，條帶不明顯，但通過(guò)表格和信號(hào)圖譜可以證明是有擴(kuò)增的，以HAdV55陽(yáng)控質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照，結(jié)果與實(shí)時(shí)熒量PCR法相符合(圖6)。對(duì)未感染HAd55健康人類咽拭子進(jìn)行建立的RPA-毛細(xì)管電泳與實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)，結(jié)果顯示均無(wú)檢出，證明實(shí)時(shí)熒光PCR與建立的RT-RPA方法相符合。

A～B：臨床18份樣本對(duì)應(yīng)的毛細(xì)管電泳凝膠成像和信號(hào)圖譜，對(duì)臨床18份臨床HAdV55型患者咽拭子采用建立的RPA方法檢測(cè)，凝膠成像的條帶和信號(hào)圖譜的信號(hào)反映出的與目的條帶大小均一致，可認(rèn)為有HAdV55檢出；C：對(duì)8份未感染HAdV55的健康人類咽拭子進(jìn)行建立的RPA-毛細(xì)管電泳檢測(cè)，均無(wú)檢出；D：對(duì)臨床18份HAdV55型患者咽拭子采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)的Cq值和信號(hào)圖譜，Cq<33時(shí)，均有熒光信號(hào)，可認(rèn)為均有HAdV55檢出；E：對(duì)8份未感染HAdV55的健康人類咽拭子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)，均無(wú)檢出。RFU：相對(duì)熒光單位；NC：陰性對(duì)照；PC：陽(yáng)性對(duì)照。圖6 臨床18份樣本對(duì)應(yīng)的毛細(xì)管電泳凝膠成像、信號(hào)圖譜及實(shí)時(shí)熒光PCR Cq值和信號(hào)圖譜

3 討論

RPA是一種在恒溫條件下，通過(guò)引物與目的片段相結(jié)合即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)新技術(shù)[17]。在反應(yīng)體系中加入目的片段及引物，可一步快速擴(kuò)增DNA模板，總反應(yīng)時(shí)間不超過(guò)15 min。結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，可以直接在毛細(xì)管電泳儀中直接讀取檢測(cè)結(jié)果。本研究建立一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的基于RPA-毛細(xì)管電泳檢測(cè)HAdV55方法，最低檢出限為2.9×103copies/mL，整個(gè)過(guò)程30 min即可完成。目前，RPA引物的設(shè)計(jì)尚無(wú)專門的程序[18]，引物設(shè)計(jì)主要遵循以下原則[19]：5′末端3～5個(gè)核苷酸避免聚鳥(niǎo)嘌呤，最好是胞嘧啶，能促進(jìn)重組；3′末端3個(gè)核苷酸為G或C有助于聚合酶的穩(wěn)定性，而不要出現(xiàn)聚嘌呤和嘧啶；GC含量在30%～70%之間避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等；靶標(biāo)區(qū)域應(yīng)避開(kāi)重復(fù)元件等。引物篩選的條件最好盡量模擬實(shí)際檢測(cè)時(shí)的條件，例如模板的拷貝數(shù)、樣本純度等盡可能與實(shí)際樣本類似。本研究對(duì)引物和探針的組合進(jìn)行了試驗(yàn)篩選，建立了HAdV55 RPA聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法。結(jié)果顯示，本研究建立的RPA聯(lián)合毛細(xì)管電泳與常見(jiàn)呼吸道病毒核酸檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)，且操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)；靈敏度比實(shí)時(shí)熒光定量PCR稍低，可檢測(cè)HAdV55陽(yáng)性核酸的最低拷貝數(shù)為2.9×103copies/mL。但熒光定量PCR必須經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟，同時(shí)PCR核酸擴(kuò)增儀本質(zhì)上是控制溫度升降的設(shè)備，而RPA反應(yīng)的最適合溫度在37～42 ℃之間，可在常溫下進(jìn)行，無(wú)需變性。這無(wú)疑能大大加快檢測(cè)的速度。對(duì)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物不僅可以進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，還可以對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，甚至可以通過(guò)側(cè)流層試紙條讀取結(jié)果[20]。RPA檢測(cè)靈敏度高，可擴(kuò)增痕量核酸(特別是DNA)模板至可檢測(cè)程度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。本文所建立的HAdV55RPA-毛細(xì)管電泳方法比張然等[16]建立的熒量定量PCR法要低1個(gè)數(shù)量級(jí)，可能由于RPA擴(kuò)增體系中的蛋白酶干擾。本文所建立的實(shí)時(shí)RPA聯(lián)合毛細(xì)管電泳法，其反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單，易于快速檢測(cè)，無(wú)需復(fù)雜儀器和設(shè)備，反應(yīng)時(shí)間短，不超過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR的1/3，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明這種方式具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

綜上所述，本研究建立的檢測(cè)HAdV55 RPA檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)靈敏，結(jié)果可靠，只依賴于毛細(xì)管電泳儀，為HAdV55感染的早期檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。