Pink1通過調(diào)控Drp1參與高氨誘導(dǎo)線粒體異常分裂的機制研究

拜云虎，王全暉，岳 瑋，謝 峻，吳菲菲，王亞云，楊雁靈，張春旭

(1解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450007；2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽胰脾外科，陜西 西安 710032；解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院：3全科醫(yī)學(xué)科，4檢驗輸血科，河南 鄭州 450007；5空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)實驗中心，陜西 西安 710032)

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是由急性或慢性肝病或門體分流引起的腦功能障礙[1]。在全球范圍內(nèi)，慢性肝病約影響8.44億人，每年造成約200萬人死亡，其中100萬人與肝硬化及其并發(fā)癥有關(guān)，而HE發(fā)生率占肝硬化患者的30%～40%[2]。血液循環(huán)中氨含量的升高被認(rèn)為是肝硬化患者HE的一個關(guān)鍵致病因素[3-4]。因此，降低血氨水平是改善HE的重要措施，也是當(dāng)前治療HE的主要手段之一。目前對于高氨損傷中樞神經(jīng)的具體機制仍然不清楚，因此，進一步研究其相關(guān)機制為臨床提供潛在的藥物靶點具有重要意義。

氨是在氨基酸分解代謝、嘌呤分解和腸道微生物代謝等生物過程中產(chǎn)生的一種細(xì)胞毒性代謝物。既往大量研究表明高氨導(dǎo)致線粒體氧化功能障礙、ATP合成減少、自由基生成增加等[5-6]。但目前鮮有關(guān)于高氨狀態(tài)時線粒體形態(tài)的變化與自噬之間關(guān)系的報道。由于腦組織對能量需求較高，腦內(nèi)富含線粒體，且線粒體參與調(diào)節(jié)各種重要的細(xì)胞過程，包括代謝、ATP生成和炎癥激活。線粒體形態(tài)的變化會隨著細(xì)胞環(huán)境的變化而發(fā)生分裂或融合，線粒體分裂和融合的平衡對腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[7]。線粒體通過不斷的分裂和融合，改變自身的形狀、大小和數(shù)量，以滿足細(xì)胞的代謝需求[8]。盡管線粒體分裂對腦內(nèi)神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的功能性吞噬很重要，但過度的線粒體分裂會導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，包括缺血-再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病帕金森病和阿爾茨海默病。線粒體自噬蛋白Pink1是清除受損線粒體的重要蛋白之一，而過度的自噬也會損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體功能形態(tài)的異常。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在肝損傷誘導(dǎo)的HE中，腦組織內(nèi)線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1以及自噬蛋白Pink1表達增多[9-10]，但是體外高氨狀態(tài)與線粒體形態(tài)之間的關(guān)系及機制仍然不清楚。本研究旨在探討高氨誘導(dǎo)線粒體異常分裂和功能障礙的分子機制以及Pink1對線粒體裂變的調(diào)節(jié)作用。假設(shè)高氨誘導(dǎo)線粒體自噬Pink1以及分裂蛋白Drp1表達增多，線粒體出現(xiàn)碎片化和功能障礙，而減少Pink1表達可減緩高氨誘導(dǎo)的線粒體功能障礙的進展。本研究為高氨誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷提供了可能的分子機制，為治療高氨血癥或HE提供理論依據(jù)和潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SHSY5Y細(xì)胞購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。CCK-8試劑盒(CA1210)購自北京索萊寶生物科技有限公司；增強型ATP檢測試劑盒(50027)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Pink1的慢病毒購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。抗體：Pink1(ab23707，Abcam，英國)，Parkin(PA5-13399，Invitrogen，美國)，Drp1(9570S，CST，英國)，β-actin(Abclonal，中國)；免疫熒光以及Western blotting二抗均購自Abbkine生物有限公司(中國)。NH4Cl(213330，Sigma，美國)。F-12培養(yǎng)基(C11765500BT，Gibco，美國)，MEM培養(yǎng)基(C11095500BT，Gibco，美國)，F(xiàn)BS(10099-141，Gibco，美國)。慢病毒pCLenti-U6-shRNA(Pink1)-CMV-Puro-WPRE購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SHSY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 將SHSY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基配置為：420 mL/L MEM+420 mL/L F-12+150 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗，在37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達到80%時傳至6孔板或96孔板中用于后續(xù)實驗。

1.2.2 NH4Cl處理 高氨模型的制備方法：SH-SY5Y細(xì)胞配成1×108/L細(xì)胞懸液，接種于96孔板，待貼壁后，給予以培養(yǎng)基為溶液配置后的不同濃度(1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)的NH4Cl(紫外消毒，過濾)，Sham組內(nèi)加入不含NH4Cl的培養(yǎng)基，余均相同，之后分別在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24、48 h，待做后續(xù)處理。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞凋亡-Hoechst檢測試劑盒購自碧云天(C0003，中國)，SH-SY5Y細(xì)胞接種于12孔板，待貼壁后，給予以培養(yǎng)基為溶液配置后的不同濃度(0、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)的NH4Cl，Sham組內(nèi)加入不含NH4Cl的培養(yǎng)基，余均相同，之后分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，加入0.25 mL固定液，固定10 min，使用PBS清洗3次，加入0.25 mL Hoechst染色液，染色5 min，隨后使用PBS清洗3次，加入熒光封片劑于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 感染慢病毒 將SH-SY5Y細(xì)胞配成2×108/L細(xì)胞懸液，細(xì)胞按30%匯合度接種到12孔板。每孔鋪1 mL，12 h細(xì)胞貼壁后感染慢病毒。感染12～20 h后換培養(yǎng)基，每孔加入1 mL新鮮的培養(yǎng)基。72 h后共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.5 CCK-8檢測 在96孔板中配置100 μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞量為1×108/L)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(在37 ℃，50 mL/L CO2的條件下)；細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液為不同濃度的NH4Cl培養(yǎng)基，濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L；分別孵育24、48 h后更換培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液；加入CCK-8后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定A450 nm值。

1.2.6 蛋白水平檢測 提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法蛋白定量、SDS-PAGE電泳后，孵育多克隆兔抗Drp1(1∶1 000)，兔抗Pink1(1∶1 000)，兔抗Parkin(1∶1 000)，鼠抗β-actin(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育；第2日孵育相應(yīng)二抗(1∶5 000)，加入ECL液發(fā)光檢測并拍照保存數(shù)據(jù)。以β-actin為內(nèi)參進行半定量分析。

1.2.7 免疫熒光染色 固定細(xì)胞，進行封閉后，孵育多克隆兔抗Drp1(1∶200)，兔抗Pink1(1∶250)，4 ℃過夜孵育；孵育相對應(yīng)的種屬二抗(1∶500)，加染DAPI后封片，在共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.8 透射電鏡分析 細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染后，進行固定電鏡制樣，在JEM-1200EX型透射電鏡80 kV下觀察。觀察指標(biāo)：①單位面積線粒體分布密度；②單位面積線粒體數(shù)量；③單位面積線粒體平均面積。

1.2.9 線粒體ATP指標(biāo)檢測 按照生廠商說明書，將細(xì)胞裂解勻漿，檢測ATP的含量。詳見碧云天操作試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 高氨導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低

我們將SHSY5Y細(xì)胞分別用0、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L NH4Cl處理24～48 h后進行觀察。首先，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示隨著NH4Cl濃度的升高細(xì)胞出現(xiàn)破碎，相同濃度下NH4Cl處理時間越長細(xì)胞破碎則越明顯(圖1A)。用CCK-8進行細(xì)胞活性檢測，在NH4Cl作用24 h時，同Sham組(0 mmol/L NH4Cl)進行比較，細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，5.0 mmol/L NH4Cl處理細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)核致密濃染的凋亡現(xiàn)象，在10.0 mmol/L時凋亡程度進一步增加(圖1B)。在10.0 mmol/L NH4Cl處理24 h狀態(tài)下細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05，圖1C)，而在48 h時則顯示在較低濃度1 mmol/L的NH4Cl狀態(tài)下細(xì)胞活性同樣顯著降低(P<0.01，圖1C)。以上結(jié)果表明細(xì)胞活性與氨的濃度以及作用時間明顯相關(guān)。為了進一步觀察氨在未誘導(dǎo)細(xì)胞活性降低以前是否對線粒體功能和形態(tài)產(chǎn)生影響，因此本研究根據(jù)實驗結(jié)果選擇氨濃度5.0 mmol/L的NH4Cl處理細(xì)胞24 h作為處理條件。

A：不同濃度NH4Cl處理24、48 h對細(xì)胞形態(tài)的作用(標(biāo)尺為100 μm)；B：不同濃度NH4Cl處理24 h對細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst染色，標(biāo)尺為25 μm)；C：不同濃度NH4Cl處理24、48 h對細(xì)胞增殖能力的影響。Sham：0 mmol/L NH4Cl。aP<0.05，bP<0.01 vs Sham。圖1 不同濃度和時間的高氨處理對細(xì)胞的影響

2.2 氨誘導(dǎo)線粒體相關(guān)自噬表達增多

為了觀察高氨對細(xì)胞線粒體自噬的影響，我們觀察了高氨誘導(dǎo)后的線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1/Parkin蛋白表達變化。實驗分Sham組(0 mmol/L NH4Cl組)和NH4Cl組(經(jīng)5.0 mmol/L NH4Cl處理組)。5.0 mmol/L的NH4Cl處理24 h后提取細(xì)胞蛋白進行Western blotting和免疫熒光觀察表達變化。Western blotting結(jié)果顯示，高氨誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1/Parkin表達增加，與Sham組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，P<0.01，圖2A～B)。進一步使用免疫熒光染色顯示，NH4Cl組Pink1表達水平明顯高于Sham組(P<0.01，圖2C)。以上結(jié)果顯示NH4Cl顯著增加細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬蛋白Pink1/Parkin的表達。

A：蛋白印跡顯示5.0 mmol/L NH4Cl處理24 h誘導(dǎo)自噬蛋白Pink1-Parkin表達；B：Western blotting分析高氨誘導(dǎo)自噬蛋白Pink1-Parkin結(jié)果；C：免疫熒光觀察高氨誘導(dǎo)Pink1表達(標(biāo)尺為25 μm)；Sham：0 mmol/L NH4Cl；NH4Cl：5.0 mmol/L NH4Cl。aP<0.05，bP<0.01 vs Sham。圖2 氨誘導(dǎo)線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1的結(jié)果

2.3 敲除Pink1可減少氨誘導(dǎo)的Drp1增多

為了闡明Pink1對線粒體裂變是否有影響，我們進一步構(gòu)建慢病毒pCLenti-U6-shRNA(Pink1)-CMV-Puro-WPRE轉(zhuǎn)染氨誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，觀察其對線粒體動力學(xué)蛋白Drp1的影響。實驗分為3組：Sham+Pink1NC組(0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理)、NH4Cl+Pink1NC組(5.0 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒組)、NH4Cl+Pink1KD組(5.0 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾組)。首先通過免疫熒光染色驗證病毒表達效果良好(圖3A)。用免疫熒光染色觀察Drp1在高氨時表達增加，而敲除Pink1后熒光表達減弱(圖3B)。進一步行Western blotting的結(jié)果顯示，與Sham+Pink1NC組相比，高氨誘導(dǎo)線粒體Drp1表達增加(P<0.01)，而敲除Pink1后則Drp1表達減少(P<0.05，圖3C)。以上結(jié)果顯示高氨顯著增加細(xì)胞內(nèi)Drp1表達，敲除Pink1后則會減少Drp1。

A：敲除Pink1(Pink1KD)的免疫熒光染色(標(biāo)尺為25 μm)；B：免疫熒光觀察Pink1KD對Drp1的影響(標(biāo)尺為25 μm)；C：Western blotting及分析結(jié)果觀察Pink1KD對Drp1的影響。Sham+Pink1NC：0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理；NH4Cl+Pink1NC：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒；NH4Cl+Pink1KD：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾。aP<0.05 vs NH4Cl+Pink1NC，bP<0.01 vs Sham+Pink1NC。圖3 敲除Pink1對線粒體動力相關(guān)蛋白Drp1的影響

2.4 敲除Pink1改善高氨誘導(dǎo)線粒體碎片化樣變

線粒體動力相關(guān)蛋白Drp1增加往往表示線粒體分裂能力增強，提示線粒體可能碎片化樣變。那么，高氨誘導(dǎo)后線粒體是否存在碎片化樣變以及敲除Pink1之后是否對線粒體碎片化具有緩解作用，為了闡明此問題，本研究分別取Sham+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1KD組進行電鏡觀察線粒體數(shù)目以及分布情況。結(jié)果顯示，與Sham+Pink1NC組相比，NH4Cl+Pink1NC組細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目明顯增加，且線粒體內(nèi)膜中的空泡樣變明顯增多，而敲除Pink1后線粒體碎片化樣變被緩解(圖4A)。進一步對單位面積內(nèi)的線粒體數(shù)量進行分析，顯示減少線粒體內(nèi)Pink1誘導(dǎo)的自噬可緩解高氨相關(guān)的線粒體數(shù)目增加(P<0.05，圖4B)；對線粒體的平均面積分析提示高氨誘導(dǎo)線粒體平均面積減少(P<0.01)，而對線粒體覆蓋率無明顯影響，敲除Pink1減少線粒體平均密度(P<0.05)，但對線粒體平均面積和線粒體覆蓋率均無明顯影響(圖4B)。結(jié)果提示Pink1介導(dǎo)并參與高氨誘導(dǎo)的Drp1增加所導(dǎo)致的線粒體分裂。

A：電鏡下SHSY-5Y細(xì)胞中線粒體的形態(tài)(標(biāo)尺為500 nm)；B：Sham+Pink1NC、NH4Cl+Pink1NC和NH4Cl +Pink1KD誘導(dǎo)的SHSY-5Y細(xì)胞中線粒體平均面積、線粒體平均密度、線粒體平均覆蓋率。Sham+Pink1NC：0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理；NH4Cl+Pink1NC：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒；NH4Cl+Pink1KD：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾。aP<0.05 vs NH4Cl+Pink1NC，bP<0.01 vs Sham+Pink1NC。圖4 減少Pink1可改善氨誘導(dǎo)線粒體碎片化

2.5 敲除Pink1可改善高氨誘導(dǎo)線粒體ATP合成功能障礙

為了闡明Pink1調(diào)控線粒體分裂后是否對線粒體合成ATP功能有影響，我們分別在Sham+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1KD組中檢測了線粒體合成ATP的功能。檢測結(jié)果顯示：高氨導(dǎo)致細(xì)胞ATP合成功能減退，與NH4Cl+Pink1NC相比顯著降低(P<0.01)，而給予Pink1KD后則可以明顯恢復(fù)線粒體的ATP合成功能，與高氨誘導(dǎo)組(NH4Cl+Pink1NC)相比顯著增加(P<0.01，圖5)。該結(jié)果提示高氨狀態(tài)下線粒體合成功能受損，減少高氨誘導(dǎo)的線粒體過度自噬可部分恢復(fù)線粒體合成ATP的功能。

Sham+Pink1NC：0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理；NH4Cl+Pink1NC：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒組；NH4Cl+Pink1KD：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾組。bP<0.01 vs Sham+Pink1NC組，dP<0.01 vs NH4Cl +Pink1NC組。圖5 Pink1KD對氨誘導(dǎo)線粒體ATP合成功能的影響

3 討論

HE是嚴(yán)重肝功能不全時常見的并發(fā)癥，而目前認(rèn)為氨中毒學(xué)說為其主要病因之一[11]。盡管人們普遍認(rèn)為高氨血癥誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元損傷在介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂中起著主要作用[12]，但其潛在的分子機制尚不清楚，其中具有爭議的是高氨血癥引起的大腦能量代謝改變的作用。本研究探討了與Pink1調(diào)節(jié)作用相關(guān)的高氨誘導(dǎo)的線粒體功能障礙相關(guān)的分子機制，研究結(jié)果如下：①高氨誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，導(dǎo)致線粒體分裂和自噬異常升高，進而損害線粒體功能；②在SHSY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，Pink1敲除降低Drp1水平，減少線粒體過度分裂，恢復(fù)了線粒體合成ATP的功能[13]。在高氨誘導(dǎo)細(xì)胞損傷之前已經(jīng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬和分裂異常增加，線粒體合成ATP功能減退，這代表了HE發(fā)病早期氨即已對線粒體功能造成損傷。

研究表明，氨中毒會引起腦能量代謝的明顯降低[14-15]。據(jù)報道，氨會抑制三羧酸循環(huán)酶，氨對線粒體電子呼吸鏈復(fù)合物的抑制可促進活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成和氧化應(yīng)激[16]。腦組織對ATP的高度持續(xù)依賴使細(xì)胞內(nèi)線粒體成為HE治療中至關(guān)重要，且有望成為治療HE的重要方向。研究最初表明線粒體分裂增加與凋亡激活之間存在聯(lián)系，但現(xiàn)在很清楚線粒體形態(tài)也與生物能量學(xué)密切相關(guān)，并受代謝需求變化的影響，線粒體分裂通過將受損的細(xì)胞器從健康網(wǎng)絡(luò)中分離出來，通過線粒體自噬降解，從而有助于質(zhì)量控制[17]。線粒體通過質(zhì)量控制維持自身穩(wěn)態(tài)，其主要通過線粒體自噬、線粒體動力學(xué)、線粒體生物合成等方式來維持線粒體完整性和功能。KLEELE等[7]通過體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)線粒體Pink1/Parkin介導(dǎo)的自噬與線粒體周邊分裂伴隨發(fā)生，并且過度的線粒體自噬導(dǎo)致線粒體碎片化樣改變和自噬穩(wěn)態(tài)失衡將進一步加重?fù)p傷線粒體功能。本研究為了揭示高氨狀態(tài)下線粒體自噬對線粒體分裂的影響，因此研究調(diào)控線粒體自噬蛋白Pink1，觀察線粒體分裂狀態(tài)的表達變化。線粒體融合和裂變對調(diào)控線粒體功能具有重要的意義。線粒體不斷進行融合和裂變以維持細(xì)胞器的保真度[18]。線粒體的形態(tài)變化受大量蛋白質(zhì)的控制，其中Drp1通過介導(dǎo)哺乳動物的線粒體裂變過程有效地影響細(xì)胞存活和凋亡[19-20]。用siRNA或線粒體分裂抑制劑-1抑制Drp1的活性，可大大提高線粒體的穩(wěn)定性并部分抑制細(xì)胞凋亡，這表明細(xì)胞凋亡的進展至少部分取決于Drp1介導(dǎo)的線粒體片段化[19，21]。以上研究結(jié)果與本文中發(fā)現(xiàn)高氨前期發(fā)生線粒體損傷結(jié)論一致。

線粒體形態(tài)受Drp1介導(dǎo)的裂變過程調(diào)控，Drp1可促進線粒體裂變影響神經(jīng)元功能[22]。線粒體過度的分裂提示線粒體碎片化、線粒體功能障礙、合成ATP能力減退。DREWS等[23]在人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中給予5 mmol/L NH4Cl高氨誘導(dǎo)6 h即表現(xiàn)出線粒體碎片化，24 h最為嚴(yán)重，但延長時間并未增加碎片化程度。線粒體碎片化與線粒體自噬關(guān)系密切。線粒體自噬自2005年首次提出后已被證明與多種系統(tǒng)疾病有關(guān)，目前研究已闡明線粒體自噬主要由兩種分子途徑介導(dǎo)，一條通路通過缺氧誘導(dǎo)因子1亞單位α激活，另一條由Pink1/Parkin通路參與介導(dǎo)[24-26]。而本文研究發(fā)現(xiàn)，高氨通過誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致Pink1高表達，并伴隨著Drp1誘導(dǎo)的線粒體過度分裂，電鏡結(jié)果進一步得到證實。最近一項在帕金森病模型中的研究表明，Pink1的過表達促進神經(jīng)元內(nèi)線粒體分裂，而Pink1敲除失活導(dǎo)致過度融合，同時減少線粒體的碎片化，該研究與本文研究結(jié)果一致[27]。2021年，KLEELE等[7]通過對線粒體生理學(xué)的精細(xì)時空分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)線粒體膜電位和質(zhì)子泵動力降低，ROS和Ca2+水平增加導(dǎo)致線粒體Pink1/Parkin介導(dǎo)的自噬發(fā)生，且該現(xiàn)象發(fā)生在Drp1由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體外膜分裂位點之前。以上成果與本文研究結(jié)果表明Drp1誘導(dǎo)的線粒體分裂依賴于Pink1對線粒體自噬的調(diào)控，通過調(diào)控Pink1可改善線粒體功能以及形態(tài)，有望成為治療HE高氨誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的新靶點。線粒體分裂根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的不同分為進行生物發(fā)生的分裂(即中央分裂)以及自我保護的損傷排除性的分裂(即邊緣分裂)，而在高氨不同程度處理狀態(tài)下線粒體分裂模式可能存在差異，需要進一步確認(rèn)，這也將是下一步的研究方向。

總之，本研究揭示在體外高氨模型中敲除Pink1表達，可減少Drp1誘導(dǎo)的線粒體過度分裂，并顯著恢復(fù)線粒體ATP合成功能，從而緩解高氨誘導(dǎo)的能量代謝障礙。因此，Pink1介導(dǎo)的線粒體自噬對于了解高氨誘導(dǎo)的線粒體形態(tài)異常和功能障礙具有重要意義，有望成為治療HE的潛在靶點。當(dāng)然，Pink1與高氨之間的具體機制仍需要進一步大量體內(nèi)和體外實驗的驗證和闡明。