國際首例6-基因編輯豬-猴肝腎聯(lián)合移植圍術(shù)期治療研究

韓士超，馬帥軍，戚若晨，王國輝，張小燕，劉克普，范效錚，魏 迪，張 玄，楊曉劍，陶開山，秦衛(wèi)軍，竇科峰

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院：1泌尿外科，2肝膽外科，陜西 西安 710032)

腎移植是治療慢性腎功能不全(尿毒癥期)的有效手段之一，同種異體腎移植技術(shù)已成為一項常規(guī)技術(shù)，但器官供體嚴(yán)重短缺被認(rèn)為是制約腎移植發(fā)展的瓶頸，目前臨床上雖然開展了邊緣供體腎移植、親屬活體供腎移植、ABO血型不相合腎移植等技術(shù)，但仍無法從根本上解決供腎短缺的難題[1-3]。異種器官移植被認(rèn)為是從根本上解決器官短缺難題的有效途徑，目前國際上基因編輯豬腎在非人靈長類動物體內(nèi)最長存活記錄已達758 d[4]，這為我們進行異種腎臟移植的研究提供了巨大的信心，但國內(nèi)相關(guān)研究只達到了中短期存活[5]。目前，異種腎臟移植面臨最突出的問題依然是急性排斥反應(yīng)。

2020年，在竇科峰院士的指導(dǎo)下，我們科室進行了13-基因編輯豬-恒河猴腎臟移植的研究[6]，然而，由于血栓形成導(dǎo)致心律失常，受體猴僅存活1 d，但相關(guān)工作仍給我們積累了大量的經(jīng)驗。多項研究表明，肝腎聯(lián)合移植術(shù)后移植肝可以對移植腎起到免疫保護作用，從而更容易維持機體的免疫耐受狀態(tài)[7-8]。為了進一步減輕異種移植間的排斥反應(yīng)，我們于2022年10月，創(chuàng)新性地實施了國際首例6-基因編輯豬-恒河猴腹腔異位肝臟移植+原位腎臟移植術(shù)，受體猴的生存時間較前顯著延長。本研究通過創(chuàng)新術(shù)式，觀察異種腎移植圍術(shù)期變化，總結(jié)相關(guān)經(jīng)驗，完善移植術(shù)后用藥方案，為異種腎臟移植向臨床推進做出努力。

1 材料與方法

1.1 材料

供體為GTKO/β4GalNT2 KO/CMAH KO/hCD55/hCD46/hTBM 6-基因編輯巴馬小型豬，雄性，3月齡，體質(zhì)量7 kg，血型為O型，由成都中科奧格生物科技有限公司提供，供體豬敲除了主要的糖類抗原半乳糖α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactosyltransferase，α-Gal)基因，以及另外兩種主要異種抗原基因Neu5Gc和Sda。同時聯(lián)合轉(zhuǎn)入hCD46/hCD55和hTBM。供體豬術(shù)前經(jīng)血型鑒定、基因表型鑒定均符合預(yù)期。受體為恒河猴，雄性，體質(zhì)量10 kg，血型B型，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院暨四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供。術(shù)前行供受體抗原抗體結(jié)合實驗和細胞毒試驗，以篩選最適合的供受體。所有實驗均通過空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會審核(許可證號：IACUC2022001)。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)過程及手術(shù)方式 手術(shù)于2022年10月16日進行，歷時約14 h完成。術(shù)前3 d行供受體腹部大血管超聲及CT血管造影檢查，選取血管口徑盡量匹配的供受體進行試驗。供體豬供腎、供肝切取后立即于冰水混合物中進行修腎、修肝，修整工作完畢后置于冰水混合物中保存?zhèn)溆?。受體猴麻醉準(zhǔn)備工作完畢后，手術(shù)切除受體猴右側(cè)腎臟，保留自體左側(cè)腎臟，供肝劈肝后行腹腔異位肝移植術(shù)[9]，肝移植結(jié)束后開放血流，檢查無明顯出血后行原位腎移植術(shù)。供腎放置于原右腎窩，切除受體自體右腎，將右腎動靜脈阻斷，移植腎動靜脈與原右腎動靜脈使用顯微吻合技術(shù)進行端端吻合，開放血流后檢查移植腎動靜脈無明顯出血，移植腎輸尿管行皮膚造口術(shù)。相關(guān)手術(shù)示意圖見圖1。關(guān)腹前再次檢查移植腎、移植肝血流灌注，無明顯出血后關(guān)腹結(jié)束手術(shù)。

圖1 肝腎聯(lián)合移植示意圖

1.2.2 免疫抑制方案 免疫誘導(dǎo)方案：抗CD20單克隆抗體19 mg/kg，術(shù)前2 d靜脈給藥；抗胸腺細胞球蛋白5 mg/kg，分別在術(shù)后0、1、2 d靜脈給藥；抗CD40單克隆抗體20 mg/kg，在術(shù)前1 d、術(shù)后0 d靜脈給藥。免疫維持方案：抗CD40單克隆抗體20 mg/kg，分別在術(shù)后4、7 d靜脈給藥；他克莫司0.05～0.10 mg/kg，靜脈給藥2次/d，血藥濃度維持在15～20 ng/L；托珠單抗8 mg/kg，每周1次；甲潑尼龍在術(shù)后1、2、3 d給藥劑量為10 mg/(kg·d)，靜脈給藥，術(shù)后第4日減半，之后每日減半，至1 mg/kg維持?？鼓桨福喊⑺酒チ?40 mg，口服1次/d)+那曲肝素鈣(1 900 IU，皮下注射1次/d)；其他用藥：奧美拉唑20 mg/d靜脈給藥；頭孢哌酮舒巴坦鈉0.2 g，靜脈給藥2次/d；更昔洛韋5 mg/kg預(yù)防病毒感染。

1.2.3 觀察內(nèi)容 觀察開放血流后移植腎、移植肝的功能狀態(tài)，包括顏色、質(zhì)地、血流灌注及器官功能恢復(fù)情況，并記錄受體存活情況；采用彩色多普勒超聲監(jiān)測移植物的血流動力學(xué)情況；監(jiān)測受體生理生化指標(biāo)，如血壓、心率、呼吸、氧飽和度、尿量、引流量等，以及血尿常規(guī)、肝腎功離子、心肌酶譜等；在觀察終點，獲取移植腎、移植肝組織樣本，行組織病理學(xué)檢查。經(jīng)過多學(xué)科會診，綜合評估移植器官功能狀態(tài)和異種腎臟移植的移植腎排斥反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 受體存活情況

受體猴術(shù)后移植腎功能、灌注均良好，術(shù)后受體猴維持鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛狀態(tài)，術(shù)后整體生命體征平穩(wěn)，術(shù)后第5日，移植腎考慮出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，給予甲潑尼龍激素沖擊、利妥昔單抗沖擊，效果不佳，術(shù)后第6日給予連續(xù)性腎臟替代治療輔助透析，術(shù)后第14日受體猴出現(xiàn)心臟驟停，經(jīng)搶救無效死亡，實驗終止。

2.2 術(shù)后移植腎狀態(tài)

開放血流后受體猴血流動力學(xué)狀態(tài)良好，移植腎、移植肝血流灌注良好，移植物顏色紅潤，質(zhì)地良好，開放血流后即可見移植腎有尿液流出，移植肝有膽汁流出。術(shù)后移植腎尿量均良好，維持在較高水平，自體腎尿量逐漸減少，術(shù)后第5日移植腎尿量開始減少，移植腎體積增大，考慮出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，自體腎尿液逐漸增多；術(shù)后第9日移植腎血流及灌注降低，術(shù)后第14日受體猴死亡，解剖可見移植腎明顯充血腫大，剖面見多發(fā)微血栓形成，移植腎外觀呈大紅腎外觀(圖2)。

A：供體腎臟灌注后狀態(tài)；B：移植肝開放血流后狀態(tài)；C：供體腎開放血流后狀態(tài)；D：尸檢肝臟外觀及剖面外觀；E：尸檢移植腎外觀。圖2 移植物狀態(tài)變化

2.3 術(shù)后移植腎血流動力學(xué)情況

術(shù)后使用彩超監(jiān)測移植腎的血流動力學(xué)情況。結(jié)果顯示術(shù)后開放血流即刻至術(shù)后第5日，移植腎血流動力學(xué)良好，第5日后出現(xiàn)移植腎臟變大，血流阻力指數(shù)升高的表現(xiàn)，術(shù)后第9日，移植腎血流灌注顯著降低，其動態(tài)過程見圖3。

A：移植腎動靜脈吻合完畢開放血流即刻超聲圖像；B：移植術(shù)后1 d超聲圖像；C：移植術(shù)后3 d移植腎超聲圖像；D：移植術(shù)后5 d移植腎超聲圖像；E：移植術(shù)后7 d移植腎超聲圖像；F：移植術(shù)后9 d移植腎超聲圖像。圖3 移植腎血流動力學(xué)情況

2.4 術(shù)后受體猴生化指標(biāo)情況

受體猴每日采集血液樣本，進行生化指標(biāo)檢測。結(jié)果顯示，受體猴血紅蛋白、血小板、白細胞均呈進行性下降；肌酐在前5 d呈進行性升高，透析后肌酐水平平穩(wěn)，鉀離子水平變化不顯著(圖4)。

圖4 受體猴圍術(shù)期生化指標(biāo)變化情況

2.5 術(shù)后受體猴尿液變化情況

每日監(jiān)測受體猴尿量變化。在術(shù)后前5 d，移植腎尿量良好，維持在較高水平，尿液淡黃，5 d之后移植腎尿量迅速減少，且出現(xiàn)較多沉渣；與之相對，自體腎臟尿量在前5 d顯著減少，5 d之后，自體腎臟尿液明顯增加(圖5)。

圖5 受體猴術(shù)后尿液變化情況

3 討論

異種腎臟移植是解決供腎短缺難題的最有前景的途徑，然而目前其面臨的最大瓶頸依然是急性排斥反應(yīng)問題[10-11]。為了探索減緩異種腎臟移植排斥反應(yīng)的方法，我們借鑒臨床上較為成熟的肝腎聯(lián)合移植的辦法，實施了國際首例6-基因編輯豬-恒河猴腹腔異位肝臟移植+原位腎臟移植的研究。研究結(jié)果顯示異種肝臟移植可以減緩異種腎臟移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長受體猴的生存時間，為異種腎臟移植向臨床推進做出努力。

豬和非人靈長類之間的移植屬于非協(xié)調(diào)性異種移植，當(dāng)野生豬的器官進入人體后，人體內(nèi)預(yù)存的抗豬抗體可與野生豬的移植物內(nèi)皮細胞迅速結(jié)合并激活補體途徑和凝血反應(yīng)，從而發(fā)生超急性排斥反應(yīng)[12]。目前通過基因編輯技術(shù)將豬α-Gal等抗原進行敲除可以基本避免異種移植之間超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，部分受體甚至達到了長期存活[13-15]。隨著基因編輯技術(shù)的進展，不同組合的基因編輯豬也相繼誕生，但其總體基因編輯策略依然是敲除豬表達的針對人類的主要異種抗原以及轉(zhuǎn)入人源性保護基因，除此之外，還有一些調(diào)控豬器官生長的基因以及豬源性病毒的基因也在基因編輯策略之中。2020年在竇科峰院士的帶領(lǐng)下，我們首次使用基因改造程度最大的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒敲除豬，即“13-基因編輯”豬作為供體，分別進行了豬-猴異種心、肝、腎移植的臨床前研究，對異種器官移植進行了初步的探索[6]。但考慮到較高的基因編輯數(shù)量會導(dǎo)致供體豬難以存活，且較高的基因編輯數(shù)量并不代表著更好的移植物的存活，因此在本次試驗研究中我們使用了目前國際公認(rèn)的最適宜進行異種移植的6-基因編輯豬，即GTKO/β4GalNT2 KO/CMAH KO/hCD55/hCD46/hTBM 6-基因編輯豬作為供體。

在異種移植中，使用常規(guī)的免疫抑制方案往往不能使受體達到長期存活，而加用阻斷CD40/CD154共刺激途徑的新型藥物能大大延長受體的存活時間[16-17]。國內(nèi)同樣有其他異種移植團隊嘗試使用了CD40單抗或CD154單抗，但其效果并未達到國外異種移植團隊的中長期存活。究其原因，可能為不同移植團隊使用的CD40/CD154單抗針對的氨基酸表位不同所致，在本次試驗中，我們也應(yīng)用了抗CD40單克隆抗體，初步證實了其有效性，且在維持過程中，也嘗試使用了托珠單抗、依那西普等藥物，積累了一定的經(jīng)驗。但我們的試驗亦未達到中長期存活，目前國外團隊使用的CD40或CD154單抗國內(nèi)已無法購買，因此加大國內(nèi)CD154單抗的研發(fā)勢在必行。

多項研究表明，肝腎聯(lián)合移植術(shù)后移植肝可以對移植腎臟起到免疫保護作用，從而更容易使機體維持免疫耐受狀態(tài)。其詳細的機制可能包括以下幾個方面：①移植肝內(nèi)網(wǎng)狀中的血管內(nèi)皮細胞對受者淋巴細的吸附作用；②移植肝合成的MCH-1類分子可中和針對移植腎臟的特異性抗體；③移植肝合成的人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)可中和抗HLA抗體，其還可以和CD8陽性細胞毒性淋巴細胞結(jié)合，導(dǎo)致淋巴細胞功能喪失，從而減輕對移植腎臟的免疫識別及攻擊作用；④移植肝內(nèi)的造血細胞移居遷移，可導(dǎo)致供者特異性低反應(yīng)及微嵌合體的形成，這種嵌合體可以誘導(dǎo)免疫耐受[18]。我們團隊在國內(nèi)率先進行了腎移植聯(lián)合脾窩輔助性肝移植治療高致敏腎移植受者[19-20]，取得了良好的效果。然而在異種移植中肝腎聯(lián)合移植是否有同樣的作用目前國際尚未開展相關(guān)研究。在本試驗中，我們通過創(chuàng)新術(shù)式對這一問題進行了初步的探究。我們的實驗表明，肝腎聯(lián)合移植開放血流后，移植腎、移植肝血流灌注均良好，且移植腎臟在前5 d灌注良好，血流阻力指數(shù)正常，每日尿量達到200 mL以上，移植腎臟尿肌酐水平較高(在移植術(shù)后前3 d，每日的尿肌酐水平均在7 000 μmol/L以上)，血肌酐水平維持在300 μmol/L左右，證實其未發(fā)生明顯的排斥反應(yīng)且發(fā)揮腎臟排泄功能，驗證了6-基因編輯豬作為供體的可靠性以及以CD40單抗為基礎(chǔ)的免疫抑制方案的初步可靠性，初步證實了異種肝腎聯(lián)合移植試驗的可行性。同時我們的實驗發(fā)現(xiàn)，移植肝臟早于移植腎臟出現(xiàn)血流灌注的減少，提示移植肝臟對移植腎臟發(fā)揮了一定的保護作用。但我們的試驗仍然無法完全避免排斥反應(yīng)的發(fā)生，在移植術(shù)后第5日，移植腎臟出現(xiàn)腫脹，血流阻力指數(shù)雖未明顯升高，但移植腎尿量開始減少，血肌酐水平也出現(xiàn)了升高，提示移植腎臟發(fā)生了排斥反應(yīng)，因此我們進行了激素沖擊和利妥昔單抗沖擊，然而并未能逆轉(zhuǎn)排斥反應(yīng)。與此同時，受體猴血小板水平也一直下降，尤其是在術(shù)后第3日，血小板降低至42×109/L，提示雖然移植腎臟在第5日才表現(xiàn)出排斥反應(yīng)，但可能在第3日，即已經(jīng)開始出現(xiàn)排斥跡象，國內(nèi)其他異種移植團隊也報道有類似現(xiàn)象[20-22]。凝血功能的紊亂導(dǎo)致的多臟器微血栓形成，移植后期多發(fā)感染的出現(xiàn)，最終導(dǎo)致多臟器功能衰竭可能是受體猴死亡的主要原因。

在試驗中，我們還觀察到如下現(xiàn)象：①供體豬和受體猴腎臟血管口徑差異較大，行原位移植具有一定的困難，因此行豬猴移植腎原位移植有必要借助顯微縫合技術(shù)；②為了盡可能保證移植腎動靜脈口徑和受體猴腎動靜脈口徑的匹配，我們選擇了體質(zhì)量與受體接近的供體豬，但小體質(zhì)量供體豬的移植腎臟術(shù)后即使恢復(fù)良好，仍不足以使受體猴肌酐保持在正常水平；③本次試驗我們保留了受體猴自體腎臟，有意思的是進行了移植術(shù)后，移植腎臟尿量逐漸增加，而自體腎臟尿量顯著減少，提示移植腎臟血流灌注優(yōu)于自體腎臟，而在移植腎臟出現(xiàn)排斥反應(yīng)之后，自體腎臟尿量開始逐漸恢復(fù)，因此單純從觀察移植腎臟排斥反應(yīng)的角度，可以保留自體腎臟，但在移植腎臟出現(xiàn)灌注降低時應(yīng)及時中止試驗，進行移植腎臟的病理檢查；④凝血功能障礙依舊是異種移植面臨的另一個主要障礙，雖然我們在移植術(shù)后早期就進行了凝血的干預(yù)，但在排斥反應(yīng)存在的前提下，這些努力并未取得顯著成效，我們在試驗終點進行解剖時發(fā)現(xiàn)了移植物有廣泛微血栓的形成，提示在紅細胞、血小板出現(xiàn)進行性下降時即可以進行排斥反應(yīng)的干預(yù)，必要時可以嘗試使用依庫珠單抗進行血栓性微血管病的治療。

綜上，本次試驗通過術(shù)式創(chuàng)新，實施了國際首例6-基因編輯豬-恒河猴腹腔異位肝臟移植+原位腎臟移植術(shù)，受體猴的生存時間明顯延長，但死亡原因仍為排斥反應(yīng)導(dǎo)致的凝血功能障礙和嚴(yán)重感染。肝腎聯(lián)合移植在異種移植中具有一定的價值，移植肝臟有助于減輕移植腎臟發(fā)生排斥反應(yīng)，有助于保護移植腎臟的功能。針對異種腎臟移植，排斥反應(yīng)和凝血功能紊亂的處理依然是影響受體存活時間的關(guān)鍵。未來我們將進一步從減輕排斥反應(yīng)、緩解凝血功能障礙和預(yù)防感染的方向深入研究，為異種腎臟移植向臨床推進做出努力。