用于高靈敏快速核酸檢測(cè)的熒光碳點(diǎn)

常建橋，許慧敏，謝文菁，張洋，祁玲，范樓珍,＊，李勇

1北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，理論計(jì)算光化學(xué)與放射性藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院內(nèi)科，國(guó)家癌癥中心/國(guó)家癌癥臨床研究中心/癌癥醫(yī)院，北京 100021

3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院胸外科，國(guó)家癌癥中心/國(guó)家癌癥臨床研究中心/癌癥醫(yī)院，北京 100021

1 引言

PCR技術(shù)是指通過多種酶的作用，雙鏈DNA在高溫下變性為單鏈DNA。根據(jù)互補(bǔ)堿基配對(duì)原則，利用DNA聚合酶從單鏈DNA復(fù)制出新的DNA，實(shí)現(xiàn)DNA體外擴(kuò)增1,2。逆轉(zhuǎn)錄PCR (RTPCR)是指當(dāng)體系內(nèi)核酸為RNA時(shí)，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行體外擴(kuò)增的過程。實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)是在PCR的基礎(chǔ)上，向體系中加入染料或熒光探針，使擴(kuò)增后的DNA具有熒光性，結(jié)合熒光信號(hào)強(qiáng)度與擴(kuò)增增量的關(guān)系，可以在擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的DNA的拷貝數(shù)3–6。自從新冠病毒流行以來，所采用的標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測(cè)技術(shù)為RT-qPCR技術(shù)，其將RT-PCR技術(shù)與qPCR相結(jié)合，盡管具有強(qiáng)大的檢測(cè)性能，但其作為新冠病毒的診斷技術(shù)仍然存在一些局限性，例如需要相對(duì)較長(zhǎng)的檢測(cè)過程(2–4 h)，專業(yè)的設(shè)備(熱循環(huán)儀、PCR儀等)、實(shí)驗(yàn)室以及專業(yè)的操作人員等7–9。因此，開發(fā)出新冠病毒快速、靈敏的即時(shí)檢測(cè)(POCT)是非常必要的。

快速抗原檢測(cè)是一種針對(duì)特定抗原的POCT，其主要是基于橫向流動(dòng)免疫分析(LFIA)，當(dāng)含有抗原的樣品滴入到樣品墊后，流到結(jié)合物釋放墊與抗體1結(jié)合，抗體1上攜帶有色顆粒(例如膠體金)，抗原-抗體1-金復(fù)合物流向試紙條的檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)區(qū)是一種多孔膜，存在測(cè)試線和控制線。當(dāng)復(fù)合物經(jīng)過測(cè)試線時(shí)，抗原與測(cè)試線上的抗體2結(jié)合，復(fù)合物留在測(cè)試線，金顆粒發(fā)生響應(yīng)，顯示陽性。而控制線上的響應(yīng)則表明正確的液體流過試紙條。抗原檢測(cè)可提供早期病毒感染的證據(jù)10,11，具有成本低、操作方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短(20 min或更短)等優(yōu)勢(shì)12。但是其檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受到其他具有相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)的影響，導(dǎo)致其靈敏度為75%–98%，特異性為95%–99%，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果13。由于病毒載量的影響，LFIA的檢測(cè)限為1.12 × 105–3.57 × 106copys?mL-114，只能在出現(xiàn)癥狀的第一周有效，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果15?？乖瓩z測(cè)這種相對(duì)較低的靈敏度給檢測(cè)帶來了多重障礙，需要進(jìn)一步研究以提高其靈敏度和準(zhǔn)確性16–18。

碳點(diǎn)(CDs)是一種零維碳納米材料，具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、良好的水溶性、較好的生物相容性以及廣泛的原料來源等諸多優(yōu)點(diǎn)19–23，已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)24–26、診斷27–29以及藥物的遞送等領(lǐng)域30–32。本研究使用鄰苯二胺和精氨酸作為前驅(qū)體，合成了一種基于胍基修飾的熒光碳點(diǎn)(GCDs)(如圖1a)。當(dāng)GCDs與分子信標(biāo)(Beacon)通過氫鍵結(jié)合后，GCDs的熒光被Beacon所修飾的熒光基團(tuán)淬滅。遇到目標(biāo)核酸(Target DNA)之后，Target DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，與GCDs競(jìng)爭(zhēng)Beacon分子，GCDs與Beacon脫離，其自身熒光恢復(fù)，根據(jù)熒光恢復(fù)的強(qiáng)度來判斷體系內(nèi)Target DNA的存在(圖1b)，基于這種靈敏的熒光“off-on”，可實(shí)現(xiàn)在5 min內(nèi)快速準(zhǔn)確的核酸檢測(cè)，并可檢測(cè)到體系內(nèi)0.005 fmol?L-1(約300 copys?mL-1)的核酸序列，我們預(yù)計(jì)，新建立的COVID-19低成本無擴(kuò)增檢測(cè)將有助于開發(fā)新的核酸檢測(cè)平臺(tái)，以實(shí)現(xiàn)COVID-19和其他病原體的高靈敏度和高特異性的快速即時(shí)檢驗(yàn)。

圖1 (a) GCDs合成過程，(b) GCDs核酸檢測(cè)機(jī)理Fig.1 (a) GCDs synthesis process and (b) nucleic acid detection mechanism of GCDs.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)儀器

鄰苯二胺和精氨酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度為99%。二氯甲烷和甲醇純度為99%，柱層析硅膠和中性三氧化二鋁購(gòu)自山西諾泰生物科技有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.22 μm濾膜和7000 kD透析袋購(gòu)自北京科龍生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所使用的核酸序列購(gòu)自上海生工生物有限公司，主要核酸序列見表1。

表1 主要核酸序列Table 1 Major nucleic acid sequence.

熒光光譜儀(法國(guó)Horiba Jobin Yvon公司，F(xiàn)luorolog-3)、透射電子顯微鏡(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，Talos F200S)、傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司，IRAffinity-1)、X射線光電子能譜(美國(guó)Thermo Fisher公司，ESCALAB 250Xi)、拉曼光譜儀(法國(guó)Horiba Jobin Yvon，LabRAM)。

2.2 GCDs的合成

向60 mL去離子水中加入0.15 g鄰苯二胺和0.3 g精氨酸，超聲15 min使其完全溶解。將內(nèi)膽置于高壓反應(yīng)釜中，180 °C反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻。使用孔徑為0.22 μm的水系濾膜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行過濾。將過濾后的樣品烘干，以甲醇:二氯甲烷(9 : 1)混合溶劑作為洗脫劑，使用200–300目的硅膠和中性氧化鋁進(jìn)行兩次提純，收集黃色熒光碳點(diǎn)。將得到的產(chǎn)物使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑后溶解在水中，得到GCDs溶液。

2.3 GCDs胍基數(shù)目的測(cè)定

應(yīng)用坂口反應(yīng)來對(duì)GCDs表面的胍基數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。取50 μL不同濃度的精氨酸溶液，向其中加入10 μL NaOH溶液，再加入10 μL α-萘酚溶液，混合均勻后加入10 μL 10%的次氯酸鈉溶液，靜置5 min后測(cè)量體系內(nèi)500 nm處的吸收值，繪制精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸收光強(qiáng)度與精氨酸胍基數(shù)目的對(duì)應(yīng)關(guān)系。按照相同的方法對(duì)GCDs中的坂口反應(yīng)吸收值進(jìn)行測(cè)量，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到GCDs的胍基數(shù)目。

2.4 GCDs-Bea的制備

將GCDs與Beacon在PBS中以不同比例混勻后，渦旋震動(dòng)10 s，室溫避光靜置15 min，然后使用7000 kD的透析袋進(jìn)行透析2–3天，除去未與Beacon結(jié)合的游離GCDs，取出透析袋內(nèi)液得到GCDs-Beacon (GCDs-Bea)。

使用JY-SPBT電泳設(shè)備對(duì)GCDs-Bea進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。凝膠濃度2%，電壓85 V，電泳時(shí)間40 min，Running Buffer為TAE緩沖液。電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀在254 nm激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行成像，使用Image J軟件對(duì)凝膠成像結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

2.5 核酸檢測(cè)

向2 mL GCDs-Bea中分別加入100 μL的PBS，Target DNA，Mismatch DNA等核酸序列，在室溫混勻后使用熒光光譜儀測(cè)量體系內(nèi)熒光光譜，并對(duì)570 nm處的熒光變化率(F-F0)/F0×100%進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 GCDs結(jié)構(gòu)表征

GCDs的結(jié)構(gòu)表征如圖2所示，圖2a為GCDs的TEM圖像，GCDs具有均勻的分散狀態(tài)，其平均粒徑約為4 nm，大小均一，高分辨TEM圖顯示GCDs的晶格間距為0.21 nm，對(duì)應(yīng)于石墨的(100)晶面的衍射。圖2b為傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)結(jié)果表征，在3433 cm-1處有對(duì)應(yīng)N―H的振動(dòng)峰，表明GCDs表面存在―NH2基團(tuán)。在3172 cm-1處有對(duì)應(yīng)羧酸―OH的振動(dòng)峰，表明GCDs表面存在―COOH基團(tuán)，1506和1637 cm-1處有兩個(gè)強(qiáng)峰，這是C＝C/C＝N的伸縮振動(dòng)特征峰。通過坂口反應(yīng)測(cè)定后，對(duì)應(yīng)精氨酸濃度與吸收值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2c所示，計(jì)算表明一個(gè)GCDs上約帶有3–4個(gè)胍基。為了進(jìn)一步探究GCDs的結(jié)構(gòu)，分別進(jìn)行了X射線光電子能譜(XPS)和拉曼光譜的表征。如圖2d所示，用XPS確定了GCDs的元素組成。將XPS數(shù)據(jù)擬合后得到高分辨譜圖，如圖2e的高分辨C 1s光譜顯示，GCDs中碳元素主要由C＝C/C―C (284.6 eV)、C―N/C―O (285.1 eV)和C＝O (288.3 eV)形式構(gòu)成。圖2f拉曼光譜進(jìn)一步表征了GCDs的結(jié)構(gòu)，在1385 cm-1(D峰，碳材料中的無序態(tài))和1597 cm-1(G峰，碳材料中的結(jié)晶態(tài))附近有兩個(gè)寬峰，分別對(duì)應(yīng)碳原子的sp3和sp2雜化振動(dòng)。GCDs的ID/IG約0.6，這表明所制備的GCDs具有高度的晶體結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果也與HRTEM結(jié)果一致。綜上所述，GCDs是中心為較好共軛性的剛性碳核結(jié)構(gòu)，邊緣具有―NH2、―COOH以及3–4個(gè)―C3H4基團(tuán)的熒光碳點(diǎn)(圖1a)。

圖2 GCDs的(a) TEM圖，高分辨TEM圖以及尺寸統(tǒng)計(jì)分布圖，(b) FT-IR圖，(c)坂口反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，(d) XPS全譜，(e) C 1s高分辨譜圖，(f)拉曼圖Fig.2 (a) TEM,high resolution TEM and size statistical distribution diagram,(b) FT-IR,(c) standard Sakakuchi reaction curve,(d) XPS full spectrum,(e) C 1s high resolution spectrum,(f) Raman diagram of GCDs.

3.2 GCDs的光學(xué)性質(zhì)

圖3a是GCDs的紫外可見吸收光譜圖，GCDs在波長(zhǎng)為210 nm處存在明顯的吸收峰，對(duì)應(yīng)于sp2共軛結(jié)構(gòu)的π–π*的躍遷吸收。在波長(zhǎng)為258 nm附近存在幾個(gè)較弱吸收峰，對(duì)應(yīng)于C＝O等結(jié)構(gòu)的n–π*躍遷吸收。GCDs在415 nm處有特征吸收峰，對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射峰位置為570 nm。圖3a插圖為GCDs在日光下的照片和紫外光照射下的熒光圖像。使用積分球測(cè)得GCDs在410 nm 激發(fā)下的熒光量子產(chǎn)率為9.8%。圖3b是GCDs的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，GCDs的發(fā)射光譜從激發(fā)光波長(zhǎng)400 nm增加到520 nm時(shí)，最大發(fā)射峰均在570 nm，不存在激發(fā)依賴現(xiàn)象，與圖3c的二維熒光光譜圖對(duì)應(yīng)。并且GCDs室溫存放17個(gè)月后，熒光發(fā)射位置不發(fā)生移動(dòng)，熒光強(qiáng)度下降約4.5%，如圖3d所示，GCDs的發(fā)光穩(wěn)定性較好。

3.3 GCDs-Bea的制備

圖4a為瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Beacon與凝膠中的GelRed結(jié)合后，在254 nm激發(fā)下產(chǎn)生熒光條帶，經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)拍照后，使用Image J軟件測(cè)量條帶灰度值，結(jié)果表明，向Beacon中加入GCDs后，Beacon亮度減弱，GCDs與Beacon發(fā)生相互作用，阻礙了Beacon條帶的移動(dòng)，當(dāng)向Beacon中加入2倍量GCDs時(shí)，Beacon條帶幾乎消失(圖4a左一)，過量的GCDs與Beacon發(fā)生相互作用后完全阻滯了Beacon的移動(dòng)。

圖4 GCDs與Beacon連接結(jié)果。(a)瓊脂糖凝膠電泳條帶的灰度值，(b) GCDs上胍基基團(tuán)與Beacon四種堿基相互作用能量Fig.4 GCDs-Bea connection result.(a) Gray value of bands in agarose gel electrophoresis,(b) calculation results of guanidine groups and beacon bases.

對(duì)GCDs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡(jiǎn)化后計(jì)算GCDs與Beacon的結(jié)合能。使用幾何建模方法確定了GCDs中的氨基(―NH2)、羧基(―COOH)和胍基(―CN3H4)與腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)四種堿基之間的相互作用，并在b3lyp/6-31g(d)水平上優(yōu)化了幾何結(jié)構(gòu)，通過從頭算量子化學(xué)方法計(jì)算了這些模型的相互作用能量33。如圖4b的計(jì)算結(jié)果表明，胍基與Beacon的相互作用能量為-1.25 – -7.01 kcal?mol-1(1 kcal?mol-1=4.1868 kJ?mol-1)，而氨基和羧基與Beacon的相互作用能量相似(分別為0.58 – -2.21 kcal?mol-1和2.55 – -3.07 kcal?mol-1)，表明胍基在與Beacon相互作用時(shí)具有明顯的能量?jī)?yōu)勢(shì)。

3.4 核酸檢測(cè)結(jié)果的特異性與靈敏度

向GCDs-Bea (Control)中分別加入Target DNA以及錯(cuò)配DNA (Mismatch DNA，序列與Target DNA不同)，結(jié)果如圖5a所示。GCDs-Bea與Target DNA混勻后測(cè)量熒光光譜，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)6倍，但Mismatch DNA組的熒光沒有發(fā)生明顯變化，顯示GCDs-Bea核酸檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性。為了明確檢測(cè)方法的特異性，設(shè)置了55個(gè)樣本，其中34個(gè)為含有不同濃度的Target DNA的陽性樣本，21個(gè)含有不同序列的Mismatch DNA的陰性樣本，使用GCDs-Bea對(duì)55個(gè)樣本進(jìn)行熒光測(cè)定并分析，檢測(cè)閾值設(shè)置為熒光強(qiáng)度變化率為20%。結(jié)果如圖5b，陽性樣本平均熒光增長(zhǎng)率為124.75%，陰性樣本平均熒光增長(zhǎng)率為0.04%。其中，陰性組存在一樣本熒光增長(zhǎng)率為20.35%，為假陽性結(jié)果。所以GCDs-Bea的核酸檢測(cè)特異性=真陰性樣本/(真陰性樣本+假陽性樣本) × 100% = 95.45%。

圖5 GCDs-Bea核酸檢測(cè)的(a)特異性，(b)多樣本特異性，(c)靈敏度。圖c中的濃度為檢測(cè)時(shí)的起始濃度，終濃度為該濃度的5%Fig.5 (a) Specificity,(b) multiple sample,(c) sensitivity of GCDs-Bea nucleic acid detection. The concentration in the figure c is the initial concentration at the time of detection,and the final concentration is 5% of that concentration.

為了確定檢測(cè)的靈敏度，將GCDs-Bea與不同濃度的Target DNA進(jìn)行孵育，測(cè)量分析GCDs的熒光變化，圖5c顯示出GCDs-Bea對(duì)不同濃度的Target DNA產(chǎn)生不同的熒光現(xiàn)象，DNA濃度即使低至0.01 fmol?L-1(終濃度約為300 copys?mL-1)時(shí)，仍然有熒光增加現(xiàn)象，表明了GCDs-Bea具有較強(qiáng)的靈敏度。對(duì)比RT-qPCR檢測(cè)方法的檢測(cè)限2.59 × 102–1.04 × 103copys?mL-1，快速抗原檢測(cè)試劑盒的1.12 × 105–3.57 × 106copys?mL-114，GCDs-Bea的檢測(cè)方法可以靈敏地檢測(cè)出目標(biāo)核酸序列，而不需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增步驟。此外，GCDs-Bea可以在兩周內(nèi)保持穩(wěn)定，不影響檢測(cè)效果，將DNA加入到GCDs-Bea后，可立即進(jìn)行熒光測(cè)定，獲得檢測(cè)結(jié)果，該過程預(yù)計(jì)在5 min內(nèi)。

但是在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，熒光恢復(fù)的強(qiáng)度與Target DNA的濃度不呈線性關(guān)系，推測(cè)原因與GCDs-Bea的連接機(jī)理有關(guān)。GCDs與Beacon連接的數(shù)量比并不一致，所以Target DNA與Beacon特異性結(jié)合后，脫離下來的GCDs數(shù)量不一致，恢復(fù)的GCDs的熒光有所不同，導(dǎo)致DNA濃度增大后，熒光值可能減小。但是可以確定的是，熒光值雖然減小，但是依然比Control組高20%以上。

3.5 其他核酸序列的檢測(cè)

為了明確GCDs-Bea體系能否檢測(cè)其他病毒或者疾病，將GCDs與不同序列的Beacon分子連接(Beacon2和Beacon3)，然后將其與對(duì)應(yīng)序列Target DNA2和Target DNA3進(jìn)行測(cè)試，如圖6a–c所示，更換Beacon核酸序列后，GCDs-Bea在檢測(cè)到Target DNA后，GCDs的熒光強(qiáng)度變化率均在50%以上。將Target DNA的核酸序列改變一個(gè)堿基(Mis1)或4個(gè)堿基(Mis4)，再分別與GCDs-Bea2反應(yīng)，如圖6d所示，當(dāng)GCDs-Bea體系內(nèi)存在Target DNA，熒光強(qiáng)度變化率為24%，改變Target DNA中的一個(gè)堿基，熒光強(qiáng)度變化率降為13%，改變4個(gè)堿基后，變化率僅為3%，與Mismatch DNA相同。檢測(cè)體系具有與Beacon1相似的特異性和靈敏度。實(shí)驗(yàn)表明GCDs-Bea檢測(cè)體系可以通過改變Beacon的核酸序列，進(jìn)行不同病毒或疾病的核酸檢測(cè)。

圖6 GCDs和不同核酸序列Beacon2 (a)和Beacon3 (b)的靈敏度結(jié)果，(c) Beacon、Beacon2和Beacon3的熒光檢測(cè)結(jié)果，(d) GCDs-Bea2的核酸檢測(cè)的特異性，(e)混合樣品的核酸檢測(cè)。圖中的濃度為檢測(cè)時(shí)的起始濃度，終濃度為該濃度的5%Fig.6 The sensitivity results of GCDs and different nucleic acid sequences of Beacon2 (a) and Beacon3 (b),(c) fluorescence results of Beacon,Beacon2 and Beacon3,(d) specificity of nucleic acid detection of GCDs-Bea2,(e) the nucleic acid detection of mixed samples.The concentration in the figure is the initial concentration at the time of detection,and the final concentration is 5% of that concentration.

保持核酸終濃度一致，將不同序列的核酸進(jìn)行混合后，GCDs-Bea依然能檢測(cè)到其中含有的微量Target DNA，如圖6e所示，MisDNA2、3、4分別為改變Target DNA中的2、3、4個(gè)堿基，T +Mis2 + 3 + 4為Target DNA、MisDNA2、MisDNA3和MisDNA4混合物。0.25T為0.25倍的0.01 fmol?L-1Target DNA，即向體系內(nèi)加入0.0025 fmol?L-1Target DNA。所以當(dāng)體系內(nèi)存在多種核酸甚至整個(gè)病毒碎片時(shí)，依然可以對(duì)其中含有的微量目標(biāo)核酸進(jìn)行檢測(cè)，即對(duì)獲得的咽拭子或鼻拭子采集液進(jìn)行快速的病毒破壞后，GCDs-Bea與采集液進(jìn)行混合后，依然能對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行靈敏地檢測(cè)，避免了核酸提純這一工序，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。例如現(xiàn)有的核酸檢測(cè)需要在采集樣本后，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行30 min的紫外滅菌，再進(jìn)行一系列地核酸提純、擴(kuò)增、檢測(cè)(2–4 h)，所以GCDs-Bea核酸檢測(cè)可能為之后的檢測(cè)提供新的便利。

4 結(jié)論

本研究成功合成了一種基于胍基修飾的熒光碳點(diǎn)(GCDs)，連接分子信標(biāo)(Beacon)后，可以在5 min內(nèi)識(shí)別出目標(biāo)核酸序列，并可檢測(cè)到體系內(nèi)0.005 fmol?L-1(約300 copys?mL-1)的核酸序列，不需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增過程，并且可以在混合體系內(nèi)識(shí)別出目標(biāo)核酸序列，不需要進(jìn)行核酸提取過程。具體過程主要為，當(dāng)GCDs與Beacon結(jié)合后，GCDs與Beacon所攜帶的ROX熒光基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，GCDs熒光被淬滅，GCDs-Bea熒光減弱，但當(dāng)GCDs-Bea遇到與Beacon互補(bǔ)配對(duì)的目標(biāo)核酸序列(Target DNA)時(shí)，Beacon與GCDs分離，GCDs熒光恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比于目前的RT-qPCR檢測(cè)方案，該方法可以縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。GCDs-Bea可以通過改變Beacon的核酸序列的方式，來達(dá)到對(duì)其他病毒或疾病的核酸檢測(cè)的結(jié)果。