生物菌劑與土壤熏蒸互作對(duì)三七土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉博文,李 蓉,楊 萍,李明鑒,王艷林,魏富剛,黃 永

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137;2.文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司,云南 文山 663099)

【研究意義】三七連作障礙嚴(yán)重影響其藥效質(zhì)量和產(chǎn)量[1]。土壤熏蒸是目前緩解連作障礙的最主要途徑[2]。然而土壤熏蒸無差別殺滅土壤中的微生物,導(dǎo)致土壤物種多樣性降低[3]。且熏蒸不能降低三七化感自毒物質(zhì),同時(shí)導(dǎo)致部分農(nóng)藥殘留量增加[4]。根腐病高發(fā)是三七連作障礙的主要表現(xiàn)形式[5],目前防治三七根腐病的主要措施是化學(xué)農(nóng)藥的施用,農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康存在潛在的安全隱患[6]。近年來的研究證實(shí),熏蒸后及時(shí)補(bǔ)充生物菌快速占領(lǐng)空白生態(tài)位,有助于形成抑病土壤,增強(qiáng)土壤對(duì)土傳疾病的抑制作用[7]。【前人研究進(jìn)展】病原菌的生物量會(huì)隨著三七種植年限的增加積累,同時(shí)土壤從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變,從而導(dǎo)致根腐病高發(fā)繼而引發(fā)連作障礙[8]。常見的輪作管理模式需要5～7年才能基本消除三七連作對(duì)土壤造成的負(fù)面影響,不能滿足三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展需求[9]。棉隆熏蒸能有效消除連作土壤的負(fù)面效應(yīng),防治土傳病害發(fā)生[10],對(duì)多種疫霉屬(Phytophthora)和鐮刀屬(Fusarium)病原菌有較高的抑制作用,但其減退作用無法達(dá)到100%[2]。熏蒸后土壤環(huán)境“真空”且益生菌屬受到抑制[3],繁殖能力強(qiáng)的病原菌可快速恢復(fù)至原水平。木霉菌(Trichoderma)對(duì)棉隆有極其優(yōu)良的耐受性,熏蒸可以創(chuàng)造出增強(qiáng)木霉菌有機(jī)質(zhì)分解能力的土壤環(huán)境,早期投入能迅速繁殖占領(lǐng)空白生態(tài)位[11],從而充分發(fā)揮其生防潛能。芽孢桿菌(Bacillus)應(yīng)用于多種植物鐮刀屬病原菌所致根腐病時(shí)都表現(xiàn)出較好的防效[12];劉海嬌等[13]從三七連作土壤中分離得到的假單胞菌(Pseudomonas)對(duì)叢赤殼科(Nectriaceae)根腐病致病菌有較強(qiáng)的抑制作用;葉云峰等[14]證實(shí)木霉菌對(duì)三七根腐病病原菌人參鏈格孢(Alternariapanax)和尖孢鐮刀菌(Fuariumsolani)有良好的抑制效率。此外,木霉菌與芽孢桿菌、假單胞菌等生物細(xì)菌組合施用具有提高生物效果的潛能[15]。土壤微生物直接或間接作用于營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化和循環(huán)過程,是土壤質(zhì)量演替的關(guān)鍵因素[16]。三七種植過程中,土壤有效氮和速效磷的累積以及速效鉀的耗竭導(dǎo)致營養(yǎng)不均衡是產(chǎn)生連作障礙的原因之一[17]。因此,明確生物菌劑對(duì)熏蒸后三七土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤環(huán)境的影響,對(duì)于優(yōu)化三七種植過程中的管理模式具有指導(dǎo)價(jià)值?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】熏蒸劑在緩解三七連作障礙方面的應(yīng)用已較成熟,但生防菌作用于三七根腐病病原的研究多停留在體外實(shí)驗(yàn)階段,特別是熏蒸后復(fù)配多種生物菌劑對(duì)三七連作土微生態(tài)的研究仍是空白。本研究設(shè)置熏蒸、熏蒸配施生物菌劑、非熏蒸、非熏蒸配施生物菌劑4個(gè)試驗(yàn)組,分析不同組土壤主要理化性質(zhì)和微生物群落組成差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】考察熏蒸后添加益生菌劑是否對(duì)三七微生態(tài)的改善有促進(jìn)作用,揭示熏蒸和生物菌劑對(duì)三七根際微生物群落構(gòu)建的影響,為優(yōu)化三七種植管理方法提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試植物為生長近半年的三七種苗(籽條),生防菌劑為枯芽春?(Bacillussubtilis,1×108CFU/g)、木每靈?(Trichodermaharzianum,1×108CFU/g)和熒光棒?(Pseudomonasfluorescens,5×108CFU/g),試驗(yàn)地選址在云南省文山市丘北縣樹皮鄉(xiāng)小新寨苗鄉(xiāng)三七有限公司三七種植基地(23°49′46.99′′ N, 104°06′12.99′′ E)。土壤前茬作物為菊花和烤煙,輪作時(shí)間為3年,輪作前經(jīng)歷3年完整三七種植周期,試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),土壤條件分為熏蒸地(LZ地)與非熏蒸地(PX地),處理方式分為常規(guī)管理模式(CG處理)與生物農(nóng)藥處理模式(TK處理)。LZ地使用450 kg/hm2棉隆覆膜熏蒸30 d,揭膜7 d后進(jìn)行移栽,PX地不作熏蒸;處理方式見表1。按照起壟方式種植三七,每壟3.36 m2,栽種120株三七種苗,每60壟設(shè)為1個(gè)小區(qū)作為重復(fù),每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。三七籽條于2021年7月進(jìn)行移栽,2022年1月采集80株以上三七樣品,統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)。試驗(yàn)期間不定期巡查田間,及時(shí)清除有根腐病癥狀的幼苗,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組隨機(jī)選取6壟地統(tǒng)計(jì)存活數(shù)作為評(píng)價(jià)組間防效差異的依據(jù)。

表1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 根際土壤樣品的采集

在每個(gè)小區(qū)采用五點(diǎn)取樣法,采取三七帶土根系,抖落非根際土,將根系樣品轉(zhuǎn)移至含20 mL無菌10 mmol/L PBS溶液的50 mL無菌離心管后,置于搖床震蕩20 min(120 r/min,4 ℃),使用無菌鑷子挑除離心管中的根系,剩余懸浮液離心30 min(6000 r/min,4 ℃)后去除懸浮液,收集得到2 g左右的根際土壤,置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 土壤理化性質(zhì)

在每個(gè)小區(qū)內(nèi)采用五點(diǎn)取樣法,取得根周5～15 cm深的表層土壤作為理化分析樣本。pH儀測定土壤pH;堿解擴(kuò)散法測定土壤堿解氮;火焰光度法測定土壤速效鉀;碳酸氫鈉提取法測定土壤速效磷。

1.4 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

按照DNA提取試劑盒MN NucleSpin 96 Soi得到終濃度為4～5 ng/μL的根際土壤DNA。引物合成、擴(kuò)增步驟由百邁克公司完成。以引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′) 和806R2( 5′-GGA CTACNVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)域;以引物ITS1(F5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)域。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃10 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s循環(huán)10次,72 ℃退火5 min。后續(xù)測序使用Illumina Novaseq(Illumina, San Deigo,CA)平臺(tái)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic v0.33[18]對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾,使用Usearch v10[19]進(jìn)行雙端序列憑借,使用UCHIME v4.2[20]去除嵌合體得到有效數(shù)據(jù)。使用Usearch v10在相似性97%水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類,以所有序列數(shù)的0.005%作為過濾OTUs的閾值。以SILVA[21]為參考數(shù)據(jù)使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋。利用R語言工具[22]進(jìn)行α多樣性計(jì)算、PCoA分析、RDA分析。使用STAMP[23]軟件分析組間物種顯著性差異。屬水平熱圖距離算法為eculidean,聚類算法為complete。PCoA分析距離算法為bray_curtis。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七根際土壤物種組成分析

2.1.1 物種數(shù)量分析 16S rRNA測序共獲得1200 897對(duì)序列,質(zhì)控、拼接后產(chǎn)生1198 632條有效序列,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生79 555條有效序列,共產(chǎn)生1794個(gè)OTUs。其中LZCG組有1541個(gè)OTUs,LZTK組有1470個(gè)OTUs,PXCG組有1685個(gè)OTUs,PXTK組有1663個(gè)OTUs。PXTK-PXCG共有OTU 1588個(gè),LZTK-LZCG共有OTU 1402個(gè)。PXTK-LZTK共有OTU 1343個(gè),PXCG-LZCG共有OTU 1459個(gè)。圖1-a中ITS rRNA測序共獲得 1135 553 對(duì)序列,質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生 1129 295 條有效數(shù)據(jù),每個(gè)樣品至少產(chǎn)生 40 791 條有效數(shù)據(jù),平均產(chǎn)生75 286 條有效數(shù)據(jù),共產(chǎn)生2206個(gè)OTUs。其中LZCG組有1896個(gè)OTUs,LZTK組有1698個(gè)OTUs,PXCG組有1793個(gè)OTUs,PXTK組有1837個(gè)OTUs。PXTK-PXCG共有OTU 1526個(gè),LZTK-LZCG共有OTU 1533個(gè)。PXTK-LZTK共有OTU 1439個(gè),PXCG-LZCG共有OTU 1636個(gè)。由圖1-b可知,土壤條件相同時(shí),同一處理方式下微生物種類數(shù)量上更接近;相同土壤條件下的兩個(gè)組間共有物種更多。土壤熏蒸會(huì)使三七根際土中細(xì)菌種類減少,添加生物菌劑不能改變細(xì)菌種類減少的程度。常規(guī)管理模式下熏蒸后真菌種類增加,熏蒸后添加生物菌劑會(huì)降低真菌種類。PXTK組特有細(xì)菌和真菌種類最多。

2.1.2 門水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析 門水平分類上,三七根際土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢菌群依次為變形菌門(Proteobacteria,33.17%～53.70%),酸桿菌門(Acidobacteriota,25.90%～10.71%,)放線菌門(Actinobacteriota,3.81%～13.13%),芽單胞菌門(Gemmatimonadota,7.89%～14.73%),綠彎菌門(Chloroflexi,1.93%～4.25%),粘菌門(Myxococcota,1.16%～2.72%),厚壁菌門(Firmicutes,1.08%～2.07%),擬桿菌門(Bacteroidota,0.97%～8.03%)。以上8個(gè)菌門共占細(xì)菌總數(shù)的87.29%～91.8%。熏蒸使變形菌門、放線菌門、擬桿菌門的豐度上升,同時(shí)降低芽單胞菌門、酸桿菌門的豐度,此外,Methylomirabilota在熏蒸后幾乎消失。熏蒸地添加菌劑并不能改變上述細(xì)菌門水平變化的趨勢。

圖1 不同組三七根際土壤中細(xì)菌和真菌群落OTUsFig.1 OTUs of bacterial and fungal community in rhizospere soil of P.notoginseng from different groups

門分類水平上,三七根際土壤真菌中的優(yōu)勢菌群依次為子囊菌門(Ascomycota,62.75%～64.35%),擔(dān)子菌門(Basidiomycota,18.00%～20.24%),被孢霉(Mortierellomycota,6.30%～8.40%),unclassified_fungi(3.15%～5.66%),壺菌門(Chytridiomycota,1.72%～3.55%),羅茲菌門(Rozellomycota,1.13%～1.89%),油壺菌門(Olpidiomycota,0.27%～0.93%),球囊菌門(Glomeromycota,0.05%～0.17%)。以上8個(gè)菌門共占據(jù)真菌數(shù)量總數(shù)的99.60%～99.84%。子囊菌門、擔(dān)子菌門在各組間的豐度排名為LZTK>PXCG>PXTK>LZCG。

2.1.3 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析 豐度排名前30的細(xì)菌屬水平聚類熱圖(圖2-a)顯示同一組的樣品距離接近,說明優(yōu)勢屬的物種豐度在組間的相似性更高,不同組的差異更大。土壤條件相同的組聚為一類,熏蒸使三七根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢物種組成發(fā)生明顯變化。處理方式相同土壤條件不同的兩組間,優(yōu)勢菌屬豐度排名均發(fā)生明顯變化,說明熏蒸可能對(duì)未處理前的原始細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)造成破壞,且這種破壞在采收時(shí)未能恢復(fù)至未熏蒸土的水平。

豐度排名前30的真菌屬水平熱圖(圖2-b)顯示PXCG和LZCG的土壤真菌距離較接近,兩組的組間差異也最小。其他組的樣品則不能嚴(yán)格按照分組聚類。這可能是因?yàn)槿叻N植過程中施用的化學(xué)農(nóng)藥大多是廣譜殺真菌劑,化學(xué)農(nóng)藥處理下土壤中豐度高的多為對(duì)農(nóng)藥抗性高的特定真菌物種。同樣土壤條件下,TK組中鐮刀菌、柱孢屬(Cylindrocarpon)、鏈格孢屬(Alternaira)和小不整球殼屬(Plectospaerella)的豐度均低于CG組。

2.2 三七根際土壤菌群多樣性分析

2.2.1 三七根際細(xì)菌α多樣性分析 通過計(jì)算ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)比較組間α多樣性差異(表2～3)。除LZCG組Shannon指數(shù)高于PZCG組外,處理方式相同時(shí),熏蒸使α多樣性指數(shù)均有所下降。PXTK組4個(gè)α多樣性指數(shù)在所有處理組中最高。LZCG組Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著高于LZTK組(P=0.006,0.011,0.001),PXCG組Shannon指數(shù)顯著低于PXTK組(P=0.009)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)估算群體OTU數(shù)/物種數(shù),辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)考慮物種豐度加權(quán),即考察豐富度的同時(shí)考慮物種的均勻度。處理方式相同時(shí)熏蒸處理會(huì)降低根際細(xì)菌菌群的辛普森指數(shù),PX地上TK處理能有效改善細(xì)菌群落的不均衡發(fā)展提升均勻度。相反,LZ地上TK處理使得細(xì)菌α多樣性指數(shù)有所下降。

2.2.2 三七根際真菌α多樣性分析 細(xì)菌α多樣性指數(shù)結(jié)果類似,LZTK組4個(gè)α多樣性指數(shù)均最低。LZCG和PXCG組的Chao1值數(shù)和ACE指數(shù)高于LZTK和PXTK組。PX地上TK處理的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)高于CG處理,LZ地TK處理則使真菌α多樣性指數(shù)均低于CG處理。

2.2.3 細(xì)菌Beta多樣性分析 PCoA圖(圖3-a)顯示PXTK的樣品更緊密地聚集在一起,PXCG的樣品更分散,說明在PX地上TK處理較CG處理對(duì)根系菌群有更強(qiáng)的塑造作用。LZCG組樣品更聚集,說明常規(guī)管理模式和熏蒸對(duì)土壤菌群的篩選有疊加作用,而菌劑的添加可以一定程度減緩這種作用。LZCG和LZTK、PXCG和PXTK的距離更接近,說明在PX地上處理方式不同對(duì)群落結(jié)構(gòu)造成的差異更大。不同土壤條件的樣本在PC1軸上完全區(qū)分,PC1軸解釋度為64.5%;同樣土壤條件下,TK處理與CG處理組的樣品都能在PC2軸上區(qū)分開。使用置換多元方差分析(PERMANOVA)對(duì)不分組樣品間的β多樣性是否具有顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明所有細(xì)菌樣品組間差異大于組內(nèi)差異(R=0.779),且檢驗(yàn)可信度高(P=0.001<0.05)。說明處理方式和熏蒸均對(duì)三七根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。

圖2 根際土壤細(xì)菌(a)和真菌(b)屬水平豐度Fig.2 The abundance of bacterial(a)and fungal(b) community in rhizosphere soil at genus level

表2 三七根際土壤細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

表3 三七根際土壤真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

圖3 基于OTU水平三七根際土壤細(xì)菌群落PCoA分析(a)和真菌群落PLS-DA分析(b)Fig.3 PCoA analysis of bacterial communities(a)and PLS-DA analysis of fungal community(b) based on OTU levels in rhizosphere soils of P.notoginseng

2.2.4 真菌Beta多樣性分析 基于OTU水平的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)結(jié)果(圖3-b)顯示不同組的真菌群落存在明顯差異。其中LZCG組最緊密,組內(nèi)差異小。LZCG與PXCG、PXCG與PXTK在component2(10.42%)軸和component3(9.16%)軸上均能完全區(qū)分開。PXCG與PXTK、LZCG與LZTK 在componet1(13.4%)軸上距離較遠(yuǎn)。菌劑和熏蒸劑均能在一定程度上解釋三七真菌群落組成的改變。

2.3 多級(jí)物種差異分析

2.3.1 熏蒸地上處理方式不同造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出熏蒸地上處理方式不同造成顯著差異的微生物。由圖4-a可知,LZCG組顯著富集Vicinamibacterales,芽單胞桿菌目(Gemmatimonadales)以及該目下的芽單胞桿菌科(Gemmatimonadaceae)和黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)的部分屬。生物菌劑顯著富集微球菌目(Micrococcales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales),以及上述3個(gè)目下的微球菌科(Micrococcaceae)、伯克氏科(Burkholderiaceae)、鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)。

圖4-b顯示LZCG顯著富集17個(gè)屬的真菌,主要集中在傘菌亞門(Agaricomycetes)、盤菌亞門(Eurotiomycetes)以及油壺菌目(Olpidiales)。在LDA>3.0的水平下,沒有找到LZTK的關(guān)鍵物種。

圖4 多級(jí)分類水平下LZCG-LZTK組間細(xì)菌(a)和真菌(b)LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZCG and LZTK at multi-level classification

2.3.2 非熏蒸地上處理方式不同造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出非熏蒸地上處理方式不同造成顯著差異的微生物。由圖5-a可知,TK處理后起關(guān)鍵作用的細(xì)菌物種有伯克氏菌目、Pyrinpmonadales及該目下的Pyrinomonadaceae;CG處理的關(guān)鍵細(xì)菌物種集中在酸桿菌目(Acidobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)和芽單胞菌菌屬(Gemmatimonas)。

圖5-b顯示CG處理顯著富集的真菌物種種類較多且彼此親緣關(guān)系較遠(yuǎn),包括鏈格孢屬、鐮刀屬、叢赤殼科、小不整球殼屬、Staphylotrichum等病原菌屬和Chaetpmiaceae、曲霉屬(Aspergillus)等益生菌。PXTK組顯著富集的真菌物種親緣關(guān)系較分散,包括Tubefiaceae、酵母科(Saccharomycetaceae)、絲膜菌科(Cortinariaceae)以及Kazachstania、黏滑菇屬(Hebeloma)等。

2.3.3 常規(guī)管理模式下熏蒸造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出常規(guī)管理模式下熏蒸造成的顯著差異物種。圖6-a顯示,LZ地上富集的細(xì)菌物種集中在放線菌目(Actinomycetales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、Rhodanobacteraceae、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)。PX地上顯著富集酸桿菌目(Acidobacteriales)、Vicinamibacterales、芽單胞菌目(Rokubacteriales)以及屬于上述目下的芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、SC_I_84、unculured_Firmicutes_bacterium。

圖6-b顯示,LZ地顯著富集的真菌物種集中在刺盾炱目(Chaetothyriales)、油壺菌科(Olpidiaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、絲膜菌科,以及屬水平上的黏滑菇屬、亡革菌屬(Thanatephorus)、油壺菌屬等。PX地顯著富集的真菌物種有肉膜菌目(Helotiales)、Rhizophydiales、糞殼菌目(Sordariales)、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)以及屬水平上的紅曲霉屬(Monascus)、Gorgonomyces。

2.3.4 生物菌劑處理下熏蒸造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出施加菌劑的管理模式下熏蒸造成的顯著差異物種。由圖7-a可知,同為TK處理,不同土壤條件下的關(guān)鍵細(xì)菌物種與同為CG處理時(shí),不同土壤條件下的關(guān)鍵細(xì)菌物種相似。不同的是,LZTK還對(duì)微球菌科(Micrococcaceae)、鞘脂桿菌科(Sphingobacteriaceae)有富集作用。PXTK還對(duì)硝化螺旋科(Nitrosporaceae)、硝化螺旋屬(Nitrospira)有富集作用。

圖5 PXCG-PXTK組間細(xì)菌(a)和真菌(b)LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of bacteria and fungi between PXCG and PXTK at multi-level classification

圖6 LZCG-PXCG組間細(xì)菌和真菌LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZCG and PXCG at multi-level classification

圖7 LZTK-PXTK組間細(xì)菌和真菌LEfSe分析Fig.7 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZTK and PXTK at multi-level classification

表4 土壤理化性質(zhì)

圖7-b顯示,LZTK僅對(duì)unclassified_Clavicipitaceae有富集作用。2.3.1項(xiàng)下沒有計(jì)算出LZTK的關(guān)鍵物種,說明TK處理對(duì)LZ地上真菌的篩選和富集作用不明顯。PXTK顯著富集的真菌物種集中在球囊菌目(Glomerales)、Sporidioboales、unclassified_Agaricomycetes、白粉菌目(Erysiphales)、柔膜菌目以及這些目下部分科屬。

2.4 三七土壤微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性

由表4可知,除PXTK組AP含量略高于PXCG組,當(dāng)土壤條件一致時(shí),生物菌劑的施用均促進(jìn)三七對(duì)營養(yǎng)元素的吸收。處理方式一致時(shí),熏蒸降低土壤pH和有效氮的含量。不同土壤條件下,生物菌劑的添加對(duì)AP和AK的影響沒有表現(xiàn)出一致的規(guī)律。

圖8顯示黃色桿菌科未分類屬和芽單胞菌桿菌屬與AP和AK正相關(guān),Vicinamibacter和unclassified_Vicinamibaceraceae與pH正相關(guān),與AN呈正相關(guān)的有芽單胞桿菌科,與AN呈負(fù)相關(guān)的有羅河桿菌屬(Rhodanobacter)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)。pH與PXTK的細(xì)菌群落正相關(guān),與LZCG和LZTK負(fù)相關(guān)。所有環(huán)境因子中,pH對(duì)細(xì)菌群落的影響最大,AN對(duì)細(xì)菌群落的影響最小。

圖9顯示與AP正相關(guān)性最強(qiáng)的是青霉屬(Penicillium);與AK正相關(guān)的有曲霉屬、鐮刀屬和unclassified_Agaricomycetes;與pH和AN正相關(guān)的有unclassified_Basidiomycota,Cladpsphaerina。pH對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性最強(qiáng),其中PXTK的真菌群落與pH呈正相關(guān)。

圖8 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落RDA分析 Fig.8 Redundant analysis of soil environmental factor and soil bacterial community

2.5 三七根際土壤真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為80,邊數(shù)量為452,模塊性為0.319。圖10顯示相關(guān)性排名前50的屬之間,互相促進(jìn)關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)是抑制關(guān)系的10倍之多,這可能導(dǎo)致了部分共生網(wǎng)絡(luò)更發(fā)達(dá)的物種獲得競爭優(yōu)勢不斷積累,例如三七根腐病病原菌所在的鐮刀屬、鏈格孢屬、土赤殼屬(Ilyonectria)以及叢赤殼科等。種間促進(jìn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)過多往往不利于菌群的平衡,且更容易受到病原菌的侵襲[24],這可能也是三七連作過程中土壤逐漸從“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)向“真菌型”的原因之一。

圖9 土壤理化性質(zhì)與真菌群落RDA分析Fig.9 Redundant analysis of soil environmental factor and soil bacterial community

2.6 三七生長狀況和根腐病發(fā)生情況

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組三七主要農(nóng)藝性狀見表5。熏蒸能夠提高莖高和全根重。同樣土壤條件下施加生物菌劑增加了剪口的重量同時(shí)對(duì)主根重量沒有影響,其中PXTK組的剪口重量顯著高于LZCG組。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)PXTK、PXCG、LZCG、LZTK各組的三七植株存活率分別為70.7%、77.8%、75.4%、84.2%。施加生防菌劑和熏蒸都能提高根腐病的防效,其中LZTK組的存活率最高。

圓圈大小代表平均豐度大小,邊的粗細(xì)代表相關(guān)性強(qiáng)弱,橙色代表正相關(guān),綠色代表負(fù)相關(guān)(P<0.05)。The size of the circles represents the average abundance of species; The thickness of the edges represents the strength of correlation and the orange color represents positive correlation while green represents negative correlation(P<0.05).圖10 三七根際土壤真菌間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)Fig.10 Correlation network of soil fungi in rhizosphere of P.notoginseng

表5 三七生長狀況

3 討 論

土傳病害的發(fā)生和根際微生物群落多樣性密切相關(guān),通常微生物群落多樣性高,群落之間均衡發(fā)展的土壤中,土傳病原菌較少[25]。生物菌劑的引入往往可以增加微生物的多樣性,補(bǔ)償性地改變病原菌積累對(duì)土著微生物的變化[26]。PXTK組在所有組中細(xì)菌α多樣性指數(shù)均最高,以往的研究證實(shí)連作模式下三七根際土壤細(xì)菌α多樣性逐年下降[27]。棉隆熏蒸會(huì)顯著降低細(xì)菌α多樣性,這與前人研究結(jié)果一致[28]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)熏蒸會(huì)增加真菌物種豐富度,而三七根際真菌的豐富度與幼苗移栽后的死亡率顯著正相關(guān)[29]。真菌均勻度的降低,導(dǎo)致群落間的平衡性打破,將會(huì)影響土壤健康,使根腐病發(fā)生率上升[30]。PX地上菌劑的添加能夠有效增加真菌群落的均勻度,但LZ地上添加菌劑未能出現(xiàn)一致的結(jié)果。

同樣處理方式下,LZ地pH顯著降低。土壤酸化有利于三七根腐病病原菌的生長,是三七連作障礙的誘因之一[8]。土壤pH與三七籽條移栽后的存活率呈正相關(guān)[31],與根腐病的發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)[32]。RDA分析顯示pH與群落之間的相關(guān)性最大,熏蒸顯著降低了土壤pH,PXTK組pH最高。本試驗(yàn)選擇的生物菌也是常見的根際促生菌(PGPR),可通過溶磷、固氮、影響植物激素分泌、誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等方式直接或間接提高作物產(chǎn)量[33-34]。試驗(yàn)結(jié)果顯示土壤條件一致時(shí),除了PXTK組AK含量與PXCG組相近,TK處理后的土壤有效氮、速效鉀、速效磷含量均低于CG組。氮元素富集是三七種植過程中的常見問題,高濃度氮肥會(huì)提高鐮刀菌屬和鏈格孢屬的豐度,同時(shí)降低芽孢桿菌和假單胞菌屬的豐度[35],且會(huì)抑制三七的光合作用導(dǎo)致減產(chǎn)[36-37]。威百畝通過在土壤中降解為異氰酸甲酯發(fā)揮熏蒸滅菌作用,與棉隆的抗菌機(jī)制相同。前人研究發(fā)現(xiàn)威百畝會(huì)影響具有氮礦化等轉(zhuǎn)化能力的土壤功能菌數(shù)量,從而妨礙氮循環(huán)過程[38]。楊馥霞等[39]發(fā)現(xiàn)熏蒸后土壤中具有固氮能力的慢生根瘤菌顯著下降,熏蒸后應(yīng)當(dāng)補(bǔ)充益生菌和氮肥。本試驗(yàn)LZCG組中慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)的豐度較PZCG下降78.7%。威百畝、棉隆還會(huì)抑制反硝化菌從而進(jìn)一步加深氮素累積[40-41]。相比PXCG組,硝化螺旋門(Nitrospirales)、硝化螺旋屬在PXTK組中顯著富集,且單因素方差分析顯示其含量顯著高于LZTK組,說明菌劑在土著菌群中的投入有利于維持三七土壤生態(tài)中氮元素的平衡。但本試驗(yàn)田測得堿解氮的含量均低于云南地區(qū)三七種植地堿解氮的平均值(142.58 mg/kg),而氮元素含量與三七塊根和根條總皂苷含量正相關(guān)[42]。處理方式一致時(shí)土壤熏蒸均降低有效氮含量,是否應(yīng)當(dāng)在生產(chǎn)中補(bǔ)充氮元素缺失以避免藥材有效成分的損失有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。同樣的處理?xiàng)l件,黃色桿菌科在連作地的豐度均顯著提高,而同為連作地,黃色桿菌科則是農(nóng)藥處理組的關(guān)鍵物種。種植三七對(duì)土壤全磷有富集作用,且全磷含量與速效磷含量正相關(guān)[8],三七根際黃色桿菌科的豐度與磷元素正相關(guān)[43]。黃色桿菌屬常被視為益生菌屬,小米的產(chǎn)量與其在根際的豐度呈正相關(guān)[44],有研究認(rèn)為病原真菌的增多能刺激植物茉莉酸通路進(jìn)而誘導(dǎo)黃單胞菌(Xanthomona)在根際的富集從而使植物抗病性增強(qiáng)[45]。

棉隆與常規(guī)管理模式下預(yù)防三七根腐病的廣譜殺真菌劑——福雙美、代森錳鋅、丙森鋅等[46]同屬于二硫代氨基甲酸酯類化合物,這可能會(huì)加劇熏蒸后部分對(duì)此類農(nóng)藥耐受性強(qiáng)的優(yōu)勢菌屬的積累,使得菌群結(jié)構(gòu)更為失衡。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同處理LZ地高豐度真菌物種高度一致,這些物種在LZCG和PXCG中的豐度高于LZTX和PXTK。其中曲霉屬對(duì)鐮刀菌屬、鏈格孢菌屬、土赤殼屬等病原菌有較強(qiáng)的正相關(guān)性,從而成為加劇根腐病發(fā)生的隱患。LEfSe分析顯示對(duì)比LZCG-LZTK、LZCG-PXCG,LZCG均顯著富集鞘氨醇單胞屬或鞘氨醇單胞菌科。鞘氨醇單胞屬易于在連作地患病三七的根際富集,常被視為潛在的根腐病病原菌[27]。Wei等[47]通過LEfSe分析觀察到孢腔菌科(Pleosporaceae)易在三七銹腐病根際土顯著富集,Pyronemataceae、Xenopolyscytalum在健康三七根際土顯著富集。PX地上施加菌劑顯著降低了孢腔菌科的豐度,同時(shí)顯著升高了Pyronemataceae、Xenopolyscytalum的豐度。Eo等[48]發(fā)現(xiàn)毀滅柱孢菌(C.decstructans)對(duì)棉隆有較高的耐受性,本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)LZCG與PXCG中柱孢屬的豐度接近,而其在PXTK的豐度僅為PXCG的1/10。此外,同樣土壤條件下TK處理均能顯著提升假單胞菌屬的豐度,但木霉菌和芽孢桿菌的豐度增加沒有顯著性。益生菌劑的生物效果可能并非通過增加所選益生菌豐度,而是通過提升土著菌群網(wǎng)絡(luò)整體的抑病能力和群落恢復(fù)能力發(fā)揮生物效果[49]。PXTK組提高了其他益生菌豐度。比如溶桿菌(Lysobacter)、伯克霍爾德菌等。溶桿菌對(duì)多種病原真菌、卵菌、細(xì)菌、線蟲均具有溶菌活性[50]。伯克氏菌科能夠抑制毀滅柱孢生長并講解三七自毒物質(zhì)[51]。

由于熏蒸劑對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的破壞,病原菌二次感染率高是熏蒸劑防控效果差的主要原因[52],添加生物菌劑形成抑病區(qū)系往往能彌補(bǔ)其不足。張慶華等[53]發(fā)現(xiàn)熏蒸+生物菌肥處理抑制草莓病原菌屬的同時(shí)可以增加部分有益菌并使微生物多樣性恢復(fù)更快。楊柳等[54]也認(rèn)為,棉隆熏蒸配施水肥菌可以降低初侵染來源并增加益生菌定殖率從而使得大棚番茄綜合發(fā)病率極大的下降。然而熏蒸后添加生物菌并非一定起到增加抑病能力的效果。張立彭等[55]發(fā)現(xiàn),威百畝和棉隆不能緩解百合連作障礙,熏蒸加益生菌劑對(duì)比單獨(dú)熏蒸可以提高百合根系活力,但對(duì)百合增產(chǎn)的作用尚不及單獨(dú)使用菌劑。這可能由于熏蒸劑對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)功能的改變影響了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,且微生物多樣性很難恢復(fù)到原來水平[56]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,PXTK與LZTK微生物群落結(jié)構(gòu)的組成更接近,但熏蒸并沒有增加生物菌劑對(duì)微生物多樣性改變的作用。菌劑的施加在不影響三七地下重量的同時(shí)能夠降低根腐病的發(fā)生,熏蒸后添加菌劑的管理模式有增加三七連作地抑病能力的潛能。

4 結(jié) 論

相較常規(guī)管理模式,在非熏蒸地上施用生物菌劑可以提高三七根際細(xì)菌群落α多樣性和真菌群落均勻度。施用生物菌劑可以抑制棉隆熏蒸對(duì)真菌群落豐富度的提升,但不能改善熏蒸降低根際土壤細(xì)菌群落的豐富度和均勻度的效果。生物菌劑處理降低三七病原菌相對(duì)豐度的同時(shí)增加部分益生菌屬的豐度,對(duì)菌群結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的塑造能力,并能調(diào)節(jié)三七種植過程中造成的土壤營養(yǎng)元素失衡和土壤酸化問題。