腺苷A3受體對(duì)淺筋膜成纖維細(xì)胞cAMP/Epac信號(hào)通路及炎癥因子表達(dá)的影響*

崔艷茹， 許經(jīng)萍， 可紅， 席超， 徐尚呈， 杜紅， 屈飛

（江西中醫(yī)藥大學(xué)， 江西 南昌 330004）

中醫(yī)經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)作為針灸治療的理論基礎(chǔ)，具有運(yùn)行氣血、連接全身臟腑表里的功能，現(xiàn)有醫(yī)學(xué)技術(shù)和解剖學(xué)研究并不能完全闡述經(jīng)絡(luò)的實(shí)質(zhì)。筋膜從表到里依次為真皮層、淺筋膜、深筋膜、內(nèi)臟筋膜[1]，是一個(gè)全身連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)，貫穿并包圍所有器官、肌肉、骨骼和神經(jīng)纖維，被認(rèn)為是單一的器官，統(tǒng)一的整體，與人類(lèi)生理學(xué)的各個(gè)方面都有聯(lián)系[2]。白宇等[3]通過(guò)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)絡(luò)的實(shí)質(zhì)是全身非特異性結(jié)締組織所構(gòu)成的筋膜支架，筋膜作為支撐、營(yíng)養(yǎng)和儲(chǔ)備系統(tǒng)遍布全身，其位置和走形與經(jīng)絡(luò)相似，穴位則為筋膜上能夠被刺激產(chǎn)生生物信息的位置。

淺筋膜分布著大量的穴位，成纖維細(xì)胞作為淺筋膜中最主要的細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖能力，參與組織修復(fù)的過(guò)程，是經(jīng)絡(luò)腧穴主要的感受性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞，在針刺力的信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要意義[4]。

針刺鎮(zhèn)痛主要和調(diào)控炎癥有關(guān)，cAMP、Epac在炎癥反應(yīng)中扮演了重要角色[5]。研究發(fā)現(xiàn)，針刺可通過(guò)降低ERK1/ERK2 下游轉(zhuǎn)錄因子cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的DNA 結(jié)合活性，減輕炎癥反應(yīng)和緩解疼痛，治療炎癥性疼痛大鼠[6]。針刺可通過(guò)降低cAMP 激活的交換蛋白Epac1 和Piezo2 的表達(dá)減輕炎癥后腸易激綜合征的機(jī)體的超敏反應(yīng)[7]。針刺可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1 的表達(dá)，治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型[8]。

文獻(xiàn)報(bào)道，針刺可引起穴位區(qū)腺苷釋放[9]，腺苷可作為一種工具藥，作用于穴位區(qū)，起到類(lèi)似針刺的作用[10]，其作用機(jī)制尚不明確。本課題組致力于研究淺筋膜中腺苷A3 受體（adenosine A3 receptor,A3R）途徑在針刺鎮(zhèn)痛中作用機(jī)制，前期研究發(fā)現(xiàn)A3R 在痛覺(jué)傳導(dǎo)通路中的脊髓、腦干、丘腦、大腦皮層均有廣泛表達(dá)，在足三里淺筋膜、腹股溝中點(diǎn)處、腹膜淺筋膜亦有分布；針刺足三里淺筋膜可以激活A(yù)3R 參與針刺鎮(zhèn)痛，其針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與上調(diào)Ras/MAPK 途徑、下調(diào)cAMP/Epac 途徑有關(guān)[11-12]。成纖維細(xì)胞是淺筋膜中最主要的細(xì)胞，本文設(shè)計(jì)腺苷干預(yù)成纖維細(xì)胞，觀察成纖維細(xì)胞中A3R 表達(dá)，以期明確腺苷鎮(zhèn)痛是否與成纖維細(xì)胞中A3R 表達(dá)有關(guān)。前期主要從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明A3R 與針刺鎮(zhèn)痛的關(guān)系，筆者發(fā)現(xiàn)腺苷A3 受體可介導(dǎo)針刺鎮(zhèn)痛，影響cAMP/Epac 信號(hào)通路。本研究從體外實(shí)驗(yàn)出發(fā)，探討siRNA 轉(zhuǎn)染淺筋膜中的成纖維細(xì)胞通過(guò)沉默A3R對(duì)cAMP/Epac 信號(hào)通路和炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠10 只，體重（200±20）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2017-0004]。

1.1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000（型號(hào)：11668-027）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，Vimentin（貨號(hào)：ab92547）、AKA（貨號(hào)：ab134923）、CD45（貨 號(hào)：ab10558）、cAMP（貨號(hào)：ab76238）、Epac（貨號(hào)：ab109415）均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，F(xiàn) Ⅷ（貨號(hào)：NB100-91761）購(gòu)自美國(guó)Novusbio 公司，YBR Green PCR 試劑盒（貨號(hào)：KM4101）購(gòu)自美國(guó)Novusbio 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：639505）購(gòu)自日本TaKaRa 株式會(huì)社，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。IL-6（貨號(hào)：AD3249Ra）和TNF-α（貨號(hào)：AD3238Ra）購(gòu)自美國(guó)Andygene 公司。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)311）購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，熒光倒置顯微鏡（型號(hào)IX53）購(gòu)自日本Olympus 株式會(huì)社，離心機(jī)（Centrifuge 5424R 型）購(gòu)自德國(guó)Eppend 公司，熒光定量PCR 儀、水平電泳設(shè)備（型號(hào)DYC-31D）、凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)Universal Hood Ⅱ型）和電泳儀（型號(hào)mini protean 3 cell）購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)MK3）購(gòu)自芬蘭雷勃公司，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（型號(hào)Tanon-5200）購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠淺筋膜成纖維細(xì)胞的原代分離 在無(wú)菌的條件下獲取大鼠淺筋膜組織，并去除腹膜上的脂肪組織和血管，將組織切為1 mm×1 mm×1 mm 的小方塊置于DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃水浴搖床消化，將收集的細(xì)胞以1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基（1%三抗+ 10%胎牛血清+ 89%DMEM）重懸細(xì)胞，置于37 ℃、5% 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，48 h 換液，每隔2～3 d 換1 次液。待細(xì)胞長(zhǎng)至85%左右時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行傳代（1∶3 傳代），顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 腺苷預(yù)處理細(xì)胞并分為Control組、10 nmol/L組、100 nmol/L組、10 μmol/L組和100 μmol/L組，均培養(yǎng)48 h。腺苷siRNA 干擾實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為對(duì)照組、腺苷組、A3R 干擾組、空載組。轉(zhuǎn)染前1 d 將0.5×105～2.0×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于24 孔板，A3R 干擾組添加2 μL siRNA-A3R（20 μmol/L）、空載組添加2 μL siRNA-NC（20 μmol/L）用來(lái)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞在培養(yǎng)箱孵育6 h 后換上維持液，培養(yǎng)48 h。對(duì)照組不予任何處理，腺苷組用10 μmol/L 腺苷濃度，培養(yǎng)48 h。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)淺筋膜成纖維細(xì)胞Vimentin、CD45、FⅧ、AKA、ICAM-1表達(dá) 將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗2 次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，再將細(xì)胞置于0.5% Triton X-100 室溫通透20 min，用5%胎牛血清蛋白37℃封閉1 h，封閉完成后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。用PBS洗滌一抗3次，再加入二抗，37 ℃孵育1 h，用PBS 洗滌3 次，洗去多余的二抗。再加少量抗熒光淬滅封片液[含4′， 6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）]，覆蓋住樣品，置于熒光顯微鏡下觀察，將同一位置的2張熒光圖片重疊為Merge圖。

1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞以0.5×105～2.0×105個(gè)/孔密度接種于24孔中，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90%～95%。準(zhǔn)備2種復(fù)合物，第1種是將0.8 μg DNA稀釋于50 μL Opti-MEM中形成的復(fù)合物；第1種將2 μL Lipofectamine 2000 稀釋于50 μL Opti-MEM 形成的復(fù)合物，室溫孵育5 min，再將第2種復(fù)合物緩慢加入第1種中，繼續(xù)室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)孔中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育6 h，48 h后檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入基因表達(dá)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)cAMP、Epac mRNA表達(dá) 用TRIzol 提取總RNA，再將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄樣本置于-20 ℃冰箱冷凍保存，將制備好的cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，56℃退火10 s，72 ℃拉伸25 s，39個(gè)循環(huán)后65 ℃拉伸5 s，95 ℃再變性50 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算cAMP、Epac mRNA相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.6 Western blotting 檢測(cè)A3R、cAMP、Epac 蛋白表達(dá) 將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，吸出培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 洗3 次，加入裂解液，4 ℃充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞刮入1.5 mL EP 管中，95 ℃以上加熱10 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，制備8%、12%的分離膠，每孔上樣量為10 μg，電泳1.5 h、轉(zhuǎn)膜50 min、將膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入A3R、cAMP、Epac 抗體，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBST 洗滌3 次，再將膜置于1∶10 000 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗中，室溫孵育1 h，再用TBST 洗滌3 次，電化學(xué)發(fā)光法化學(xué)顯色，用TANON GIS 軟件分析條帶的灰度值。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)上清液IL-6、TNF-α水平 將細(xì)胞以0.5×105～2.0×105個(gè)/孔接種于24孔板，進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染。在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集上述各孔培養(yǎng)上清液，采用ELISA 檢測(cè)上清液IL-6、TNF-α 水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處吸光度值，計(jì)算IL-6、TNF-α 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淺筋膜成纖維細(xì)胞的分離鑒定

鏡下成纖維細(xì)胞呈梭形（見(jiàn)圖1）。Vimentin 為Ⅲ型中間絲蛋白，主要表達(dá)于中胚層起源的間充質(zhì)細(xì)胞中，在成纖維細(xì)胞中大量分布，可作為成纖維細(xì)胞的標(biāo)志。免疫熒光結(jié)果顯示，Vimentin 陽(yáng)性，F(xiàn)Ⅷ，CD45、AKA 陰性（見(jiàn)圖2）。

圖1 淺筋膜成纖維細(xì)胞

圖2 淺筋膜成纖維細(xì)胞Vimentin、CD45、FⅧ、AKA表達(dá) （免疫熒光染色）

2.2 各組A3R蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Control 組、10 nmol/L 組、100 nmol/L 組、10 μmol/L組和100 μmol/L 組A3R 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.24±0.01）、（0.29±0.02）、（0.36±0.02）、（0.41±0.02）和（0.45±0.02），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=166.700，P=0.000）；進(jìn)一步組間兩兩比較，100 μmol/L 組高于其他4 組（P＜0.05），10 μmol/L組高 于Control 組、10 nmol/L 組、100 nmol/L 組（P＜0.05），100 nmol/L 組高于Control 組、10 nmol/L 組（P＜0.05），10 nmol/L 組高于Control 組（P＜0.05），表明腺苷預(yù)處理可劑量依賴(lài)性地上調(diào)A3R 蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組A3R蛋白條帶圖

對(duì)照組、腺苷組、A3R 干擾組、空載組A3R 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.37±0.05）、（0.65±0.07）、（0.15±0.03）和（0.64±0.05），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=64.270，P=0.000）；進(jìn)一步組間兩兩比較，腺苷組高于對(duì)照組（P＜0.05），A3R 干擾組低于腺苷組（P＜0.05），但空載組與腺苷組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明腺苷siRNA干擾可下調(diào)A3R蛋白表達(dá)，而空載組并無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖4。

圖4 各組A3R蛋白條帶圖

2.3 各組cAMP、Epac mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、A3R 干擾組、空載組cAMP、Epac mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步組間兩兩比較，A3R 干擾組均高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組cAMP、Epac mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組cAMP、Epac mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別cAMP mRNA Epac mRNA對(duì)照組A3R干擾組空載組F 值P 值1.00±0.00 2.87±0.04 0.78±0.09 71.810 0.000 1.00±0.00 6.51±0.72 1.03±0.16 165.900 0.000

2.4 各組cAMP、Epac蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、A3R 干擾組、空載組cAMP、Epac 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步組間兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，A3R 干擾組高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表4 和圖5。

表4 各組cAMP、Epac蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 各組cAMP、Epac蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別cAMP蛋白Epac蛋白對(duì)照組A3R干擾組空載組F 值P 值0.35±0.04 0.52±0.04 0.32±0.04 24.930 0.001 0.41±0.04 0.57±0.04 0.41±0.03 18.820 0.003

圖5 各組cAMP、Epac蛋白條帶圖

2.5 各組IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、A3R 干擾組、空載組IL-6、TNF-α 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步組間兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，A3R 干擾組高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表5 和圖6。

表5 各組IL-6、TNF-α水平比較 （pg/mL， ±s）

表5 各組IL-6、TNF-α水平比較 （pg/mL， ±s）

組別IL-6 TNF-α對(duì)照組A3R干擾組空載組F 值P 值39.32±6.61 136.64±13.48 37.40±4.70 117.100 0.000 73.49±1.31 198.66±1.66 98.22±42.97 21.370 0.002

圖6 siRNA干擾A3R表達(dá)對(duì)ICAM-1表達(dá)的影響

3 討論

針刺鎮(zhèn)痛機(jī)制具有多樣性，復(fù)雜性，矛盾性等特點(diǎn)，大多研究主要是從神經(jīng)機(jī)制主導(dǎo)來(lái)闡述，如中樞神經(jīng)傳導(dǎo)、中樞神經(jīng)遞質(zhì)、免疫學(xué)炎癥因子參與針刺鎮(zhèn)痛[13-14]。在慢性壓迫性損傷疼痛模型中，電針可以通過(guò)增強(qiáng)脊髓中強(qiáng)啡肽的表達(dá)，提高脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞上κ 阿片受體mRNA 表達(dá)，來(lái)抑制Toll 樣受體4 的疼痛信號(hào)傳導(dǎo)[15]。也有一部分學(xué)者認(rèn)為，筋膜結(jié)締組織和局部的生化改變也可介導(dǎo)針刺鎮(zhèn)痛機(jī)制。筋膜作為一種膠原纖維結(jié)締組織，具有支持和儲(chǔ)備功能，其在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)與中醫(yī)經(jīng)絡(luò)相似，而且結(jié)締組織平面與經(jīng)絡(luò)、穴位和針刺鎮(zhèn)痛機(jī)制密切相關(guān)[16]，陳德成等[17]提出可以找到肌筋膜激痛點(diǎn)，針刺至皮下淺筋膜處留針，通過(guò)主動(dòng)運(yùn)動(dòng)來(lái)進(jìn)行針灸治療。

成纖維細(xì)胞作為穴位感受器，能對(duì)刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的生化信號(hào)。針刺作為一種傷害性機(jī)械性刺激，通過(guò)提插捻轉(zhuǎn)等手法形成力學(xué)信號(hào)，引起筋膜結(jié)締組織發(fā)生形變，作用到對(duì)刺激敏感的成纖維細(xì)胞，激活細(xì)胞，引起細(xì)胞發(fā)生變異，如突起、周長(zhǎng)和橫截面積的改變，通過(guò)換能將細(xì)胞表面的信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)生化信號(hào)途徑，最終將生化信號(hào)轉(zhuǎn)化為針刺效應(yīng)[4]。陳波等[18]發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中，給予筋膜中成纖維細(xì)胞壓力刺激，能使細(xì)胞回縮、間隙增大和形態(tài)縮小。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，體外壓力刺激可以上調(diào)A3R，激活MAPK 信號(hào)通路，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞腺苷的表達(dá)增加，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[19]。壓力刺激可能會(huì)激發(fā)和提高穴位處的筋膜成纖維細(xì)胞的活力[20]。由此可見(jiàn)，筋膜中的成纖維細(xì)胞可能介導(dǎo)力學(xué)傳導(dǎo)，影響針刺效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，腺苷siRNA 干擾可下調(diào)A3R 表達(dá)，提示筋膜中的成纖維細(xì)胞的A3R 可能參與針刺鎮(zhèn)痛的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)淺筋膜成纖維細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度腺苷干預(yù)，結(jié)果顯示，腺苷可劑量依賴(lài)性地上調(diào)成纖維細(xì)胞A3R 表達(dá)，提示腺苷可能通過(guò)A3R 發(fā)揮作用，那么成纖維細(xì)胞A3R 表達(dá)增加的意義值得探討。

鐘歡等[21]提出針刺可以治療大鼠慢性萎縮性胃炎，下調(diào)COX-2、IL-6、IL-8 水平。鄭倩華等[22]發(fā)現(xiàn)在膝骨性關(guān)節(jié)炎模型中，針刺可以降低IL-6、Chemerin表達(dá)，提示針刺可能具有抗炎作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Epacs 在炎癥的產(chǎn)生增強(qiáng)中起著至關(guān)重要的作用[23]。炎癥損傷引起感覺(jué)細(xì)胞中Epac 表達(dá)大幅升高。在炎癥性損傷后，PGE2 通過(guò)激活PKA 和Epac-PKC 產(chǎn)生增強(qiáng)的痛覺(jué)過(guò)敏，cAMP/Epac 可以增強(qiáng)炎癥后PGE2介導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏，對(duì)炎癥疼痛有著關(guān)鍵作用。在由皮膚肌肉切開(kāi)牽拉誘導(dǎo)的CPSP 大鼠模型中，鞘內(nèi)注射Epac1 抑制劑CE3F4 可明顯抑制皮膚肌肉切開(kāi)牽拉誘導(dǎo)的機(jī)械性異常和脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，表明脊柱Epac1 介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能有助于緩解慢性術(shù)后疼痛，抑制Epac1 可以有效預(yù)防CPSP，提示cAMP/Epac 可能參與炎癥的調(diào)節(jié)[24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，A3R 途徑的激活可以下調(diào)cAMP/Epac 通路，在針刺前注射A3R 激動(dòng)劑IBMECA 可進(jìn)一步下調(diào)cAMP、Epac 表達(dá)，A3R 拮抗劑Reversine 可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾下調(diào)A3R 表達(dá)后，cAMP、Epac 表達(dá)上調(diào)，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A3R 途徑激活可能有利于改善炎癥疼痛，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA 干擾A3R 表達(dá)后，IL-6、TNF-α 表達(dá)上調(diào)，提示沉默的A3R 途徑可能不利于炎癥疼痛，與上調(diào)淺筋膜成纖維細(xì)胞的cAMP/Epac 信號(hào)通路有關(guān)；針刺可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，這可能與針刺激活A(yù)3R，下調(diào)cAMP/Epac 通路，降低炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，結(jié)合前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺可能通過(guò)激活A(yù)3R 途徑，下調(diào)cAMP/Epac 通路，降低IL-6、TNF-α 表達(dá)，起到抗炎鎮(zhèn)痛作用。