誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在兒童遺傳性疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)展

謝欣 綜述，尹曉娟 審校

1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)部，北京 100700；3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院兒科，海南 三亞 572000

體細(xì)胞可經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的共同表達(dá)恢復(fù)多能狀態(tài)，由此產(chǎn)生的細(xì)胞稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［1］。iPSCs 能從3 個(gè)胚層（內(nèi)胚層、外胚層和中胚層）分化為所有類型的細(xì)胞［2］，在各系統(tǒng)疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景。任何一種活體細(xì)胞均可重編程為iPSCs，但至今尚無(wú)用于制造iPSCs 的首選體細(xì)胞。既往自體干細(xì)胞均是通過(guò)有創(chuàng)性方法獲得，如骨髓穿刺、抽脂術(shù)或侵入性血液采集［3］；目前，還可通過(guò)皮膚穿刺活檢、頭發(fā)、尿液及外周血樣本等微創(chuàng)技術(shù)獲取自體細(xì)胞［4］。由于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是從異體未植入的胚泡中分離獲得，存在不可避免的倫理問(wèn)題，且這種異體來(lái)源的細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞替代治療時(shí)，移植入患者體內(nèi)可能引起免疫排斥反應(yīng)［5］。iPSCs 源于患者自體細(xì)胞，避免了倫理問(wèn)題及免疫排斥帶來(lái)的影響。因此，iPSCs 在醫(yī)療應(yīng)用上比ESCs 更具優(yōu)勢(shì)。本文就基因重編程技術(shù)、iPSCs 的疾病模型及其在兒童遺傳性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述，以期為iPSCs 在各種遺傳性疾病機(jī)制及治療方法研究中的應(yīng)用提供參考。

1 基因重編程

1.1 基因重編程的分類 重編程方法分為整合和非整合兩種。整合重編程方法是通過(guò)整合病毒載體，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在體細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OCT3／4、SOX2、c-Myc和KLF4，從而使體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs［6］。整合方法由于基因組整合可導(dǎo)致體細(xì)胞染色體發(fā)生插入突變及病毒殘留［7］，且使用原癌基因c-Myc進(jìn)行基因再激活可能增加轉(zhuǎn)基因源性腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)［6］。非整合重編程方法中的非整合載體包括游離質(zhì)粒、腺病毒、仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeV）、PiggyBac 轉(zhuǎn)座子、微環(huán)、mRNA 及蛋白質(zhì)等［8］。SeV 載體是一種單鏈RNA 病毒，是目前最常用非整合逆轉(zhuǎn)錄病毒［9］，現(xiàn)已成功用于新生兒和成人成纖維細(xì)胞及血細(xì)胞的高效重編程［10］。SeV 重編程不僅效率及可靠程度高，能對(duì)許多體細(xì)胞類型重編程，且在較高代次的大多數(shù)iPSCs中完全無(wú)病毒殘留［8］。但SeV的RNA清除緩慢，需持續(xù)篩選至第10代才可能清除SeV 的轉(zhuǎn)錄痕跡［11］。因此，研究高效、安全的重編程方法是目前亟需解決的問(wèn)題。OKUMURA等［12］報(bào)道了一種新的SeV 載體SeVdp-302L，該載體攜帶了4個(gè)KOSM 轉(zhuǎn)錄因子（KLF4、OCT4、SOX2和c-Myc），能激活干細(xì)胞中富集微小核糖核酸-302（micro ribonucleic acid，microRNA-302），可自清除小干擾RNA（small interfering ribonucleic acid，siRNA），提高重編程效率。攜帶4種轉(zhuǎn)錄因子的SeVdp載體（SeVdp-302L）可通過(guò)siRNA 靶向病毒RdRp從iPSCs中移除，而microRNA-302 的靶序列位于L基因的3 '端的非編碼區(qū)，可特異性抑制iPSCs中慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，有效促進(jìn)無(wú)轉(zhuǎn)基因iPSCs生成［13］。SeVdp-302L 介導(dǎo)的重編程方法無(wú)需額外重編程增強(qiáng)子，可簡(jiǎn)單高效地生成無(wú)轉(zhuǎn)基因hiPSCs［12］。這種新SeV載體在未來(lái)可能成為生產(chǎn)用于臨床應(yīng)用hiPSCs的重要工具。

1.2 基因重編程效率的提高 基因重編程不完全或效率低下可能導(dǎo)致iPSCs恢復(fù)原來(lái)的成熟體細(xì)胞特征，且部分重編程可使細(xì)胞失去多向分化潛能，影響其臨床應(yīng)用，且這些部分重編程細(xì)胞具有較高的致瘤傾向［14］。目前已有多種方法用于提高重編程效率，如組蛋白去乙?；敢种苿焖峥稍诓灰朕D(zhuǎn)錄因子c-Myc的情況下有效誘導(dǎo)iPSCs，并使重編程效率提高超過(guò)100 倍［15］。另外，有研究將髓細(xì)胞組織增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）蛋白的高效反式激活結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子OCT4的氨基端結(jié)合，結(jié)果表明，可顯著提高誘導(dǎo)重編程效率［16］。在重編程過(guò)程中，OCT4是重要轉(zhuǎn)錄因子，該因子的表達(dá)水平?jīng)Q定了體細(xì)胞的發(fā)展方向（體細(xì)胞多能狀態(tài)的恢復(fù)水平）［17］。研究發(fā)現(xiàn)，將OCT4的相對(duì)表達(dá)量提高至3 倍，同時(shí)保持其他3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（SOX2、KLF4和c-Myc）的適度表達(dá)水平，可提高重編程效率［17］。另外，OCT4和KLF4的高表達(dá)水平結(jié)合SOX2和c-Myc的中或低表達(dá)水平可提高重編程效率［18］。研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸誘導(dǎo)基因1蛋白樣受體通路［retinoic acid inducible gene 1 protein（RIG1）-like receptor pathway，RLR］介導(dǎo)的先天免疫信號(hào)也參與重編程過(guò)程并發(fā)揮重要作用［19］，敲低RLR 中間蛋白干擾素β啟動(dòng)子刺激因子1（adaptor protein interferon-beta promoter stimulator 1，IPS-1）可減弱下游多能因子的表達(dá)，使iPSCs生成減少，而在維甲酸誘導(dǎo)基因1 受體樣受體［retinoic acidinducible gene 1（RIG-1）receptor-like receptor，RLR］激動(dòng)劑參與下，iPSCs 菌落產(chǎn)量增加［19］。HERNANDEZ 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，從ESCs中分離出缺乏酶結(jié)構(gòu)域的發(fā)育多能性相關(guān)小蛋白（develop-mental pluripotency associated 2／4，Dppa2／4），作為染色質(zhì)相關(guān)的ESCs 特異性因子可調(diào)節(jié)體細(xì)胞向多能性的過(guò)渡。當(dāng)Dppa2／4與染色質(zhì)結(jié)合時(shí)，能通過(guò)DNA 損傷反應(yīng)途徑啟動(dòng)所有染色質(zhì)分解，導(dǎo)致體細(xì)胞基因下調(diào)及ESCs 增強(qiáng)子激活，該過(guò)程可使體細(xì)胞向多能性過(guò)渡［20］。當(dāng)Dppa2／4 與OKSM 轉(zhuǎn)錄因子（OCT4，KLF4，SOX2和c-Myc）共表達(dá)時(shí)，重編程效率可超過(guò)80%，同時(shí)加快重編程進(jìn)展，在2～4 d內(nèi)生成iPSCs［20］。

2 iPSCs的疾病模型

人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）的疾病模型能表現(xiàn)出與人類疾病相似的病理特點(diǎn)，比源于動(dòng)物或腫瘤細(xì)胞的疾病模型更具有預(yù)測(cè)性［4］。且利用基因重編程技術(shù)獲得的患者特異性iPSCs能夠保留原突變，為研究相關(guān)的發(fā)病機(jī)制和探索有效治療方法建立有用的體外模型，如從診斷為遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型患者體內(nèi)獲取外周血單核細(xì)胞，通過(guò)重編程技術(shù)成功構(gòu)建出相同疾病表型的iPSCs細(xì)胞系，該模型保留了原富馬酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH）基因突變，且擁有與患者相同的基因組［21］。

hiPSCs的疾病模型具有非常可觀的應(yīng)用前景，在多種難治性疾病研究方面已取得了較大進(jìn)展［22］，如帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等多種神經(jīng)退行性疾病，iPSCs已成功建立相關(guān)疾病模型，同時(shí)結(jié)合三維打印技術(shù)，可為研究疾病發(fā)展機(jī)制提供更能準(zhǔn)確反映疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的三維疾病模型［23］。iPSCs疾病模型在高通量疾病表型篩選及藥物篩選方面也具有較多優(yōu)勢(shì)，如利用hiPSCs大規(guī)模分化產(chǎn)生感覺(jué)神經(jīng)元來(lái)進(jìn)行高通量疼痛表型篩選，并通過(guò)該模型進(jìn)行2 700個(gè)化合物的化學(xué)基因組學(xué)篩選，用于分析能抑制藜蘆定誘發(fā)興奮性的機(jī)制范圍［24］。

遺傳性疾病是影響兒童健康的重要問(wèn)題，由于缺乏合適的研究模型，這些疾病的發(fā)病機(jī)制未明確，導(dǎo)致在這些疾病的治療方面也面臨許多困難。iPSCs的發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞研究領(lǐng)域具有重要意義，相關(guān)研究進(jìn)展為兒童遺傳性疾病的治療帶來(lái)了希望。

3 iPSCs在兒童遺傳性疾病中的應(yīng)用

大多數(shù)兒童相關(guān)罕見(jiàn)疾病均是遺傳性疾病，其病因復(fù)雜，患者幾乎無(wú)根治希望。研究遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)制是治療疾病的關(guān)鍵。iPSCs 能分化產(chǎn)生任何類型的細(xì)胞，且源自患者，易于獲取，因此成為許多基因突變疾病模型的細(xì)胞來(lái)源。iPSCs 不僅是不同遺傳性疾病病理分子研究的重要工具，也是對(duì)新分子進(jìn)行大規(guī)模評(píng)估的理想工具，為開(kāi)發(fā)新療法拓展了途徑。iPSCs 結(jié)合一些先進(jìn)的基因編輯技術(shù)使兒童遺傳性疾病的治愈成為可能。

3.1 脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）SMA 是嚴(yán)重危害新生兒和兒童健康的遺傳性疾病，也是導(dǎo)致嬰兒死亡的主要原因，約每40 個(gè)兒童中有1 個(gè)是該突變基因的攜帶者［25］。SMA 是一種由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（survival motor neuron gene 1，SMN1）突變引起的早發(fā)性疾病，為常染色體隱性遺傳，SMN1基因突變導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（motor neurons，MNs）退化，使患兒逐漸出現(xiàn)肌肉萎縮［26］。SMA 可根據(jù)身高表型、開(kāi)始運(yùn)動(dòng)的年齡和達(dá)到的最高運(yùn)動(dòng)能力分為1A、1B、1C、2A、2B、3A、3B 和4 型［25］。不同類型SMA 患者的iPSCs 疾病模型能表現(xiàn)出不同的SMN 蛋白表達(dá)水平［25］。SMA 1型的SMN蛋白水平低于2、3和4型細(xì)胞，因此1 型患者通常出生不久發(fā)病，病情進(jìn)展迅速，可在約2歲時(shí)死亡［25］。SMA患者的iPSCs還能用來(lái)進(jìn)行藥物篩選，研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸和妥布霉素可誘導(dǎo)SMA 患者的iPSCs，提高SMN 蛋白水平［26］。HOR等［27］首次通過(guò)SMA 脊髓類器官模型發(fā)現(xiàn)，可能是由于SMN 蛋白缺失所致，SMA 患者脊髓MNs 中的細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)豐富，通過(guò)測(cè)試周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases 4／6，CDK4／6）抑制劑在處理SMA 脊髓類器官7 d 后，逆轉(zhuǎn)SMA 患者M(jìn)Ns的變性，可挽救SMA NNs。iPSCs技術(shù)在SMA治療方面的研究也在不斷突破，如將iPSCs分化的MNs注入SMA動(dòng)物模型中，可恢復(fù)動(dòng)物神經(jīng)肌肉功能，延緩肌肉萎縮［28］。ZHOU 等［29］將iPSCs技術(shù)與新的基因編輯系統(tǒng)——先導(dǎo)編輯（prime editing，PE）結(jié)合，通過(guò)靶向刪除SMN2的內(nèi)含子剪接沉默子序列，抑制SMN2第1號(hào)外顯子的替代剪接，從而恢復(fù)SMN2全長(zhǎng)SMN 蛋白基因mRNA的表達(dá)，最終成功翻譯完整的SMN蛋白，且SMN 蛋白水平與正常對(duì)照組iPSCs 相似，明顯高于SMA-iPSCs 組。SMN2 表達(dá)的SMN 蛋白成功彌補(bǔ)了SMN1突變帶來(lái)的損失，從而達(dá)到疾病治療的目的。

3.2 色素性視網(wǎng)膜炎（retinitis pigmentosa，RP） RP導(dǎo)致的夜盲癥可在兒童期早期發(fā)病，并表現(xiàn)為不可逆、遺傳性視網(wǎng)膜病變，色素性視網(wǎng)膜炎三磷酸鳥(niǎo)苷酶調(diào)節(jié)劑（retinitis pigmentosa GTPase regulator，RPGR）基因突變是該疾病最常見(jiàn)的病因［30］。RP是目前全球范圍內(nèi)致盲的主要病因，由于發(fā)病機(jī)制尚未明確，無(wú)法根治［30］。DENG 等［30］獲取3名患有RP兒童的尿細(xì)胞培養(yǎng)iPSCs，將其分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞并培養(yǎng)為視網(wǎng)膜類器官，建立RP 疾病模型。在該疾病模型中，表現(xiàn)出患者視網(wǎng)膜中視蛋白發(fā)生脫位，視網(wǎng)膜外端結(jié)構(gòu)短于正常對(duì)照組，且不正常的桿狀細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多［30］，表明在患者的視網(wǎng)膜中RPGR突變可導(dǎo)致桿狀細(xì)胞和光感受器的形態(tài)異常。不斷發(fā)展的基因編輯技術(shù)也為該病的治療帶來(lái)了突破。通過(guò)基因修正工具——規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)和CRISPR相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspersed short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9，CRISPR／Cas9）系統(tǒng)進(jìn)行基因糾正后，患者來(lái)源iPSCs分化視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的酪氨酸蛋白激酶Mer 表達(dá)恢復(fù)，且存在光受體外段吞噬功能［31］。與二維細(xì)胞培養(yǎng)比較，三維細(xì)胞培養(yǎng)能展現(xiàn)出視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)及空間分布情況，可充分表達(dá)RP 的疾病病理特點(diǎn)。近年，隨著三維視網(wǎng)膜類器官培養(yǎng)方式的改進(jìn)，iPSCs向視網(wǎng)膜譜系的分化取得了重大進(jìn)展。LANE 等［32］利用RP2基因突變敲除后誘導(dǎo)的iPSCs 和RP2 患者來(lái)源的iPSCs 培養(yǎng)成三維視網(wǎng)膜類器官作為視網(wǎng)膜疾病模型，并將iPSCs重編程、CRISPR基因編輯技術(shù)和腺病毒基因傳遞結(jié)合，通過(guò)比較等基因?qū)φ战M、CRISPR敲除及腺病毒基因傳遞3 組疾病模型的視網(wǎng)膜外核層厚度和視紫紅質(zhì)免疫反應(yīng)性，結(jié)果表明，腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可拯救RP2敲除導(dǎo)致的視網(wǎng)膜外核層變薄并恢復(fù)視紫紅質(zhì)表達(dá)。遺傳性耳聾-視網(wǎng)膜色素變性綜合征2A（Usher syndrome 2A，USH2A）基因是常染色體隱性RP 最常見(jiàn)的相關(guān)基因，該基因變異引起非綜合征型RP和綜合征型RP（即USH 2型），前者常導(dǎo)致視力和聽(tīng)力損傷［33］。由于USH2A基因變異性較大，缺乏明確的基因型-表型相關(guān)或預(yù)后模型，使USH 2 型診斷較困難［33］。有研究在攜帶USH2A變異的3 名非綜合征RP 和3 名USH 患者中進(jìn)行了成纖維細(xì)胞、iPSCs 和iPSCs 衍生的視網(wǎng)膜類器官層面的研究［33］，結(jié)果表明，iPSCs 衍生的視網(wǎng)膜類器官中，非綜合征型RP 的類器官桿狀和錐狀光感受器的內(nèi)段和外段形成或延伸比USH 突變體更明顯，通過(guò)基因校正后，來(lái)自非綜合征型RP 的類器官桿狀光感受器表型得到改善。

3.3 遺傳性肝膽疾病 隨著iPSCs 技術(shù)的發(fā)展，在體外生成膽管細(xì)胞已成為現(xiàn)實(shí)，這為研究肝膽疾病和再生治療提供了可能。一些影響膽管細(xì)胞功能的單基因遺傳性疾病，如常染色體隱性遺傳的囊性纖維化和常染色體顯性遺傳的Alagille 綜合征，影響膽道功能或造成膽管缺乏，使膽汁淤積、毒性物質(zhì)累積，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官衰竭，造成嚴(yán)重膽道疾病的需進(jìn)行肝移植，這類疾病造成的肝移植率小兒遠(yuǎn)高于成人［34］。無(wú)論是膽管疾病的研究還是膽管細(xì)胞再生治療，均受到成熟膽管細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的阻礙。OGAWA等［35］用單層分化培養(yǎng)，通過(guò)不同調(diào)節(jié)因子的篩選比較，確定了幾種促進(jìn)膽管細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，如維甲酸、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、環(huán)磷酸腺苷和Rho 激酶通路，維甲酸誘導(dǎo)效果最明顯。在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和無(wú)基質(zhì)的培養(yǎng)基中分別加入維甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)方式的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conduction regulator，CFTR）表達(dá)水平均升高，但單層培養(yǎng)中的CFTR 表達(dá)水平升高更突出［34］。這些調(diào)節(jié)因子使hiPSCs來(lái)源的膽管細(xì)胞表達(dá)高水平的CFTR，并含有初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)［35］。另外，有研究采用iPSCs衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞模型對(duì)常染色體隱性高膽固醇血癥（autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH）進(jìn)行研究［35］，該病是一種罕見(jiàn)的單基因疾病，由編碼低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）接頭蛋白1（LDLR adaptor protein 1，LDLRAP1）基因的突變引起。該研究結(jié)合CRISPR／Cas9 技術(shù)建立敲除LDLRAP1基因的iPSCs，結(jié)果表明，敲除LDLRAP1或存在LDLRAP1突變的iPSCs 來(lái)源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的攝取降低。對(duì)于遺傳性肝膽疾病導(dǎo)致的器官衰竭，器官移植是唯一的治療方法。TAKEISHI 等［37］利用hiPSCs 分化為人肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，并組裝成可用于移植的肝臟，具有與人類肝臟相似的組織結(jié)構(gòu)。有研究將亮氨酸重復(fù)序列的G 蛋白偶聯(lián)受體5 陽(yáng)性的成人組織干細(xì)胞來(lái)源的單個(gè)肝臟類器官細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，這種條件下的干細(xì)胞能增殖分化為膽管細(xì)胞樣和肝細(xì)胞樣細(xì)胞，且這種大量細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)獲得的類器官可達(dá)到接近肝再生［38］。iPSCs 不僅是研究遺傳性肝膽疾病的有力工具，iPSCs 衍生肝臟類器官的出現(xiàn)也為終末期肝膽疾病治療提供了新思路。

3.4 進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良癥（fibrodysplasia ossifificans progressiva，F(xiàn)OP） FOP 是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，其特征是骨骼肌、韌帶和肌腱等軟組織的異位骨化（heterotopic ossifcation，HO）［39］。通常情況下，患者的HO不會(huì)在出生時(shí)出現(xiàn)，而是在兒童時(shí)期開(kāi)始發(fā)展［39］，目前尚無(wú)有效治療方法。約90%的FOP患者有激活素A型1受體（activin A type 1 receptor，ACVR1突變［39］，ACVR1基因在激活素-A 作用下錯(cuò)誤地轉(zhuǎn)導(dǎo)BMP 信號(hào)，并啟動(dòng)HO 的形成［40］。有研究對(duì)FOP 患者單核細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，包括CD16+在內(nèi)的幾個(gè)表面標(biāo)記物增加［41］。MAEKAWA 等［40］為研究激活素-A 對(duì)FOP 患者單核細(xì)胞的作用機(jī)制，利用來(lái)自FOP 患者和突變糾正FOP 患者的iPSCs 建立了永生單核細(xì)胞系，通過(guò)這些模型評(píng)估ACVR1突變對(duì)單核細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變患者的iPSCs 單核細(xì)胞系表現(xiàn)出CD16+單核細(xì)胞的促炎特征，抑制素β 基因A表達(dá)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)白三烯的產(chǎn)量增加，而在激活素-A刺激誘導(dǎo)下，突變糾正的FOP患者iPSCs單核細(xì)胞系表現(xiàn)出與FOP 患者iPSCs 單核細(xì)胞系一致的初始炎性反應(yīng)。FOP 患者iPSCs 單核細(xì)胞系準(zhǔn)確再現(xiàn)了FOP 原代單核細(xì)胞的表型，與突變糾正的FOP患者iPSCs單核細(xì)胞系共同作為研究FOP 的HO 初始炎癥階段分子事件的疾病模型，且iPSCs在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用上也有望為FOP患者提供細(xì)胞來(lái)源。有研究利用FOP患者的成纖維細(xì)胞建立了hiPSCs 分化形成軟骨，并發(fā)現(xiàn)在礦化培養(yǎng)條件下，成軟骨和成骨標(biāo)記物表達(dá)均增加［42］。NAKAJIMA 等［43］利用iPSCs對(duì)FOP疾病建模，并利用FOP來(lái)源iPSCs誘導(dǎo)生成體細(xì)胞，將體細(xì)胞繼續(xù)分化為衍生物生皮節(jié)、生肌節(jié)、生骨節(jié)等細(xì)胞，通過(guò)生骨節(jié)可誘導(dǎo)生成軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。hiPSCs 可衍生為類器官，能夠進(jìn)一步研究細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，因此，類器官將有望成為進(jìn)一步研究ACVR1影響FOP發(fā)展的有利工具。

3.5 其他疾病 iPSCs 還可用來(lái)模擬結(jié)構(gòu)性心臟病，如先天性左心發(fā)育不全綜合征（hypoplastic left heart syndrome，HLHS）［44］。有研究用來(lái)自HLHS患者的iPSC衍生內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果表明，多個(gè)與心內(nèi)膜功能和瓣膜結(jié)構(gòu)重塑相關(guān)的信號(hào)通路受到抑制，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和Notch 信號(hào)通路。新生兒肺部疾病，如表面活性劑功能障礙的遺傳性疾病，特別是具有明確的單基因（包括編碼肺表面活性物質(zhì)蛋白-B、肺表面活性物質(zhì)蛋白-C、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因）驅(qū)動(dòng)的疾病，已在使用hiPSCs進(jìn)行體外研究，并嘗試結(jié)合基因編輯治療這類疾?。?5-46］。

綜上所述，基因編輯工具的結(jié)合及iPSCs衍生的臟器類器官發(fā)展，將極大推動(dòng)遺傳性疾病的疾病建模與個(gè)體化治療的研究。

4 iPSCs應(yīng)用的局限性

基因組不穩(wěn)定性與涉及重編程過(guò)程和iPSCs 表觀遺傳變異的問(wèn)題仍存在，使iPSCs的分化成熟存在一定障礙，還具有致瘤的可能性。在iPSCs培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生意外突變或修飾，潛在影響細(xì)胞分化和功能［14］，這種異常變異導(dǎo)致個(gè)體間變異將使iPSCs系之間出現(xiàn)異質(zhì)性［47］。

iPSCs 的細(xì)胞替代治療是將分化成熟的細(xì)胞制劑移植至患者體內(nèi)，若將未分化的iPSCs直接注射至體內(nèi)，由于未分化細(xì)胞的高增殖性和分化潛力，將導(dǎo)致畸胎瘤形成［1］。為了使iPSCs 在臨床細(xì)胞治療中不受致瘤性的限制，可將未分化細(xì)胞去除，如在培養(yǎng)基中添加高濃度L-丙氨酸，可選擇性地將未分化細(xì)胞消除［48］。研究表明，水楊酸二胺也可選擇性地將iPSCs 來(lái)源的心肌細(xì)胞制劑中殘留的未分化細(xì)胞清除［49］。由于自體細(xì)胞可能攜帶致病基因［2］，產(chǎn)生特異性iPSCs所需時(shí)間長(zhǎng)且價(jià)格高昂，同種異體移植可能優(yōu)于自體移植，但同種異體移植存在人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）不匹配問(wèn)題。該項(xiàng)研究中，利用CRISPR／Cas9 系統(tǒng)將iPSCs 細(xì)胞的HLA-A和HLA-B等位基因同時(shí)打亂，產(chǎn)生保留HLA-C的iPSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種干細(xì)胞保留抗原呈遞功能的同時(shí)，還能逃避T細(xì)胞和NK細(xì)胞的攻擊［50］。

5 小結(jié)與展望

隨著培養(yǎng)分化技術(shù)及重新編程方法的不斷發(fā)展，iPSCs 技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞治療、模擬人類疾病及藥物篩選方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，而iPSCs在臨床要得到廣泛應(yīng)用，必須與其他細(xì)胞治療相關(guān)臨床試驗(yàn)一樣，需要確定致瘤性、劑量毒性、分布和免疫原性水平［5］。另外，iPSCs 的治療效果必須先在患病動(dòng)物模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保和評(píng)估iPSCs 的安全性［5］。目前，已有超過(guò)14 種疾病和損傷細(xì)胞療法已經(jīng)或即將進(jìn)行臨床試驗(yàn)［51］。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，iPSCs技術(shù)將在研究各種遺傳性疾病的機(jī)制及探索治療方法中得到廣泛應(yīng)用。