終末期肝病合并真菌感染診斷現(xiàn)狀與未來*

黃藍(lán)月 劉蕓輝 程秋瑜 鈕雨鑫 劉婷婷 張 夢 朱 琳 寧 琴 陳 韜

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科,人畜共患傳染病重癥診治全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (湖北 武漢, 430030)

終末期肝病(ESLD)至今仍無嚴(yán)格定義,其范疇包括各種慢性肝病的終末期階段,包括慢加急性肝衰竭、肝硬化急性失代償、慢性肝衰竭和肝細(xì)胞癌[1]。慢性肝病最常見病因是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒、酒精性肝病和非酒精性(代謝相關(guān)性)脂肪性肝病,在亞洲國家(除日本以外),慢性HBV感染是其主要病因[2]。其中,真菌感染既是慢性肝病患者進(jìn)展為ESLD最常見的觸發(fā)因素,也是ESLD患者最常見的并發(fā)癥之一。侵襲性真菌感染(IFI) 是指侵犯至人體深部組織器官的真菌感染,導(dǎo)致組織損害、器官功能障礙和炎癥反應(yīng)等病理改變及病理生理過程。2.5%～10%肝衰竭患者合并IFI[3]。已有真菌培養(yǎng)以及真菌特異性抗原檢測/血清曲霉特異性抗原(G/GM)試驗(yàn)等真菌檢測應(yīng)用于臨床實(shí)踐,但是由于ESLD疾病的特殊性,其診斷價(jià)值尚存在一定的局限性。

1 ESLD合并真菌感染的流行病學(xué)

在ESLD合并真菌感染的患者中[4],侵襲性念珠菌病(IC)是最常見的IFI類型,其次是侵襲性曲霉菌病(IA)。研究表明[5],IC中,白色念珠菌(72.4%)最為常見;而IA中,菌株以煙曲霉(79.5%)為主。ESLD合并真菌感染加劇炎癥級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致肝臟及肝外器官衰竭。大型薈萃分析表明,肝硬化合并IC和IA的死亡率分別高達(dá)55%[6]和81.8%[7]。ESLD患者IFI的好發(fā)部位依次為肺(3.9%)、泌尿道(2.6%)、血流(1.9%)、腹腔(1.7%)、腸道(1.7%)和神經(jīng)系統(tǒng)(0.9%)[5]。

1.1 呼吸道 肺部真菌感染最常見的類型是侵襲性肺曲霉病(IPA),還包括毛霉菌病、肺孢子菌肺炎和肺念珠菌病等[8]。

1.2 泌尿道 泌尿系統(tǒng)的真菌感染大多數(shù)為念珠菌所致[9],白色念珠菌占50%～70%,其次為光滑念珠菌、熱帶念珠菌。泌尿道真菌感染常無典型癥狀。

1.3 血流 念珠菌引起的真菌血癥是ESLD患者中最常見的IFI[10],白色念珠菌最為常見,其次為熱帶念珠菌、光滑念珠菌。臨床表現(xiàn)從輕度發(fā)熱到膿毒癥不等。

1.4 腹腔 自發(fā)性真菌性腹膜炎在ESLD常見,白色念珠菌是從腹水中最常分離出的菌種[11],其特征是腹水真菌培養(yǎng)陽性,腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于250個(gè)細(xì)胞/mm3,常合并細(xì)菌感染。臨床表現(xiàn)與自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎難以區(qū)分,腹膜刺激征不典型,可有淡紅色血性腹腔積液。

1.5 腸道 腸道真菌感染可表現(xiàn)為發(fā)熱、腹脹、腹瀉和豆渣樣大便[12]。腸道真菌感染以白色念珠菌最為常見,其次為熱帶念珠菌。

1.6 神經(jīng)系統(tǒng) 神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染較為少見,隱球菌性腦膜炎最為常見,典型癥狀包括頸強(qiáng)、發(fā)熱、畏光和嘔吐[13]。

2 ESLD合并真菌感染的診斷方法

ESLD合并真菌感染的診斷主要依據(jù)真菌微生物學(xué)檢查證據(jù)、宿主因素及臨床表現(xiàn),分為確診、臨床診斷、擬診3類[14]。臨床確診主要依據(jù)真菌微生物學(xué)檢查結(jié)果,但陽性檢出率尚不能滿足臨床需要,相關(guān)替代檢驗(yàn)指標(biāo)受到ESLD影響,其具體臨床應(yīng)用需進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1 微生物培養(yǎng) 念珠菌血癥的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng),但其靈敏度為63%～83%[15]。原因可能是血液中缺乏活念珠菌、活念珠菌濃度不足以在收集的樣本中檢測到或活細(xì)胞間歇性/短暫釋放到血液中[16]。念珠菌的繁殖速度慢,其培養(yǎng)陽性時(shí)間需要72～96 h。

深部念珠菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是無菌收集的感染組織培養(yǎng)物(胸腔積液、腹腔積液、腦脊液等)培養(yǎng)陽性。直接從感染培養(yǎng)念珠菌的深部部位采集樣本,往往需要侵入性操作,組織培養(yǎng)敏感性低于50%[16],這可能與念珠菌濃度低、分布不均有關(guān)。

IA最常見的類型為IPA,通過痰培養(yǎng)或支氣管肺泡灌洗術(shù)(BAL)獲得的呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但是該方法存在以下問題:標(biāo)本不易獲得,獲取標(biāo)本常需要侵入性操作(支氣管肺泡灌洗、肺活檢、支氣管活檢等)。通過痰培養(yǎng)或BAL獲得的呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)的陽性預(yù)測值較低(約72%),在已經(jīng)接受抗真菌治療的患者中可能更低[17]。BAL培養(yǎng)陽性可能反應(yīng)的是定植而不是感染。

使用微生物培養(yǎng)來診斷IFI存在敏感性差、耗時(shí)長、標(biāo)本難以獲取、難以區(qū)分定植與感染等問題,不宜作為早期診斷的手段,診斷時(shí)進(jìn)行治療往往為時(shí)已晚。ESLD患者出現(xiàn)抗菌治療無效的發(fā)熱/寒戰(zhàn)、膽紅素不降反升等臨床表現(xiàn)時(shí),積極連續(xù)留取足量血液和體液標(biāo)本(痰液、腹水、膽汁等),并及時(shí)處理以防止細(xì)菌和酵母菌過度生長,必要時(shí)使用特定培養(yǎng)基/特殊染色以提高IFI的診斷準(zhǔn)確率。

2.2 特殊染色檢查 顯微鏡檢查是診斷IFI的方法之一,但是該檢查的敏感性低,主要因?yàn)槠湫枰叩恼婢S度[18]。熒光染料(如Calcofluor WhiteTM或BlancophorTM)染色具有靈敏度高、周期短和適用性廣等優(yōu)點(diǎn),但對曲霉菌的染色不具有特異性。Gomori的烏洛托品銀染和高碘酸希夫可用于組織學(xué)切片和涂片,可應(yīng)用于IA的診斷。

2.3 特異性抗原檢測 真菌特異性抗原檢測[19],簡稱G試驗(yàn),是基于血清中(1,3)-β-D-葡聚糖(BDG)的檢測方法。BDG是真菌(念珠菌、曲霉菌、耶氏肺孢子蟲等)的細(xì)胞壁成分,但在毛霉菌和大多數(shù)隱球菌中并不存在,在細(xì)菌、病毒以及哺乳動物中也不表達(dá)。成人BDG≥80 pg/ml被定義為陽性。雖然G試驗(yàn)?zāi)軌蛴糜贗FI的診斷及抗真菌治療療效評估,其缺點(diǎn)也不容忽視:無法用于隱球菌診斷、不能鑒定具體的菌屬和菌種以及假陽性高。既往研究顯示,G試驗(yàn)假陽性的原因可能與人血液制品輸入(免疫球蛋白、白蛋白)、纖維素膜血液透析、使用阿莫西林-克拉維酸或哌拉西林-他唑巴坦等抗生素、嚴(yán)重細(xì)菌感染、腸內(nèi)營養(yǎng)等因素有關(guān)[20]。

血清曲霉特異性抗原檢測,簡稱GM試驗(yàn)。半乳甘露聚糖是曲霉菌屬的細(xì)胞壁成分,真菌生長和侵入組織時(shí)釋放,可通過平板曲霉酶免疫測定檢測。GM≥0.5 ng/ml被定義為GM試驗(yàn)陽性,被認(rèn)為是曲霉菌病的真菌學(xué)證據(jù),但易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。當(dāng)接受阿莫西林-克拉維酸和哌拉西林-他唑巴坦、含葡萄糖酸鹽的血漿、血液衍生產(chǎn)品治療,或與其他霉菌和二態(tài)性真菌(例如青霉菌等)發(fā)生交叉反應(yīng)可致假陽性,無法用于毛霉菌的診斷[21]。

ESLD常使用抗生素治療,住院期間輸入血制品(人工肝治療、白蛋白、血漿等),將會影響ESLD患者G/GM試驗(yàn)診斷特異性?？稍诨颊呷朐汉髣討B(tài)觀察血液G/GM試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果,以降低該檢查的假陽性率。一項(xiàng)ACLF合并IFI的回顧性分析顯示,BDG和GM診斷IFI的靈敏度、特異性和曲線下面積分別為97.4%、60.0%、0.770和43.6%、100%、0.745[4]。

G/GM試驗(yàn)聯(lián)合檢測能更好地排除假陽性,有助于IA的診斷。一項(xiàng)薈萃分析評估了G/GM聯(lián)合試驗(yàn)在免疫功能低下的成年IA患者中的診斷效用,結(jié)果顯示,雖然敏感性降低為49%,但其特異性為98%[22]。由此可見,同時(shí)檢測G/GM試驗(yàn)可提高診斷IA的特異性。

2.4 分子檢驗(yàn) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為IFI的輔助診斷手段,可用于檢測全血、血清、血漿、腦脊液或 BAL 中的真菌,為鑒定對抗真菌治療有耐藥性的真菌菌株提供了一種非培養(yǎng)替代方法,與其他診斷方法相結(jié)合可以提高IFI的診斷效能,同時(shí)也是毛霉菌唯一的非培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室檢測方法[23]。該技術(shù)目前最主要的問題是標(biāo)準(zhǔn)化程度有限,檢測到死亡微生物的DNA易致臨床假陽性結(jié)果。PCR連續(xù)陽性對IA的診斷具有良好的特異性,但尚未在ESLD患者中驗(yàn)證。

2.5 宏基因組二代測序(mNGS) mNGS也稱為高通量測序,它可以應(yīng)用于各種標(biāo)本類型,包括血液、支氣管肺泡灌洗液、腦脊液、痰液、尿液等。它僅需從樣本中提取少量的脫氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA),便可以檢測和鑒定病原體,可檢測出罕見、新型、難以檢測的病原體,同時(shí)具備耐藥性評估的能力[24]。但mNGS的超靈敏性會導(dǎo)致病原體與其他微生物(背景菌群、污染菌群、定植菌群)的鑒別困難,從而使得臨床解讀缺乏標(biāo)準(zhǔn)。伴有感染性腹水的ESLD患者,由于腸道菌群改變、細(xì)菌易位等因素,使得mNGS難以發(fā)揮其高效、快速的檢測價(jià)值[25]。

2.6 其他檢測方法 T2念珠菌納米診斷組合使用T2磁共振和專用儀器平臺直接擴(kuò)增和檢測(使用帶有靶探針的納米顆粒)全血中的念珠菌DNA,即使患者正在接受抗真菌治療,該技術(shù)仍能靈敏檢測出念珠菌[26]。該方法可以在大約5 h內(nèi)從全血中快速識別出5種最普遍的念珠菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、副念珠菌、克魯塞念珠菌和光滑念珠菌)和無法檢測到少量的耳念珠菌[27]。T2念珠菌納米診斷組合與傳統(tǒng)血培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合可以顯著提升IC的診斷效率,但其診斷效能仍有待驗(yàn)證。

將PCR與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜以及PCR-電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)避免了對無限制引物的要求,可快速檢測及定量相對廣泛真菌病原體,有望于近幾年內(nèi)被大規(guī)模應(yīng)用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室[28]。

曲霉特異性側(cè)流裝置(LFD)是一種免疫層析測試,它使用JF5單克隆抗體檢測活躍生長的曲霉菌分泌的細(xì)胞外糖蛋白(甘露蛋白)抗原。LFD用于BAL樣本診斷IPA受全身性抗真菌預(yù)防/治療的影響較小,但仍需更多的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證[29]。

曲霉鄰位結(jié)扎試驗(yàn)是將抗原(曲霉特異性細(xì)胞外甘露蛋白)抗體識別的特異性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的靈敏度相結(jié)合,從而用于曲霉菌的早期檢測。該方法與其他真菌屬抗原無交叉反應(yīng),或可用于診斷IA[27]。

綜上,ESLD合并IFI的診斷方式多樣且各有優(yōu)勢,但目前該類患者仍存在嚴(yán)重的延遲診斷、延遲治療等缺陷,且真菌感染不同于細(xì)菌感染,預(yù)防性使用抗真菌治療仍存爭議。有研究表明,有效抗真菌治療的開始延遲時(shí)間1～2 d與死亡率上升有關(guān)[30]。此外,預(yù)防性使用抗真菌藥物的時(shí)機(jī)尚未有明顯的標(biāo)準(zhǔn),大多數(shù)仍是經(jīng)驗(yàn)性治療,且存在抗真菌藥物的肝臟毒性問題。在ESLD合并IFI的診斷中,需要進(jìn)一步明確目前已有真菌檢測方法的診斷效能,研發(fā)適合肝功能失代償早期診斷效能的生物標(biāo)志物是未來需要著重解決的臨床研究方向。