表面增強(qiáng)拉曼光譜對黑色圓珠筆快速鑒別的檢測研究

雷霏，王雅晨，孫其然，羅儀文，楊旭

（1.上海市公安局靜安分局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，上海 200070；2.司法鑒定科學(xué)研究院上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺司法部司法鑒定重點(diǎn)實驗室，上海 200063）

自圓珠筆進(jìn)入市場后，已逐漸成為人們使用較為廣泛的書寫工具之一。 目前，圓珠筆墨跡鑒定已成為文書鑒定工作中至關(guān)重要的一部分。 如何更加有效地分析和鑒別不同種類的圓珠筆油墨，是目前研究的一個難點(diǎn)。 圓珠筆油墨主要由溶劑、著色劑、樹脂和助劑四個部分組成[1]。常見的圓珠筆墨跡檢測和鑒別方法包括紫外可見光譜法[2]、高效液相色譜法[3]和質(zhì)譜法[4-5]等。 拉曼光譜作為一種分子振動光譜，因其具有無損、快速定性等優(yōu)點(diǎn)，一直受到業(yè)內(nèi)學(xué)者們的廣泛關(guān)注。 而拉曼光譜主要用于對圓珠筆油墨中的著色劑進(jìn)行檢測分析[6-9]。 傳統(tǒng)的拉曼光譜由于易受熒光干擾，信號強(qiáng)度和靈敏度均較低，在實際檢測中譜峰信號差異不顯著，致使鑒別難度較大。

近年來，表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectrometry，SERS）因其較高的靈敏度和通用性得到廣泛關(guān)注[10-11]。 2009 年，IRINA 等[12]選取了甲基紫羅蘭、蘇丹黑B、帕拉羅沙寧等10 種具有代表性的有機(jī)染料，分別對其粉末和溶液進(jìn)行了常規(guī)拉曼檢測和表面增強(qiáng)拉曼檢測。 結(jié)果表明，由于在常規(guī)拉曼光譜中受到熒光干擾而沒有檢測到拉曼信號的染料分子，卻在增強(qiáng)后能夠得到明顯的特征峰譜圖。 基于此，表面增強(qiáng)拉曼開始替代常規(guī)拉曼技術(shù)，在各個領(lǐng)域嶄露頭角。 但在目前的文獻(xiàn)報道中，除了ALYAMI 等[13]、RAZA 等[14-15]研究了不同的納米顆粒制備方法對圓珠筆墨跡的檢測效果外，缺乏針對墨跡鑒定的應(yīng)用研究。 而在實際案件中，不同種類的圓珠筆油墨的區(qū)分往往是偵破案件的關(guān)鍵，如何快速區(qū)分不同品牌和不同類型的圓珠筆油墨值得行業(yè)研究人員關(guān)注和研究。

本文以黑色圓珠筆為研究對象，選取了目前國內(nèi)市場上55 種不同品牌的黑色圓珠筆，在785、633、514 nm 3 種不同激發(fā)光波長下，用自制納米銀膠體溶液對樣品進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼檢測，比較了樣品在增強(qiáng)前后的特征峰信息，并將3 種激發(fā)光波長下的樣品數(shù)據(jù)相結(jié)合，以實現(xiàn)在快速檢驗的基礎(chǔ)上，更加可靠地區(qū)分不同品牌的圓珠筆油墨。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

InVia 型激光顯微拉曼光譜儀（英國雷尼紹公司）；S-4800 型場發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）。

納米銀溶液的制備：用于SERS 探針的納米銀膠體是在LEE 等[16]研究方法基礎(chǔ)上改進(jìn)而合成的。首先，將9 mg 硝酸銀溶解在50 mL 去離子水中，加熱至沸騰，將4 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉水溶液逐滴緩慢地滴加到沸騰的硝酸銀溶液中。 然后，持續(xù)加熱20 min，將制備好的灰綠色膠體銀溶液冷卻至室溫，再以5 000 r/s 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，用水清洗2～3 次。 最后，去除97%的上清液，沉淀物用少量水稀釋后置于5 ℃的黑暗環(huán)境中，密封保存待用。

55 種不同品牌的黑色圓珠筆樣品信息如表1所示；80 g A4 復(fù)印紙（億王紙業(yè)有限公司）；結(jié)晶紫、甲基紫2B、堿性藍(lán)7 標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)）；檸檬酸鈉（美國Sigma-Aldrich 公司）為分析純；硝酸銀（SinoPharma 公司）為分析純；乙醇（阿拉丁公司）為分析純；實驗用水為經(jīng)Milli-Q 純水儀純化后的純水。

表1 55 種不同品牌的黑色圓珠筆樣品信息

1.2 儀器條件

掃描電鏡條件 放大倍率為250、500、1 000倍。

拉曼光譜儀條件 掃描范圍為300～2 000 cm-1；激發(fā)光波長為785、633、514nm；光譜分辨率為2cm-1。

1.3 方法

樣品的制備：分別使用表1 中黑色圓珠筆執(zhí)直尺于空白紙張（2 cm×6 cm）上先劃一條橫線，然后劃兩條與橫線垂直交匯的豎線，將寫好的紙張用雙面膠粘貼于載玻片上待用。

掃描電鏡檢測：將制備好的納米銀膠體放入80℃烘箱中烘干后，取少量粉末分散在導(dǎo)電膠上用于掃描電鏡的檢測。

拉曼檢測：用直徑為0.3 mm 的玻璃毛細(xì)管沾取納米銀膠體，再讓其自然吸附到紙張表面（使納米顆粒均勻密集的分布在待測的墨水線上，而不會大面積的洇散，增強(qiáng)的位置選擇在兩條墨水線的交匯處），開始檢測，每個樣品平行檢測3 次，以獲得最佳光譜結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀的制備與表征

圖1 顯示了制備的納米銀顆粒的掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖像，可以看出，所制備的納米銀顆粒呈尺寸較均勻的球形，粒徑大約為40～50 nm，符合李東[17]所提出的能夠獲得最佳增強(qiáng)效果的納米銀顆粒表征。

圖1 納米銀顆粒的SEM 圖像

為了驗證自制納米銀的表面增強(qiáng)效果，在785 nm激發(fā)光波長下，分別檢測樣品22 在增強(qiáng)前后的拉曼光譜信息，增強(qiáng)效果明顯，如圖2 所示，其中，NRS表示增強(qiáng)前光譜，SERS 表示增強(qiáng)后光譜。

圖2 樣品22 在785 nm 激發(fā)光波長下的增強(qiáng)前光譜和增強(qiáng)后光譜對比

2.2 不同激發(fā)光波長下的表面增強(qiáng)拉曼光譜

圖3 選擇了樣品47和樣品50兩個樣品的譜圖作為兩組圓珠筆的代表，比較其在785、633、514 nm這3種激發(fā)光波長下增強(qiáng)前后的拉曼光譜。在785nm激發(fā)光波長下[圖3（a）]，可以看出增強(qiáng)前兩個樣品之間沒有顯著差異，而增強(qiáng)后，兩個樣品的拉曼信號顯著增強(qiáng)，在420、520、725、840、860、915、1 180、1 260、1 320、1 365、1 440、1 585、1 620 cm-1處的特征峰信號都有明顯提高，譜圖顯示其墨跡中含有結(jié)晶紫、甲基紫2B類染料。47號樣品在1 320 cm-1處的特征峰顯示出微弱的紅移。在633 nm激發(fā)光波長下[圖3（b）]，增強(qiáng)前樣品的拉曼信號非常差，僅僅在420、1 180、1320、1365、1620cm-1處出現(xiàn)微弱的特征峰。 而增強(qiáng)后的特征峰信號明顯增強(qiáng)。 在514 nm激發(fā)光波長下[圖3（c）]，樣品在增強(qiáng)前就有較好的拉曼信號。 值得注意的是，樣品47在1 710 cm-1處出現(xiàn)特征峰信號，這在785、633nm激發(fā)光波長下均未出現(xiàn)。

圖3 樣品47 和樣品50 在785、633、514 nm 激發(fā)光波長下增強(qiáng)前光譜和增強(qiáng)后光譜對比

2.3 分類與識別

為了能夠更加準(zhǔn)確地對圓珠筆進(jìn)行分類與定性，首先檢測了結(jié)晶紫、甲基紫2B 和堿性藍(lán)7 這3種常見圓珠筆染料標(biāo)準(zhǔn)品的表面增強(qiáng)拉曼光譜，表2 展示了3 種常見圓珠筆染料標(biāo)準(zhǔn)品在不同激發(fā)光波長下的標(biāo)志性特征峰信息。

表2 3 種常見圓珠筆染料標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)志性特征峰

圖4 展示了在785nm激發(fā)光波長下，同一品牌（三菱）的不同型號的樣品10和樣品53在增強(qiáng)前后的譜圖。 由此可以看出，在NRS譜圖中未能體現(xiàn)出特征峰差異（500～600cm-1區(qū)域），而在SERS譜圖中卻能很好的得到體現(xiàn)。 這說明SERS不僅可對不同品牌的樣品進(jìn)行區(qū)分，還能對同一品牌不同型號的樣品進(jìn)行區(qū)分。

圖4 同一品牌不同型號的樣品10 和樣品53 的增強(qiáng)前光譜和增強(qiáng)后光譜對比

圖5 顯示了在785、633、514 nm 3 種激發(fā)光波長下增強(qiáng)后的55 個樣品分類示例，因為樣品數(shù)量較多，每種譜圖均選取幾個具有代表性的樣品展示。 在785nm激發(fā)光波長下，可以將樣品分為5組。 樣品18代表的是第1 組，其代表性峰主要集中在1 200～1500cm-1區(qū)域，三個主峰位于約1 240、1 285、1 360 cm-1處。第1 組與其他4 組的差異最為明顯，由于其在420、1 160、1585、1620cm-1等處均沒有出現(xiàn)明顯的特征峰信號，而這些特征峰都是結(jié)晶紫、甲基紫2B和堿性藍(lán)7的標(biāo)志性特征峰，因此可以推斷第1 組樣品中不含上述成分，其他4 組的光譜信息顯示出更多的相似性。 在420、920、1 160、1 585、1620 cm-1等位置的特征峰與甲基紫2B 和結(jié)晶紫的特征峰位置相吻合。在第4 組1300～1400cm-1區(qū)域、第5 組500～600 cm-1區(qū)域，存在實際差異性特征峰。在633nm 激發(fā)光波長下，增強(qiáng)后的樣品譜圖可分為3 組。區(qū)分率較低可能有兩種原因：（1）由于結(jié)晶紫和甲基紫2B 的響應(yīng)較強(qiáng)，樣品中存在的其他染料成分的信號被覆蓋，這可能導(dǎo)致用于區(qū)分樣品種類的成分信息沒有在SERS 光譜中表現(xiàn)出來；（2）相比于785nm 的激發(fā)光波長，633 nm 激發(fā)光波長對圓珠筆油墨信號的響應(yīng)較差，檢測到的樣品譜圖信息不夠完整。 在514nm激發(fā)光波長下，樣品同樣可分成3組，第1 組、第2 組都在1650cm-1處有一個特征峰， 這是其他組樣品所沒有的，而第1 組在1 650 cm-1處特征峰的相對強(qiáng)度要明顯低于第2 組，與此同時，在第2 組中還發(fā)現(xiàn)了位于605cm-1和1 510 cm-1處的差異性特征峰。

圖5 785、633、514 nm 這3 種激發(fā)光波長下的SERS 光譜分組情況

表3 列出了785、633、514 nm 3種激發(fā)光波長下的SERS譜圖的分組情況及其差異性特征峰信息。其中785 nm激發(fā)光波長下的區(qū)分率最高，能將樣品分成5 組，這可能是因為785nm 激發(fā)光波長下的SERS效果最好，能夠檢測到更多的特征峰信息（圖6）；633 nm激發(fā)光波長展現(xiàn)出了樣品48的差異性，可以將其與樣品50 歸為一類，樣品18 和樣品28 這2 種特殊的成分能夠明顯與其他圓珠筆樣品區(qū)分開來，這與785 nm 激發(fā)光波長檢測信息相吻合；而根據(jù)在514 nm 激發(fā)光波長下測得的SERS 譜圖信息，樣品47、樣品48 也檢測到與樣品18、樣品28 相似的差異性特征，這為種類區(qū)分提供了新的線索。

表3 785、633、514 nm這3種激發(fā)光波長下的樣品分組信息

表4 將785、633、514 nm 3 種激發(fā)光波長下的SERS 譜圖所有的分組數(shù)據(jù)結(jié)合在一起，得到了更為全面的分組信息，可以將樣品細(xì)分成8 組。

表4 樣品匯總分組信息

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在增強(qiáng)前，不同樣品的特征峰信號在強(qiáng)度上有很大差異。 一些樣品具有較強(qiáng)的信號，可以檢測到明顯的特征峰信息，而一些樣品由于本身信號較弱或者受到較強(qiáng)的熒光干擾，導(dǎo)致無法檢測出拉曼特征峰，因此增強(qiáng)前的樣本區(qū)分通常取決于拉曼信號的有無。 然而，在整體樣本信號較弱的情況下，這種區(qū)分方式的可靠性不高。 對于沒有特征峰信號或信號極弱的樣品， 可能會因為缺乏部分關(guān)鍵信息而錯誤的將其歸為一類， 導(dǎo)致樣品分類出現(xiàn)偏差。SERS 譜圖的分類是依據(jù)特征峰位置和相對強(qiáng)度的差異，這些信息可表明不同樣品在成分和含量上的區(qū)別，從而有效對其進(jìn)行分組。 在此基礎(chǔ)上將785、633、514 nm 3 種激發(fā)光波長下獲得的樣品分組信息相結(jié)合，可以獲取更加可靠的分組信息。

3 結(jié)論

本研究通過比較SERS 光譜與常規(guī)拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)未增強(qiáng)的拉曼譜圖不足以為圓珠筆的種類區(qū)分提供充分信息，甚至無法對某些樣品進(jìn)行定性，而SERS 譜圖可為區(qū)分圓珠筆油墨成分提供更多有效信息。 本研究比較了785、633、514 nm 3 種激發(fā)光波長下所獲得的光譜信息，發(fā)現(xiàn)785 nm 激發(fā)光波長下的區(qū)分率最高；而將這3 種激發(fā)光波長下的譜圖信息相結(jié)合，可獲取更加全面的區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)，使分組信息的可靠性大幅提高。 本研究方法通過對黑色圓珠筆墨跡快速、原位的表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行定性分析，為司法鑒定領(lǐng)域中書寫材料的快速檢測和分類提供了更多的思路。