移液吸頭微萃取技術在法醫(yī)毒物分析中的應用

陽碩，相佳宏，李子怡，許琳灝，施妍，劉偉

（1.司法鑒定科學研究院上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺司法部司法鑒定重點實驗室，上海 200063； 2.中國藥科大學藥學院，江蘇南京 210009）

樣品前處理是法醫(yī)毒物分析中一個重要的環(huán)節(jié)，尤其是體內毒物分析，生物檢材基質復雜、目標物含量極低且存在形式多樣，在復雜的生物基質中對痕量目標物進行提取、純化和濃縮直接關系到分析數據的準確性和結果判斷的科學性。 因此，高效且環(huán)保的樣品前處理方法對于分析結果的判斷顯得至關重要。

常見的樣品前處理方法主要有固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀法、微透析技術、超臨界流體萃取等。 固相萃取因其試劑用量少，且可與分析儀器在線連接，從而提高檢測效率，已被廣泛應用于復雜基質的提取富集，但缺點是耗時長、成本高以及重復性難以保證。 液液萃取也被廣泛應用于法醫(yī)毒物分析領域，如菊酯類農藥、苯二氮類鎮(zhèn)靜安眠藥、苯丙胺類毒品等[1]。 與固相萃取相比，液液萃取操作簡便、無特殊設備要求，但該樣品前處理方法中的混合液易形成乳化現象，且萃取劑通常為有毒有機溶劑，可能存在污染環(huán)境的問題。 除了上述提到的固相萃取和液液萃取外，還有許多其他的樣品前處理方式，如簡單快捷的蛋白沉淀法，可進行活體取樣的微透析技術以及相對環(huán)保的超臨界流體萃取技術等。 但是這些方法均存在不足，如蛋白沉淀法不能完全去除內源性物質，會稀釋樣品濃度，同時還存在生物樣本對環(huán)境造成污染的問題。 微透析技術雖然可以活體取樣，且所需樣本量較小，但是會對局部組織造成損傷，適用范圍較窄，只適用于水溶性、小分子物質，對法醫(yī)毒物分析領域的大多數目標物并不適用。 超臨界流體萃取技術可提取植物內的生物活性物質，但提取過程中使用的夾帶劑會殘留在組分中，由于對反應釜的要求很高，前期投入較大，故該方法多應用于工業(yè)提取。

相較于上述提及的多種樣品前處理方法，移液吸頭微萃取技術在法醫(yī)毒物分析中有著巨大優(yōu)勢。該方法所需樣本量小、提取速度快、回收率高、選擇性好，并且消耗的有機溶劑少，更加環(huán)保，適用于法醫(yī)毒物分析中的多種檢材和目標化合物。 移液吸頭微萃取技術屬于微固相萃?。é?solid phase extraction，μ-SPE），其在傳統(tǒng)固相萃取的基礎上進行改善和發(fā)展，已應用于諸多法醫(yī)毒物分析實例中。本文將系統(tǒng)性地介紹移液吸頭微萃取技術及其在法醫(yī)毒物分析中的應用。

1 前處理方法概述

固相萃取（solid phase extraction，SPE）可分為傳統(tǒng)的固相萃取、固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）、μ-SPE 和磁固相萃?。╩agnetic solid phase extraction，MSPE）。本文介紹的移液吸頭微萃取技術屬于μ-SPE，而μ-SPE 又可分為以下三類：移液吸頭固相萃?。é?solid phase extraction pipette tips，μ-SPE-PT）、分散式移液吸頭微萃?。╠isposable pipette extraction，DPX）、吸附劑填充式微萃取（micro-extraction by packed sorbent，MEPS）。本文所介紹的移液吸頭微萃取是指μ-SPE-PT（1989 年提出的）[2]和DPX（2003 年提出的）[3]。

移液吸頭微萃取技術適用于多種生物樣本的檢測分析，檢測效率高[4]。 移液吸頭微萃取技術是目前基因組學、蛋白質組學和代謝組學中純化、濃縮和選擇性分離蛋白質和多肽的重要工具[5-7]。 相比于傳統(tǒng)的固相萃取，移液吸頭微萃取所需要的樣品量小，消耗的有毒溶劑也更少，還可以重復使用，從而提高回收率[8]。 因此，該萃取技術不僅操作簡單，而且提取效率也更高。 對于生物樣品，尤其是樣本量較小的生物樣品，移液吸頭微萃取的效果要遠優(yōu)于傳統(tǒng)的固相萃取[9]。 萃取移液吸頭有商業(yè)版本和自制版本，自制移液吸頭大多應用于精神類藥物和污染物的萃取，可重復使用，減少了生物樣品帶來的環(huán)境污染和潛在傳染性，另外也可在實驗室進行一些預實驗，為其商業(yè)化提供建議和方向。 由于自制移液吸頭費時費力，因此在常規(guī)實踐中優(yōu)先選擇商業(yè)版本的移液吸頭。 移液吸頭微萃取是一種發(fā)展中的新技術，相比于其他前處理方式的成本更高，這也是其應用受限的主要因素。

1.1 μ-SPE-PT

μ-SPE-PT 是傳統(tǒng)固相萃取的小型化版本（具體可參考文獻[10]），其移液吸頭頭部有特殊的形狀，可以將吸附劑包裹其中，達到固定吸附劑的目的，移液吸頭體通常由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚烯烴制成[11]。 相比于傳統(tǒng)的SPE，μ-SPE-PT 的樣品萃取速度更快，且回收率也更高[12]。

μ-SPE-PT 的應用方法簡單：首先，選用合適的溶劑激活吸附劑。 吸附劑位點活化后使該固相和樣品中的分析物之間產生適當的分子作用，然后使樣品溶液進入移液吸頭，吸附劑（固相）可以吸附樣品中目標化合物和干擾化合物，隨后使用有機溶劑或混合溶劑來去除干擾物。最后，用一種溶劑洗脫目標化合物[10]。 使用時應注意移液吸頭堵塞和針管污染的問題，因此，樣品在使用移液吸頭提取前有必要對樣品進行簡單的預處理，且吸取樣品時應該小心謹慎，以防止污染。

1.2 DPX

DPX 由傳統(tǒng)的SPE 改造而來，是固相萃取和分散萃取的結合。 DPX 萃取裝置有1 mL 或5 mL 兩種容量的移液吸頭，最初粉狀吸附劑自由地分散在移液吸頭內，后來對裝置進行改進，吸附劑可以很好地分散在兩個固定裝置之間，處于裝置下端較低的部分（具體可參考文獻[10]），有利于液體的雙向流動，同時還可防止注射器被污染。

DPX 的使用步驟大致與μ-SPE-PT 相類似，但原理有一些不同。 首先，用溶劑來活化吸附劑，然后將樣品吸入移液吸頭并與吸附劑充分混合，最后用合適的洗脫劑洗脫雜質。 如果所需組分的回收率較低， 則可通過重復整個過程的步驟來提高效率，包括重復樣品上樣和樣品洗脫。 與μ-SPE-PT 不同的是，在提取過程中可吸入少許空氣，使樣品溶液中的目標物和吸附劑充分接觸、混合，從而提高樣品回收率[13]。 DPX 前處理過程簡單，只需要在上樣前對樣品進行簡單的預處理（如稀釋、離心、蛋白沉淀等）即可，以防止萃取移液吸頭發(fā)生堵塞[14]。

2 移液吸頭微萃取技術在法醫(yī)毒物分析中的應用

DPX 和μ-SPE-PT 是常見的兩種微萃取移液吸頭，市面上有許多商業(yè)化的微萃取移液吸頭，對于不同性質的目標物，其對應的吸附劑也有所不同。 在法醫(yī)毒物分析領域，目前已報道的商業(yè)萃取移液吸頭的吸附劑有：苯乙烯-二乙烯苯（SDVB）、磺酸官能化的陽離子交換劑（CX）、十八烷基硅烷顆粒（C18）、反向吸附劑-鹽析（RP-S）、弱陰離子交換劑-鹽析（WAX-S）、強陽離子交換劑（SCX）等。除了商用吸附劑，許多實驗室也會通過自制吸附劑來達到檢測目的。 已報道的有關法醫(yī)毒物分析的自制萃取移液吸頭吸附劑有：聚丙烯腈和金屬有機骨架組成的納米纖維（PAN/MIL-53（Fe））、微碳納米管（MWCNT）、胺功能化鋯基金屬有機框架（Zr-MOFNH2）、苯乙烯-二乙烯苯共聚物（SDVB copolymer/PANI composites）、十八烷基硅烷外表面包有牛血清白蛋白（RAM-C18-BSA）、三維-離子液體-Fe3O4-石墨烯納米復合吸附劑（3D-IL-Fe3O4-GO）、聚甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯[poly（MMA-co-EDMA）]等。 已有很多研究[15-42]報道過移液吸頭微萃取在法醫(yī)毒物分析領域中的應用，具體如表1 所示。

表1 移液吸頭微萃取在法醫(yī)毒物分析中的應用

2.1 移液吸頭微萃取技術在毒品分析中的應用

2.1.1 大麻類

大麻是全球范圍內濫用最為嚴重的毒品[15]。Δ9-四氫大麻酚（Δ9-THC）是大麻中的主要活性成分，而Δ9-四氫大麻酸（Δ9-THC-COOH）是其主要代謝產物，因此Δ9-THC-COOH 是尿液中的主要檢測目標物，Δ9-THC 是血液及口腔液中的主要檢測目標物?？诜?-THC 的生物利用度低，僅有4%～20%，口服后4～6 h 的血藥峰質量濃度通常不超過10 ng/mL[43]，如果近期有攝入過大麻，在呼氣中也可檢出Δ9-THC，質量濃度通常比血液中的更低（pg/mL）[44]。 因此，需要建立一種更加快速靈敏且高效的檢測分析方法。目前，已報道的檢測血液中Δ9-THC 含量的前處理方法有SPE[45-46]和LLE[47-49]等。 但前處理時間較長，不利于半衰期短且生物利用度低的Δ9-THC 在生物基質中的檢測分析，且重復性也難以保證，而快捷的移液吸頭微萃取能夠縮短前處理時間且具有較高的重復性，彌補了SPE、LLE 等存在的缺陷。LUO 等[16]建立一種在血液和呼氣中應用新型衍生化法檢測大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）、四氫大麻酚（THC）及其代謝物的方法，將200 μL 血液及呼氣樣品加入內標后，重氮衍生化0.5 h，衍生化后的呼氣樣品直接進入LC-MS/MS 系統(tǒng)分析，血液樣品應用商業(yè)的DPX 萃取移液吸頭和WAX-S 吸附劑，并利用衍生化反應顯著提升了在血液中檢測CBN、CBD 等的靈敏度，血液和呼氣中目標物定量限分別低至0.1～0.25 ng/mL 和0.5～2.5 pg/mL，較以往的在呼氣中檢測THC 的方法靈敏度提高了約100 倍[44，50-51]。

已報道的應用移液吸頭微萃取技術在生物基質中檢測分析大麻類的方法中（表1），均使用內標進行校正其輕微的基質抑制作用[23]。 大多數前處理方式為乙腈沉淀蛋白后使用DPX 萃取移液吸頭和弱陰離子交換劑-鹽析（WAX-S）吸附劑進行提取。由于THC 及其代謝物為弱酸性化合物， 因此選擇弱陰離子交換劑進行吸附。 目標物均為類脂溶性化合物，難溶于水，鹽析可以輔助目標物從水相轉移到有機相，從而進一步提高回收率。 另外，雜質會保存在吸附劑上，故不需清洗和洗脫步驟，方便快捷。

2.1.2 苯丙胺類

甲基苯丙胺是一種強效的中樞神經興奮劑。 在已報道的生物基質中檢測苯丙胺類毒品的方法中，大多數前處理方式為SPE[52-54]或LLE[55-58]等，但是通常需要的前處理時間較長，且會消耗大量的有機溶劑，容易造成環(huán)境污染。 KUMAZAWA 等分別應用μ-SPE-PT 萃取移液吸頭和C18吸附劑提取血液[22]和尿液[25]中的甲基苯丙胺和苯丙胺。在100 μL 的血液中加入400 μL 水和50 μL 5 mol/L 氫氧化鈉溶液，然后經過25 次移液吸頭萃取循環(huán)，將吸附劑與目標化合物充分混合后用甲醇洗脫，洗脫5 次后用三氟乙酸酐進行衍生化，最后使用GC-MS 進行分析檢測。其中，甲基苯丙胺的回收率大于87.6%，苯丙胺的回收率大于81.7%，檢出限分別為1.5、1.1ng/mL。尿液的體積為500 μL，前處理步驟和血液一致，最后使用GC-MS 進行檢測分析，甲基苯丙胺的回收率大于82.9%，苯丙胺的回收率大于82.2%，檢出限分別為0.08、0.1 ng/mL。 與其他檢測方法相比（表1），KUMAZAWA 等[22]和MONTESANO 等[23]所提的方法中，移液吸頭提取循環(huán)次數最多（25 次），回收率也較高（79.7%～94.7%），側面反映出循環(huán)次數的增加有利于提高目標物的回收率，但要注意吸附劑飽和現象[23]。

2.1.3 其他毒品

除了上述提到的大麻類和苯丙胺類毒品，也有應用移液吸頭微萃取技術對其他毒品進行提取純化的報道。 STOWE 等[59]提出一種在頭發(fā)基質中檢測阿片類物質的方法，該方法的前處理過程應用了DPX 萃取移液吸頭和CX 吸附劑。 首先，將12 mg頭發(fā)置于1.1 mL 甲醇和三氟乙酸（體積比為90∶10）溶液中，微波爐中90 ℃加熱60 min，使用含有吸附劑的萃取劑移液吸頭提取后用600 μL 0.1 mol/L 的乙酸鹽緩沖溶液沖洗兩次，甲醇溶液沖洗一次，以去除雜質干擾。 再使用550 μL 二氯甲烷-異丙醇-氫氧化銨（體積比為80∶20∶3）溶液洗脫，40 ℃下氮氣吹干洗脫液，最后用225 μL 0.1%（體積分數）甲酸水溶液復溶。 該前處理方法結合LC-MS 技術對頭發(fā)中可待因、嗎啡、羥考酮等阿片類物質進行檢測分析，回收率為54%～81%，定量限為0.05 ng/mg。此外，由于阿片類藥物在C18吸附劑上的保留較差，故在檢測目標物含有阿片類物質時，微萃取移液吸頭的吸附劑通常不選擇C18吸附劑。

2.2 移液吸頭微萃取技術在精神類藥物分析中的應用

精神藥物主要有抗抑郁藥、抗精神病藥、抗驚厥藥和其他相關藥物，主要目的是治療各種精神疾病。 近年來，精神藥物的濫用也在增加[60]，對公共安全造成了一定威脅。 KUMAZAWA 等[35]提出一種在100 μL 血漿中檢測分析五種酚噻嗪類物質的方法，該方法應用μ-SPE-PT 萃取移液吸頭和C18吸附劑進行前處理提?。ㄑh(huán)25 次），然后使用200μL10%甲醇溶液清洗雜質，清洗后的移液吸頭放置在真空下干燥30 s，干燥后用100 μL 甲醇洗脫5 min，洗脫液直接注入GC-MS 進行檢測分析，目標物回收率為91%～95%，定量限為2.5～20 ng/mL。 該提取方法的洗脫液直接注入氣相色譜儀，無需揮干復溶，步驟簡單快捷，相比與常規(guī)的固相萃取，時間縮短了至少15 min，另外消耗的樣品僅100 μL，溶劑總共消耗0.7 mL，均比之前的報道更少，有利于減少環(huán)境污染。 該方法為法醫(yī)毒物分析中酚噻嗪類藥物的篩選和定量分析提供了新的思路和工具， 有望引入常規(guī)檢測，更加廣泛的應用。

3 結語與展望

在法醫(yī)毒物分析中，移液吸頭微萃取技術作為一種在傳統(tǒng)固相萃取基礎上發(fā)展而來的先進技術，適用于各種生物樣品的前處理，其應用前景十分可觀。 相比于傳統(tǒng)固相萃取，移液吸頭微萃取技術具有提取效率高、環(huán)保、所需樣品量少、可重復使用和可自動化等優(yōu)點，雖然也有價格昂貴、商業(yè)化產品數量少和吸附劑會發(fā)生飽和等不足之處，但發(fā)展前景依然十分可觀，有望進一步降低成本，擴大生產，爭取盡早在常規(guī)檢測中廣泛應用。