基于離子交換色譜法同時(shí)測(cè)定果酒中8種有機(jī)酸

徐玲萍，張芳芳，羅振玲，夏慧麗*

（臺(tái)州市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 臺(tái)州 318000）

所謂“無(wú)酸不成酒”，酸具有呈味作用，適量的酸可使酒口感活潑、爽口、協(xié)調(diào)[1]。水果本身含有大量的有機(jī)酸，果酒在發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生不同種類的酸[2-4]。這些酸的組成和含量有別于白酒、黃酒，使果酒具備其獨(dú)特風(fēng)味。酸含量過低，酒味寡淡、單調(diào)；酸含量過高，酒味粗澀、不協(xié)調(diào)。曾竟藍(lán)等[5]介紹了常見果酒中主要有機(jī)酸的種類和含量，并綜述了有機(jī)酸對(duì)果酒口感、風(fēng)味、穩(wěn)定性等方面的影響。劉淑珍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用D314弱堿性樹脂進(jìn)行降酸處理獼猴桃酒能更好地保存獼猴桃的特征香氣成分，感官品質(zhì)更好。衛(wèi)春會(huì)等[7]以山葡萄酒為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中不同的有機(jī)酸呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，并闡明有機(jī)酸對(duì)山葡萄酒的色澤、口感、品質(zhì)及生物穩(wěn)定性方面的重要影響。因此，研究果酒中有機(jī)酸的組成和含量，用于解析果酒風(fēng)味形成、控制果酒的品質(zhì)具有重要意義。

目前，有機(jī)酸的檢測(cè)方法主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[9]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[14]和離子色譜（ion chromatography，IC）法[15-16]。GC及GC-MS法主要用于測(cè)定易揮發(fā)的小分子有機(jī)酸，對(duì)于大分子有機(jī)酸需要衍生化處理，重現(xiàn)性差[17]。HPLC及LC-MS/MS法受到樣品基質(zhì)干擾，需要更為復(fù)雜的前處理過程，并且往往使用極性大的流動(dòng)相，對(duì)色譜柱破壞性大[18]。離子色譜法因其靈敏度高、對(duì)物質(zhì)有特異性選擇、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為選擇的重點(diǎn)[19]。離子色譜主要包括離子交換色譜、離子排斥色譜和離子對(duì)色譜三種，其中應(yīng)用最廣泛的是離子交換色譜。離子交換色譜是利用離子交換的原理對(duì)共存的多種陰離子或陽(yáng)離子進(jìn)行分離檢測(cè)。近幾年應(yīng)用離子色譜法開展有機(jī)酸測(cè)定的研究越來(lái)越廣泛[20-22]，但相關(guān)研究很少涉及解決蘋果酸和琥珀酸兩個(gè)主要成分分離困難問題，也鮮有發(fā)現(xiàn)用離子色譜法同時(shí)測(cè)定果酒樣品中有機(jī)酸組分的研究。

本研究以葡萄酒為基質(zhì)，采用電導(dǎo)抑制器離子色譜法，考察樣品前處理、色譜柱、梯度洗脫程序等多方面的影響因素，建立同時(shí)測(cè)定果酒中8種有機(jī)酸的離子交換色譜法，為研究果酒中有機(jī)酸的組成和變化規(guī)律提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-（-）-奎寧酸、乙酸、甲酸、乳酸、檸檬酸、DL-蘋果酸、琥珀酸、DL-酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90%）：上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)公司；IC-Guard RP凈化小柱（1 mL）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；楊梅酒、葡萄酒、桑葚酒、荔枝酒、藍(lán)莓酒：市售。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex-ICS6000離子色譜儀、Dionex IonPac AS11-HC色譜柱、Dionex IonPac AS19色譜柱、Dionex IonPac AG19色譜柱：美國(guó)ThermoFisher公司；MS204S電子天平：梅特勒-托利多公司；Milli-Q超純水儀：美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取D-（-）-奎寧酸、乳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、DL-蘋果酸、琥珀酸、DL-酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于同一容量瓶，超純水定容至50 mL，配制成各組分質(zhì)量濃度均為20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用超純水配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理方法的選擇

取葡萄酒樣品1 mL，用超純水稀釋并定容至100 mL，記為樣品A，即為直接稀釋的前處理方法。取樣品A通過RP凈化小柱（經(jīng)5 mL甲醇和15 mL超純水活化），棄去前面3 mL流出液，收集后面流出液，記為樣品B，即為稀釋樣品再經(jīng)RP凈化小柱凈化的前處理方法。樣品經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，觀察樣品外觀，并進(jìn)行離子交換色譜分析，考察2種前處理方式對(duì)樣品雜質(zhì)的凈化效果及目標(biāo)物的保留能力。

1.3.3 儀器條件

分離色譜柱：Dionex IonPac AS19（4 mm×250 mm）；保護(hù)柱：Dionex IonPac AG19（4 mm×50 mm）；進(jìn)樣量：50 μL；流動(dòng)相：KOH溶液（由Dionex EGC500 KOH淋洗液自動(dòng)發(fā)生器在線產(chǎn)生）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；池溫：30 ℃；柱溫：30 ℃；抑制器：Dionex ADRS 600 4 mm；抑制電壓：3.7 V；梯度洗脫條件：0～13 min，4 mmol/L KOH溶液；13～14 min，4～16 mmol/L KOH溶液；14～33 min，16 mmol/L KOH溶液；33～37 min，16～50 mmol/L KOH溶液；37～43 min，50 mmol/L KOH溶液；43～45 min，50～4mmol/LKOH溶液；45～50min，4mmol/LKOH溶液。

1.3.4 儀器條件選擇

色譜柱選擇：分別采用Dionex IonPac AS11-HC和Dionex IonPac AS 19兩種陰離子交換柱對(duì)質(zhì)量濃度為10 mg/L的8種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，考察不同的色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。

淋洗液濃度選擇：調(diào)整氫氧化鉀淋洗液濃度，對(duì)質(zhì)量濃度為10 mg/L的8種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定?？疾觳煌瑵舛龋? mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的氫氧化鉀淋洗液對(duì)奎寧酸、乳酸、乙酸、甲酸的分離效果，不同濃度（10 mmol/L、13 mmol/L、16 mmol/L、19 mmol/L）的氫氧化鉀淋洗液對(duì)蘋果酸、酒石酸、琥珀酸的分離效果。

流動(dòng)相流速選擇：設(shè)置不同流動(dòng)相流速（0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min），從柱壓和柱效方面考察方法的適宜性。

1.3.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系：采用最優(yōu)的檢測(cè)方法對(duì)不同質(zhì)量濃度的有機(jī)酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以有機(jī)酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

精密度試驗(yàn)：選擇質(zhì)量濃度為10 mg/L的8種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次重復(fù)進(jìn)樣，記錄目標(biāo)化合物保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）和峰面積RSD。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：選擇質(zhì)量濃度為10 mg/L的8種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄目標(biāo)化合物峰面積，并計(jì)算峰面積RSD。

檢出限、定量限試驗(yàn)：選擇質(zhì)量濃度為20 mg/L的8種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用最優(yōu)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，以3倍的信噪比確定方法檢出限（limit of detection，LOD），以10倍的信噪比確定方法定量限（limit of quantitatively，LOQ）。

加標(biāo)回收率試驗(yàn)：取葡萄酒樣品，結(jié)合本底值添加一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，奎寧酸、乙酸、甲酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸為250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L三個(gè)水平加標(biāo)量，乳酸為1 000 mg/L、2 000 mg/L、4 000 mg/L三個(gè)水平加標(biāo)量，酒石酸為500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L三個(gè)水平加標(biāo)量。平行測(cè)定三次，計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率及RSD。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Chromeleon 7.2.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

發(fā)酵型果酒因未經(jīng)蒸餾處理，含有色素、氨基酸、糖類、酯類等豐富的有機(jī)物[23-24]，這些有機(jī)物會(huì)影響色譜柱的分離效果，縮短色譜柱的使用壽命。本研究以葡萄酒為基質(zhì)，對(duì)直接稀釋（A）和稀釋后經(jīng)RP柱凈化（B）的兩種前處理方法進(jìn)行比較。從外觀上比較，樣品A呈紅色有顆粒物，樣品B無(wú)色澄清。采用離子交換色譜對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，相較于樣品A，樣品B圖譜基線平穩(wěn)，雜質(zhì)峰少。因此，為保護(hù)色譜柱，減少雜質(zhì)干擾，最終選擇稀釋后經(jīng)RP凈化柱凈化的前處理方式。

圖1 葡萄酒樣品經(jīng)不同前處理方法離子交換色譜圖Fig.1 Ion exchange chromatograms of wine samples with different pretreatment methods

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

分別采用Dionex IonPac AS11-HC和Dionex IonPac AS19兩種常用陰離子交換柱對(duì)質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)Dionex IonPac AS11-HC（A）和Dionex IonPac AS19（B）色譜柱分離后的離子交換色譜圖Fig.2 Ion exchange chromatogram of 10 mg/L standard working solution separated by Dionex IonPac AS11-HC (A) and Dionex IonPac AS19 (B) columns

由圖2可知，兩種色譜柱對(duì)有機(jī)酸的分離效果存在顯著的差異。Dionex IonPac AS11-HC色譜柱無(wú)法很好地將琥珀酸和蘋果酸分開，而Dionex IonPac AS19色譜柱能將8種有機(jī)酸有效分離，其中酒石酸和琥珀酸分離度稍差，其余組份的分離度均＞1.4，分析原因可能是Dionex IonPac AS19色譜柱的固定相填料主要為超孔型EVB-DVB顆粒，本身帶有正電荷，具有高容量、強(qiáng)親水的特點(diǎn)，適用于各類復(fù)雜樣品基體中的陰離子測(cè)定。因此，最終選用Dionex IonPac AS19色譜柱。

2.2.2 淋洗液濃度優(yōu)化

因奎寧酸、乳酸、乙酸、甲酸待測(cè)組分與固定相親和力較弱，最早被洗脫出來(lái)。選取不同濃度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的氫氧化鉀溶液作為初始淋洗液，考察其對(duì)這4種有機(jī)酸的分離效果，結(jié)果見圖3。由圖3可知，氫氧化鉀淋洗液濃度越高，洗脫能力越強(qiáng)，分離效果越差。當(dāng)6 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時(shí)，奎寧酸、乳酸和乙酸分離效果不理想；當(dāng)2 mmol/L和4 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時(shí)，目標(biāo)化合物均能實(shí)現(xiàn)很好的分離，其中4 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時(shí)，總用時(shí)少，信號(hào)響應(yīng)高，檢測(cè)效率和靈敏度更優(yōu)。故選用4 mmol/L氫氧化鉀作為0～13 min的淋洗濃度。

圖3 不同濃度氫氧化鉀淋洗液分離奎寧酸、乳酸、乙酸及甲酸的離子交換色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatogram of quinic acid, lactate, acetate and formic acid separated at different concentrations of potassium hydroxide

蘋果酸（2-羥基丁二酸）、酒石酸（2,3-二羥基丁二酸）、琥珀酸（丁二酸）的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較相似，目標(biāo)物出峰時(shí)間較為集中，分離難度大。因此，以10 mmol/L、13 mmol/L、16 mmol/L、19 mmol/L的氫氧化鉀作為淋洗液，考察其分離效果，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度氫氧化鉀淋洗液分離蘋果酸、酒石酸及琥珀酸的離子交換色譜圖Fig.4 Ion exchange chromatogram of malate,tartaric acid and succinate separated at different concentrations of potassium hydroxide

由圖4可知，10 mmol/L、13 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時(shí)，峰有拖尾現(xiàn)象，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)；當(dāng)選用19 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時(shí)，蘋果酸、酒石酸和琥珀酸分離效果略差，影響其定量的準(zhǔn)確性。綜合比較，16 mmol/L氫氧化鉀作為淋洗液時(shí)，蘋果酸、酒石酸和琥珀酸的分離效果均較佳，因此，確定16 mmol/L氫氧化鉀作為14～33 min的淋洗濃度。

2.2.3 流速優(yōu)化

流動(dòng)相流速對(duì)保留時(shí)間和系統(tǒng)壓力都有很大的影響，因此考察不同流速（0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min）對(duì)系統(tǒng)壓力、峰形、出峰時(shí)間方面的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，流速為1.2 mL/min時(shí)，柱壓接近3 000 psi，目標(biāo)峰尖銳對(duì)稱；流速為1.0 mL/min時(shí)，柱壓接近2 000 psi，目標(biāo)峰略有變寬；流速為0.8 mL/L柱效較前兩者有明顯的降低，目標(biāo)峰延后明顯，因此，最終確定流速為1.0 mL/min。

圖5 不同淋洗液流速下10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液的離子交換色譜圖Fig.5 Ion exchange chromatogram of 10 mg/L standard working solution at different eluent flow rates

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限、精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)8種有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表1。由表1可知，8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.996 5～0.998 7，說明各組份含量與峰面積呈良好線性關(guān)系，該方法可對(duì)相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。8種有機(jī)酸的檢出限（LOD）為0.82～4.05 mg/L，定量限（LOQ）為2.74～13.5 mg/L，保留時(shí)間精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD≤0.07%，峰面積精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD≤1.90%，方法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD≤3.65%，各參數(shù)符合方法學(xué)要求，能滿足8種有機(jī)酸定性和定量分析的要求。

表1 8種有機(jī)酸的線性相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、精密度和穩(wěn)定性結(jié)果Table 1 Correlation coefficients, limit of detection, limit of quantification, precision and stability results of the 8 organic acids

2.3.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

葡萄酒樣品添加不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，8種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率在82%～125%之間，加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果的RSD為0.21%～5.13%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 葡萄酒樣品8種有機(jī)酸含量測(cè)定加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of 8 organic acid content determination and standard recovery rate tests of wine samples

2.4 不同基質(zhì)樣品8種有機(jī)酸含量的測(cè)定

有機(jī)酸的組成和占比構(gòu)建出不同果酒特有的味道，也是果酒功效性成分的重要來(lái)源之一[25-27]。為考察不同果酒中主要有機(jī)酸的組成和含量，運(yùn)用建立的檢測(cè)方法，對(duì)在市面上隨機(jī)采集的葡萄酒、桑葚酒、藍(lán)莓酒、楊梅酒和荔枝酒等不同基質(zhì)果酒樣品中的8種有機(jī)酸成分及含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 5種果酒樣品中8種有機(jī)酸含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of 8 organic acids in 5 fruit wine samples

由表3可知，葡萄酒主要有機(jī)酸成分是乳酸、酒石酸、琥珀酸和乙酸，這4種有機(jī)酸的總含量為5 498.50 mg/L，占總有機(jī)酸含量的99.7%，為葡萄酒主要呈味物質(zhì)。桑葚酒、藍(lán)莓酒、楊梅酒、荔枝酒的主要有機(jī)酸均為檸檬酸，其含量在2 888.65～5 730.89 mg/L之間，占比均＞50%。此外，桑葚酒和藍(lán)莓酒含有豐富的酒石酸，含量分別為424.26 mg/L和772.39 mg/L。楊梅酒含有乙酸和琥珀酸，含量分別為1 185.15 mg/L和575.37 mg/L，是其獨(dú)特的果酸味重要來(lái)源。荔枝酒相對(duì)于其他果酒蘋果酸含量更高，為522.26 mg/L。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化樣品前處理和儀器條件建立了同時(shí)測(cè)定發(fā)酵型果酒中8種有機(jī)酸含量的離子交換色譜法，即樣品經(jīng)稀釋和RP柱凈化后，經(jīng)Dionex IonPac AS19色譜柱（4 mm×250 mm）分離，0～13 min 4 mmol/L和4～33 min 16 mmol/L氫氧化鉀梯度淋洗，采用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2在0.996 5～0.998 7之間，檢出限為0.82～4.05 mg/L，定量限為2.74～13.5 mg/L，精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜3%，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD≤3.65%，加標(biāo)回收率為82%～125%，加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果的RSD為0.21%～5.13%。該方法操作簡(jiǎn)便、性能穩(wěn)定、安全環(huán)保，適用于各類果酒的測(cè)定。采用該方法對(duì)5類市售果酒樣品中的8種有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)葡萄酒主要有機(jī)酸成分為乳酸、酒石酸、琥珀酸和乙酸，這4種有機(jī)酸的總含量為5 498.50 mg/L；桑葚酒、藍(lán)莓酒、楊梅酒、荔枝酒的主要有機(jī)酸均為檸檬酸，其含量在2 888.65～5 730.89 mg/L之間。