基于GC-IMS不同年份黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

沈 棚，薛紅瑋

（1.上?？抵Z執(zhí)信食品有限公司，上海 201703；2.上海營(yíng)家生物科技有限公司，上海 201703）

黃酒與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒，以玉米、稻米、小麥、黍米等為原料，經(jīng)過(guò)蒸料，拌以米曲、酒藥或麥曲，進(jìn)行糖化和發(fā)酵制成[1]。黃酒通常具有色、香、味、格的復(fù)雜特征[2]。由于發(fā)酵原料[3]、釀造工藝[4]、發(fā)酵微生物[5]、貯藏環(huán)境[6]以及陳釀時(shí)間[7]的不同，黃酒中所形成的風(fēng)味物質(zhì)也不盡相同。其中，陳釀是黃酒生產(chǎn)工藝中較為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，陳釀時(shí)間也可稱為酒齡，是評(píng)價(jià)黃酒質(zhì)量的重要指標(biāo)。黃酒在陳釀過(guò)程中會(huì)發(fā)生大量的物理和化學(xué)變化，這些變化對(duì)于酒體協(xié)調(diào)性和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵性作用。目前，針對(duì)不同陳釀時(shí)間黃酒風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究已逐步展開[8]，利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)分析黃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)的種類及其含量，有助于了解不同陳釀時(shí)間黃酒的香氣組成成分及其風(fēng)味特征[9]。

氣相色譜-離子遷移色譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）法是一種快速檢測(cè)分析待測(cè)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的技術(shù)[10]。該技術(shù)無(wú)需樣品前處理，極大簡(jiǎn)化了分析過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，且其靈敏度更高，檢測(cè)限更低[11]。近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于分析酒類、茶葉、香精香料、肉制品、中藥等樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[12]。鮮靈芝等[13]使用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）比較新品糯米楊梅酒與楊梅酒的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果表明，兩種樣品組成成分有顯著差異，其中，糯米楊梅酒的揮發(fā)性物質(zhì)種類更為豐富；顧雙等[14]采用GC-IMS技術(shù)建立了一種黃酒標(biāo)注酒齡及品牌快速鑒別的方法，結(jié)果表明，GC-IMS技術(shù)在黃酒質(zhì)量評(píng)估等領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。雖然GC-IMS技術(shù)已廣泛運(yùn)用于食品風(fēng)味檢測(cè)，但關(guān)于GC-IMS技術(shù)分析不同貯藏年份黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面的研究鮮有報(bào)道。

本研究采用GC-IMS技術(shù)對(duì)不同年份黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，構(gòu)建指紋圖譜，并進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚類分析（cluster analysis，CA），以期為黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒別提供科學(xué)依據(jù)，為不同陳釀年份黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別選取2008、2010、2012、2014、2018、2019年份采用相同工藝分別制作的6個(gè)黃酒樣品，分別編號(hào)為A08、A10、A12、A14、A18、A19：產(chǎn)地為紹興。

2-辛醇（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec氣相色譜離子遷移譜儀：德國(guó)GAS公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱1mL樣品置于20mL頂空瓶，將5μL2-辛醇（500mg/L）作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)加入樣品中。在常溫下經(jīng)頂空進(jìn)樣，并采用氣相色譜-離子遷移譜儀進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 GC-IMS分析

進(jìn)樣條件：采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣體積200 μL，孵育時(shí)間15 min，孵育溫度60 ℃，進(jìn)樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

GC條件：MXT-WAX色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm），分析時(shí)間40 min，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣為高純氮?dú)猓∟2），載氣/漂移氣條件：初始流速為2 mL/min，維持2 min；8 min內(nèi)升至10 mL/min，在10 min內(nèi)升至100 mL/min，維持20 min，總GC運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)為40 min。

IMS條件：漂移管長(zhǎng)度5.3 cm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；IMS溫度45 ℃。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用風(fēng)味分析儀配套的分析軟件VOCal用于分析譜圖和數(shù)據(jù)的定性定量，應(yīng)用軟件內(nèi)置的美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。運(yùn)用Reporter插件直接對(duì)比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖、三維譜圖和差異譜圖）。使用Gallery Plot插件進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比。應(yīng)用Dynamic PCA插件，制作動(dòng)態(tài)主成分分析和相似度分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-IMS圖譜分析

不同年份黃酒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜-離子遷移譜見圖1。橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰（reactive ion peak，RIP），RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。由圖1可知，黃酒樣品中揮發(fā)性有機(jī)物成分在2 500 s完成GC分離，在2 ms內(nèi)完成IMS分離。大部分化合物能夠在前1 000 s內(nèi)出峰并有較好分離度。6個(gè)不同貯藏年份黃酒樣品檢測(cè)到的揮發(fā)性有機(jī)物種類大致相同，但各物質(zhì)在含量上有所區(qū)別，隨貯藏年份的延長(zhǎng)而含量增高的揮發(fā)性成分可能對(duì)黃酒的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)，可作為提升黃酒品質(zhì)的參考依據(jù)。

圖1 不同年份黃酒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜-離子遷移譜圖Fig.1 Gas chromatography-ion migration chromatography of volatile flavor substances in Huangjiu samples with different years

2.2 不同年份黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

通過(guò)GC-IMS檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可知，6個(gè)不同貯藏年份黃酒樣中共檢出63種揮發(fā)性成分，其中，醇類11種，酯類27種，酮類8種，醛類6種以及其他類11種。酒樣A08、A10、A12、A14、A18、A19的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別檢出62種、61種、63種、62種、59種，其中，共有成分58種。6個(gè)樣品的黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總含量基本上隨著年份的增長(zhǎng)而逐漸減少，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量分別為955.42 μg/L、758.62 μg/L、593.8 μg/L、581.08 μg/L、528.89 μg/L、536.66 μg/L，其中，6個(gè)樣品中檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為醇類、酯類、醛酮類物質(zhì)等。這與王琳[15]通過(guò)頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)古南豐三年陳、五年陳、六年陳、八年陳和十年陳的年份黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量整體呈下降趨勢(shì)的結(jié)果相符。

表1 不同年份黃酒中鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Volatile flavor substances identified in different years of Huangjiu samples

酯類化合物是黃酒中最重要的風(fēng)味化合物之一，酯類化合物在很大程度上可以決定黃酒所需的花香味、果香味等，酯類物質(zhì)的不斷積累也是黃酒越陳越香一個(gè)原因[16]。酯類化合物的含量隨年份的增加而呈上升趨勢(shì)。樣品A08、A10、A12、A14、A18、A19的酯類物質(zhì)中分別檢測(cè)出24種、27種、27種、25種、27種、27種，其總酯含量分別為55.64 μg/L、62.13 μg/L、71.02 μg/L、76.61 μg/L、76.79 μg/L、92.56 μg/L。共有成分23種，分別為乙酸烯丙酯、醋酸冰片酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、二甲基戊酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基戊酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、甲酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、乳酸乙酯、丙酸乙酯、甲酸香葉酯、己基丁酸酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、甲酸異丁酯、丁酸異丙酯、2-糠酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸甲酯。根據(jù)相關(guān)研究可知，乙酯類化合物的數(shù)量及其含量則在酯類化合物中占有絕對(duì)性的優(yōu)勢(shì)[9]。在本研究中，乙酸乙酯和乳酸乙酯同樣在酯類中占比較大，黃酒樣品A08、A10、A12、A14、A18、A19中乙酸乙酯和乳酸乙酯的質(zhì)量濃度范圍分別為12.47～23.16μg/L和11.65～30.21μg/L。乳酸乙酯具有水果香、奶油味[17]，而乙酸乙酯呈香蕉味、草莓味[18]，二者是對(duì)黃酒香氣影響較大的物質(zhì)。彭金龍等[19]添加不同糖化劑釀造黃酒，并對(duì)3種不同糖化劑所釀造的黃酒的部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，乳酸乙酯與乙酸乙酯同樣在酯類化合物中占比較大。

黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量中占比最大的物質(zhì)為醇類化合物，醇類化合物可由糖代謝、氨基酸脫氫脫羧作用產(chǎn)生，是陳化的酯類化合物的前體物質(zhì)[20]。本研究中，6個(gè)黃酒樣品的醇類物質(zhì)中共檢出11種，其總醇含量分別為867.21 μg/L、667.87 μg/L、494.43 μg/L、478.35 μg/L、424.51 μg/L、414.19 μg/L，醇類化合物含量隨著貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。江偉等[21]采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)了不同酒齡的黃酒中34種風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明，在陳釀期間醇類化合物呈下降趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果相同。

醛酮類化合物同樣是黃酒中重要揮發(fā)性物質(zhì)之一，樣品A08、A10、A12、A14、A18、A19的醛酮類物質(zhì)中分別檢測(cè)出13種、13種、14種、14種、13種、13種，共有物質(zhì)13種。其中總酮含量分別為3.45μg/L、2.44μg/L、2.28μg/L、2.13μg/L、2.03 μg/L、1.64 μg/L，整體呈下降趨勢(shì)；同樣，總?cè)┖糠謩e為16.24 μg/L、13.44 μg/L、11.29 μg/L、10.47 μg/L、9.01 μg/L、8.27 μg/L，有明顯的下降趨勢(shì)。醛酮類化合物通常具有特殊的香氣，與酸類化合物對(duì)總體香氣起到協(xié)調(diào)、融合的作用[22]，如糠醛呈焦糖香、苦杏仁香，這可使得黃酒具備與其他酒類極其容易區(qū)分的特征[23]。

本研究中所檢出的酸類、蒎烯、醛類均有明顯變化趨勢(shì)，各有其獨(dú)特的呈香特點(diǎn)，對(duì)黃酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有不容忽視的作用。由結(jié)果可知，醇類與酯類是黃酒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，葛東穎等[24]采用電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同原料釀造黃酒的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，醇類和酯類物質(zhì)為黃酒中最為重要的揮發(fā)性化合物，YE Y T等[25]采用氣相色譜-嗅覺法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和氣味活性值（odour active value，OAV）結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析，評(píng)價(jià)了15個(gè)不同發(fā)酵階段制備的黃酒樣品，證實(shí)醇類和酯類物質(zhì)是黃酒中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2.3 不同年份黃酒GC-IMS指紋圖譜分析

為了進(jìn)一步比較不同年份黃酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分之間的差異，通過(guò)GC-IMS自帶的Gallery Plot軟件繪制指紋圖譜，不同年份黃酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜見圖2。圖中每一橫行表示一個(gè)樣本的圖譜，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，右側(cè)為樣本名稱，每一縱列表示為一種揮發(fā)性成分，下側(cè)為揮發(fā)性成分的名稱，其中點(diǎn)越紅表示化合物的相對(duì)含量越高[21]。由圖2可知，2-甲基1-丙醇、丁醇、乙醇、甲醇等醇類物質(zhì)和丁酸乙酯、己基丁酸酯、十六烷內(nèi)酯等酯類物質(zhì)隨黃酒年份增加逐漸增多。醋酸冰片酯、甲酸乙酯、2-乙?；拎?、環(huán)己酮、乙醛等物質(zhì)在酒樣A08中的含量略高于其余幾個(gè)年份黃酒，為其特征成分。乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異丁酯、3-甲基丁酸甲酯、4-甲基戊酮、乙酸、己醛、四氫呋喃等物質(zhì)在酒樣A10中的含量較高，為其特征成分。酒樣A12中特征成分比較多，3-甲基丁酸甲酯、3-甲基戊酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸異丙酯、2-糠酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸烯丙酯、反式-2-戊烯醇、2-甲基丙烷、正丁醛、庚醛、二丁酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、1,4-二惡烷、丙醇等物質(zhì)在酒樣A12中含量較高。丙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、二甲基戊酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、戊酸乙酯、γ-萜品烯、2-戊酮等物質(zhì)在酒樣A14中含量較高，為其特征成分。2-甲基丁醇在酒樣A18中含量較高，為其特征成分。巴豆酸乙酯、乙酸丁酯、2-辛酮、3-（甲基異丙醇）-1-丙醇、辛醛等物質(zhì)在酒樣A19中含量較高，為其特征成分。結(jié)果表明，指紋圖譜可根據(jù)以上特征成分判斷不同年份黃酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成的主要差異。

圖2 不同年份黃酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣相色譜-離子遷移譜指紋圖譜Fig.2 GC-IMS fingerprint map of flavor substances in different years of Huangjiu samples

2.4 不同年份黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析結(jié)果

主成分分析是識(shí)別算法中最基本的多元統(tǒng)計(jì)方法，同時(shí)能夠利用降維的思想，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)綜合指標(biāo)[22]。本研究以63種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰強(qiáng)度作為分析對(duì)象，對(duì)不同年份黃酒進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，主成分1與主成分2的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為69%，表明該數(shù)據(jù)可以很好地反映樣品的整體信息。其中，不同年份黃酒樣品平行樣間緊密聚集，表示樣品間重復(fù)性較高，6個(gè)樣本之間則有一定距離，樣品A18和A19之間距離較近，具有一定相似性；樣品A08和A10之間距離較近，同樣具有一定相似性；其余樣品距離較遠(yuǎn)，表明隨著年份的增加樣品揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生了很大變化。結(jié)果表明，陳釀時(shí)間對(duì)酒體香氣的影響顯著，陳釀時(shí)間間隔越久，酒體香氣變化越明顯。說(shuō)明PCA具有較好的分類效果，能直觀的鑒別不同年份黃酒間的差異。

圖3 不同年份黃酒樣本的主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis results of different years of Huangjiu samples

2.5 聚類分析結(jié)果

樣本間歐氏距離對(duì)應(yīng)于最鄰近分析圖，樣品間差距越大，歐氏距離數(shù)值越大[23]。以63種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰強(qiáng)度作為分析對(duì)象進(jìn)行最鄰近分析，結(jié)果見圖4。圖中樣品之間的距離最近，說(shuō)明兩者的相似度最高；反之距離較遠(yuǎn)，酒體風(fēng)格則迥然不同。

圖4 不同年份黃酒樣品聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis results of different years of Huangjiu samples

由圖4可知，樣品A08與A10最相近，與樣品A19差異最大；而樣品A12與樣品A18和A19差異最大；樣品A14與兩個(gè)樣品A18和A19更相似，與樣品A12差異最大；兩個(gè)樣品A18和A19彼此之間比較相近，均與樣品A12差異最大。結(jié)果表明，陳釀時(shí)間較長(zhǎng)的黃酒可明顯區(qū)別于陳釀時(shí)間較短的黃酒，說(shuō)明在陳釀過(guò)程中，酒體會(huì)發(fā)生明顯的變化，這一結(jié)論與主成分分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究利用GC-IMS探究6個(gè)不同年份黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和變化規(guī)律，共檢出63種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類11種，酯類27種，酮類8種，醛類6種以及其他類11種。GC-IMS結(jié)果表明，不同年份黃酒痕量組分和整體風(fēng)味輪廓具有差異，其中，酒樣A08特征成分為甲酸乙酯、己基丁酸酯、丁酸乙酯等，酒樣A10特征成分為乙酸乙酯、乳酸乙酯等，酒樣A12特征成分為3-甲基丁酸甲酯、3-甲基戊酸乙酯、丙酸乙酯等，酒樣A14特征成分丙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯等，酒樣A18特征成分為2-甲基丁醇，酒樣A19特征成分為巴豆酸乙酯、乙酸丁酯等。主成分分析和聚類分析結(jié)果表明，酒樣A18和A19之間具有相似性，酒樣A08和A10之間具有相似性，而其余酒樣均不具有相似性，表明在陳釀過(guò)程中，酒體會(huì)發(fā)生明顯的變化。由于對(duì)酯類和醇類物質(zhì)探測(cè)的高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，GC-IMS可作為一種快速鑒定年份黃酒的檢測(cè)手段，本研究結(jié)果可為黃酒的年份鑒別和質(zhì)量控制提供經(jīng)驗(yàn)借鑒和應(yīng)用思路。