響應(yīng)面法優(yōu)化風柜斗草發(fā)酵工藝及抗氧化活性分析

王瓊珺，林澤燕*，林燕燕，楊彩媚，劉舜慧，王淑貞

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院 藥學院，福建 漳州 363000；2.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院 海洋天然產(chǎn)物與活性研究實驗室，福建 漳州 363000）

中藥發(fā)酵是中藥常用炮制方法之一[1-3]，近年來隨著大健康理念的提出，酵素作為功能食品越來越為人們接受，市面上的酵素主要為果蔬發(fā)酵液[4]；隨著植物酵素的普及，“藥食同源”植物酵素也逐漸受到人們的關(guān)注，通過接種發(fā)酵，可以促進藥用植物的細胞壁溶解、有效成分釋放，從而提高藥效、減少毒副作用等，并獲得各種功能產(chǎn)品，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量[5]。

風柜斗草（Sarcopyramis nepalensisWall）學名楮頭紅，性涼，味酸，無毒，具清肺熱、去肝火之功，治風濕痹痛、耳鳴、耳聾及目霧羞明[6]，分布于全國多地，福建閩南地區(qū)常用于治療急性肝炎、蛇頭疔、肺熱咳嗽、無名腫毒等[7]。研究表明，風柜斗草全草含有多種成分[8-10]，具有一定的生物活性和藥理作用[11-13]，王燕燕等[14-16]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物是風柜斗草的重要成分。植物黃酮是一類特殊的多酚化合物，在亞洲特別是我國古代，醫(yī)生常應(yīng)用富含黃酮的藥用植物或香料來預(yù)防和治療某些疾病；現(xiàn)代藥理學研究也發(fā)現(xiàn)植物黃酮具有較好的藥理活性，其中包括抑菌[17]、抗炎[18-19]、抗癌[20-21]等。

民間應(yīng)用風柜斗草一般采用傳統(tǒng)的煎煮方法，實驗室有效成分獲得也依賴傳統(tǒng)的提取方法[8-11，22]。鄭曉艷等[9]通過分析風柜斗草的水提取液、乙醇提取液以及石油醚提取液，發(fā)現(xiàn)風柜斗草醇提物含有多種天然活性物質(zhì)；謝勇平等[22]將楮頭紅醇提取物用正丁醇萃取，首次從楮頭紅中提取得到呋甾烷型甾體皂苷，命名為楮頭紅皂苷A；林藝華[23]對風柜斗草中黃酮類成分進行定量分析，發(fā)現(xiàn)風柜斗草黃酮提取物具有較強的抗氧化活性。目前，國內(nèi)外風柜斗草發(fā)酵工藝及其活性的研究鮮見報道，楊彩媚等[24]應(yīng)用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵風柜斗草干草粉末得到其發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵液總黃酮含量高于水提取液，且清除自由基的能力較強，但尚未考察接菌量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等因素，發(fā)酵工藝存在不確定性，為更好的利用風柜斗草，有必要進一步明確風柜斗草發(fā)酵工藝及研究發(fā)酵液的生物活性。

本研究以總黃酮含量為評價指標，采用單因素試驗和響應(yīng)面法考察植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對風柜斗草發(fā)酵的影響，確定風柜斗草最佳發(fā)酵工藝條件，并對發(fā)酵液的有效成分含量及生物活性進行分析，以期為合理利用風柜斗草資源及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

風柜斗草（Sarcopyramis nepalensisWall）：福建漳州市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：北京川秀國際貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試劑

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉（均為分析純）：汕頭市西隴化工股份有限公司；濃硫酸、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸、福林酚試劑、L-酪氨酸、L-酪氨酸酶：北京索萊寶科技有限公司；十二水合磷酸二氫鈉、二水合磷酸氫二鈉（分析純）：美國Sigma公司；蘆丁標準品（純度≥95%）：中國食品藥品檢定研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）：東京化成工業(yè)株式會社；維生素C（vitamin C，VC）：上海福昕生物科技有限公司；0.22 μm濾膜：無錫耐思生命科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FA2003電子天平：上海精密科學儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；L535R臺式大容量離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；ZHLY-180振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-2D型單人單面超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；Multiskan SkyHigh 型全波長酶標儀、3949型恒溫培養(yǎng)箱：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 風柜斗草發(fā)酵液的制備

用水快速沖洗風柜斗草表面泥沙、雜質(zhì)，烘干至質(zhì)量恒定，取出打磨成粉，過80目篩。取風柜斗草粉末2 g，加入植物乳桿菌，在超凈工作臺中接入100 mL無菌水中，在一定溫度下，80 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)、離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，濾液備用，全程為無菌操作[24]。

1.3.2 風柜斗草發(fā)酵液發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以植物乳桿菌接種量0.5%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間15 h為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件；分別單獨考察發(fā)酵溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、植物乳桿菌接種量（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、發(fā)酵時間（6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h）對風柜斗草發(fā)酵液中總黃酮含量的影響。每組設(shè)置3個平行試驗。

1.3.3 風柜斗草發(fā)酵液發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面法試驗設(shè)計

為確定風柜斗草發(fā)酵液最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇菌種接種量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）為影響因素，以總黃酮含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，考察各因素間交互作用對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量的影響，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 風柜斗草發(fā)酵液有效成分測定（1）總黃酮含量的測定

發(fā)酵液總黃酮含量的測定采用紫外分光光度法。蘆丁標準曲線的制作參照《中華人民共和國藥典（一部）》（2020版）[25]，以蘆丁標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，得到標準曲線回歸方程y=3.01x-0.023 4，R2=0.999 6。根據(jù)標準曲線計算總黃酮含量。

（2）總酚含量的檢測

發(fā)酵液總酚含量測定參考關(guān)奎奎等[26]的方法，以沒食子酸標準品為對照品，在波長750 nm處測定吸光度值。以沒食子酸標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線。得到標準曲線回歸方程y=24.5x+0.000 4，R2=0.999 8。根據(jù)標準曲線計算發(fā)酵液總酚含量。

（3）粗多糖含量檢測

參照參考文獻[25]測定多糖含量，以葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到標準曲線回歸方程y=28.48x-0.256 2，R2=0.999 6。根據(jù)標準曲線計算發(fā)酵液粗多糖含量。

1.3.5 風柜斗草發(fā)酵液體外抗氧化活性測定[27-28]

（1）總抗氧化能力測定

根據(jù)試劑盒操作要求進行測定，以總抗氧化能力μmol/mL表示。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

按試劑盒要求要求設(shè)置空白孔、測定孔及對照孔，測定其吸光度值，以下式計算超氧陰離子清除率。

式中：530 nm波長處測定樣品溶液吸光度值為A樣品，試劑盒中對照品溶液的吸光度值為A對照。

（3）羥自由基（OH-·）清除率的測定

按試劑盒要求設(shè)置空白孔、測定孔及對照孔，各吸取50 μL進行顯色反應(yīng)，按下式計算風柜斗草發(fā)酵液羥自由基清除率。

式中：A樣品為波長536 nm處測定樣品溶液吸光度值，以試劑盒中對照品溶液吸光度值記為A對照，加蒸餾水不加試劑盒中試劑的孔為空白，吸光度值記為A空白。

（4）DPPH自由基清除率的測定

樣品溶液與DPPH試劑等體積混合，避光反應(yīng)30 min，測定波長517 nm處吸光度值，對照溶劑用無水乙醇代替，按下式計算DPPH自由基清除率。0.01 mg/mL和0.05 mg/mL VC溶液為陽性對照。

式中：517 nm波長處測定樣品溶液與DPPH液的吸光度值記為A樣品，樣品溶液與無水乙醇混合液吸光度值記為A對照，DPPH液與無水乙醇混合液的吸光度值，記為A空白。

1.3.6 酪氨酸酶抑制活性的測定

參考李娜等[29]的方法測定。配制pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）；取酪氨酸酶用PBS定容至濃度為1 kU/mL；取L-酪氨酸，加PBS溶解并定容至質(zhì)量濃度為0.5mg/mL；風柜斗草發(fā)酵液為樣品溶液；熊果苷（10mmol/L）為陽性對照。先將各試劑置于25℃恒溫孵育箱中孵育10min，取出加樣，再于37 ℃恒溫箱反應(yīng)20 min，取出轉(zhuǎn)入提前預(yù)熱的酶標儀中，波長475 nm處測定吸光度值。

總反應(yīng)體系設(shè)定100 μL，以L-酪氨酸10 μL為底物，做5組試驗，風柜斗草發(fā)酵液分別添加20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL，加PBS溶液至足量后測吸光度值。以不同添加量的熊果苷為對照，比較不同添加比例風柜斗草發(fā)酵液對酪氨酸酶的抑制情況，每組重復(fù)3次。

式中：Aa為酪氨酸+PBS緩沖液的吸光度值；Ab為酪氨酸+PBS緩沖液+酪氨酸酶的吸光度值；Ac為酪氨酸+PBS緩沖液+樣品的吸光度值；Ad為酪氨酸+PBS緩沖液+樣品+酪氨酸酶的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0進行均值比較，采用Origin8.0進行圖表繪制，用Design-Expert8.06設(shè)計響應(yīng)面及數(shù)據(jù)分析、方程擬合和圖表繪制，每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 風柜斗草發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同發(fā)酵溫度對總黃酮含量的影響

不同發(fā)酵溫度對總黃酮含量的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，當發(fā)酵溫度從20 ℃升高到25 ℃時，總黃酮含量隨之升高；當發(fā)酵溫度為25 ℃時，總黃酮的含量最高，為（7.54±0.87）mg/mL；而當發(fā)酵溫度高于25 ℃后，總黃酮含量出現(xiàn)降低趨勢，可能是由于黃酮結(jié)構(gòu)中含大量的羥基，溫度升高極易被氧化；發(fā)酵溫度為35～40 ℃時，提取液中總黃酮已經(jīng)達到飽和。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為25 ℃。

圖1 不同發(fā)酵溫度對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of different fermentation temperature on total flavonoids contents in fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

2.1.2 不同接種量對總黃酮含量的影響

不同接種量對總黃酮含量的影響見圖2。由圖2可知，植物乳桿菌接種量從0.1%增大到0.5%時，總黃酮的含量呈上升趨勢，在接種量0.5%時，總黃酮含量達最高為（5.87±0.40）mg/mL，接種量超過0.5%后，總黃酮含量呈下降趨勢。因此，選擇最佳接種量為0.5%。

圖2 不同接種量對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of different inoculum on total flavonoids contents in fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

2.1.3 不同發(fā)酵時間對總黃酮含量的影響

不同發(fā)酵時間對總黃酮含量的影響見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增長，風柜斗草發(fā)酵液總黃酮的含量先增高再降低，當發(fā)酵時間＜15 h時，發(fā)酵液中的總黃酮含量較低，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中黃酮的含量隨著時間的增長而升高；發(fā)酵時間為15 h時，總黃酮含量最高，為（7.87±0.85）mg/mL，發(fā)酵時間＞15 h后總黃酮含量逐漸下降。這是由于發(fā)酵時間＞15 h后，發(fā)酵液中的黃酮濃度基本已經(jīng)達到飽和，且風柜斗草中的其他物質(zhì)溶入提取液中，導(dǎo)致黃酮含量降低。因此，選擇最佳發(fā)酵時間是15 h。

圖3 不同發(fā)酵時間對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on total flavonoids content in fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

2.2 發(fā)酵工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計方案與結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將接種量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）3個因素作為自變量，以總黃酮含量為響應(yīng)值（Y）進行響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment for fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 建立回歸模型和方差分析

利用響應(yīng)面軟件Design-Expert8.06對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值總黃酮含量（Y）的回歸模型方程式為：

由表3可知，建立的模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型擬合度良好。模型的適配度高達99.72%，說明試驗誤差小，可以利用該模型預(yù)測發(fā)酵工藝對風柜斗草總黃酮含量的影響。由F值可知，各因素對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量的影響程度由強到弱依次為發(fā)酵溫度將發(fā)酵溫度（C）＞發(fā)酵時間（B）＞接種量（A），且結(jié)合表中P值可知，回歸模型中一次項B、C，交互項AB，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；交互項AC、BC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他因素對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 響應(yīng)面因素交互作用分析

接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度交互作用對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線見圖4。由圖4可知，響應(yīng)曲面開口均朝下，各交互作用的試驗點范圍內(nèi)都出現(xiàn)了最高點，說明三個工藝參數(shù)所選水平范圍合理，其中交互項AB的交互作用的響應(yīng)曲面陡峭，等高線呈橢圓形，說明接種量（A）和發(fā)酵時間（B）的交互效應(yīng)對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量影響極顯著；另外接種量（A）和發(fā)酵溫度（C）交互作用以及發(fā)酵時間（B）和發(fā)酵溫度（C）交互作用的響應(yīng)曲面較陡峭，說明對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量有顯著影響，這與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素間交互作用對風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on total flavonoids content in fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

2.3 最佳工藝條件試驗驗證

利用Design-Expert8.06軟件，通過優(yōu)化得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：接種量0.51%，發(fā)酵時間14.26 h，發(fā)酵溫度27.85 ℃，通過回歸方程可得風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量7.28 mg/mL。結(jié)合實際操作可行性，將最佳發(fā)酵工藝修正為：接種量0.5%，發(fā)酵時間14 h，發(fā)酵溫度28 ℃。按此發(fā)酵工藝條件進行3次平行驗證試驗，測得風柜斗草發(fā)酵液總黃酮含量實際值為（7.24±0.03）mg/mL，與預(yù)測值7.28 mg/mL差異不顯著（P＞0.05），與模型預(yù)測基本一致，表明該模型有效可行，可以預(yù)測風柜斗草的發(fā)酵工藝。將上述風柜斗草發(fā)酵液進行總酚含量和多糖含量檢測，得該發(fā)酵液中總酚含量為（3.54±0.11）mg/mL，多糖含量為（4.77±0.78）mg/mL。

2.4 風柜斗草發(fā)酵液抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 總抗氧化能力、超氧陰離子及羥自由基清除能力的測定風柜斗草發(fā)酵液抗氧化活性測定結(jié)果見表4。由表4可知，風柜斗草發(fā)酵液原液總抗氧化能力為（71.32±0.64）μmol/mL，預(yù)測值為極顯著優(yōu)于0.25 mg/mL VC溶液（P＜0.01）；稀釋3倍后，與0.25 mg/mL VC溶液無顯著差異（P＞0.05）。超氧陰離子自由基清除率和羥自由基清除能力檢測試驗中發(fā)現(xiàn)風柜斗草發(fā)酵液原液濃度較高，超出檢測范圍，故稀釋后進行檢測，反應(yīng)穩(wěn)定時結(jié)果表明，稀釋3倍后超氧陰離子清除率為（44.93±1.92）%，與0.25 mg/mL VC溶液的超氧陰離子清除率無顯著差異（P＞0.05）；稀釋4倍后，羥自由基清除能力為（94.46±2.35）%，顯著優(yōu)于0.25 mg/mL VC溶液（P＜0.05）。

表4 風柜斗草發(fā)酵液抗氧化性測定結(jié)果Table 4 Determination results of antioxidant activity of fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

2.4.2 DPPH自由基清除能力的測定

試驗中發(fā)現(xiàn)風柜斗草發(fā)酵液原液濃度較高，對發(fā)酵液分別進行10倍和30倍稀釋，測定其對DPPH自由基的清除率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，風柜斗草10倍稀釋的發(fā)酵液DPPH自由基清除率為（89.71±0.33）%，與0.05 mg/mL VC溶液DPPH自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），稀釋30倍之后才與0.05 mg/mL VC的清除率間差異顯著（P＜0.05），說明風柜斗草發(fā)酵液具有較好的清除DPPH自由基的能力。

圖5 風柜斗草發(fā)酵液DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging activity of fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

2.5 抑制酪氨酸酶作用結(jié)果

不同風柜斗草發(fā)酵液及熊果苷對照液對酪氨酸酶活性的抑制率影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，不同添加量風柜斗草發(fā)酵液對酪氨酸酶活性的抑制率隨濃度升高而增加。當添加量＞40%時，風柜斗草發(fā)酵液對酪氨酸酶的抑制率開始超過熊果苷，說明添加量＞40%時，風柜斗草發(fā)酵液對酪氨酸酶的抑制作用優(yōu)于熊果苷溶液。酪氨酸酶能夠催化L-酪氨酸，進而經(jīng)過一系列反應(yīng)生成黑色素，其活性與黑色素合成有密切關(guān)系[29]。目前市場上常用熊果苷作為酪氨酸酶抑制劑應(yīng)用于美白化妝品，試驗結(jié)果提示風柜斗草發(fā)酵液具有良好的酪氨酸酶活性抑制作用，可考慮作為酪氨酸酶抑制劑應(yīng)用于化妝品中。

圖6 風柜斗草發(fā)酵液的抑制酪氨酸酶活性Fig.6 Inhibition of tyrosinase activity of fermentation liquid of Sarcopyramis nepalensis

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，確定風柜斗草發(fā)酵液的最佳發(fā)酵工藝條件為：接種量0.5%，發(fā)酵時間14 h，發(fā)酵溫度28 ℃。在此優(yōu)化條件下，風柜斗草發(fā)酵液的總黃酮含量為7.28 mg/mL，總酚含量為3.54 mg/mL，多糖含量為4.78 mg/mL。抗氧化試驗結(jié)果表明，風柜斗草發(fā)酵液總抗氧化能力（71.32±0.64）μmol/mL，且對超氧陰離子、羥自由基、DPPH自由基清除率能力強；酪氨酸酶活性抑制率高。表明風柜斗草經(jīng)過該發(fā)酵工藝發(fā)酵后具有很好的生物活性，該研究結(jié)果為風柜斗草發(fā)酵液進一步開發(fā)應(yīng)用于食品藥品、化妝品提供理論依據(jù)。