桑葚酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及其品質分析

方裕理，張 雨，李彥中，袁天萌，黃丹丹，邊名鴻*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.四川江口醇隆鼎酒業(yè)有限公司，四川 巴中 636000；3.川北醫(yī)學院，四川 南充 637000；4.南充生物醫(yī)藥產業(yè)技術研究院，四川 南充 637000）

桑葚（Morus albaL.），也被稱為桑葚果、桑實和桑棗，是?？粕俣嗄晟颈局参锷涞墓麑崳饕a于四川和湖南兩省，是一種藥食兩用的水果[1-3]。研究表明，桑葚不僅含有豐富的碳水化合物、17種氨基酸、7種維生素和礦物質，還能調節(jié)人體的免疫功能，促進造血細胞的生長，具有抗突變、抗衰老、降低血糖水平和降低血脂等保健作用[4-7]。桑葚鮮果在自然環(huán)境下極易腐敗，采摘期和貯存周期都非常短，因此桑葚的深加工顯得極其重要，釀造桑葚酒不僅極大地保留桑葚本身的營養(yǎng)成分，增加桑葚附加值，還可以推動三產融合，促進桑農收入。

果酒釀造過程中，酵母菌直接影響果酒風味和酒精度。普通釀酒酵母發(fā)酵的桑葚酒常出現口感粗糙、香味寡淡等問題。隨著研究深入，非釀酒酵母在果酒釀造中的作用逐漸受到重視，如能夠合成乙酸丁酯、乙酸異戊酯等揮發(fā)性物質，而且酶系豐富，能產生大量果膠酶和葡萄糖苷酶等，在塑造酒體香氣和提高酒體復雜性方面具有積極作用[8-10]?？勰腋材そ湍福⊿accharomycopsis fibuligera）是一株從中高溫大曲中分離出來的酵母，由于其產香能力較強，出酒率較高，正被運用于多種酒的釀造[11]。王乃軍等[12]研究發(fā)現，扣囊覆膜酵母酶系豐富，產酯、產酸、產醇等風味物質能力較強，能增強白酒細膩感，提升白酒品質。YANG Y等[13]研究發(fā)現，將扣囊覆膜酵母和其他非釀酒酵母用于發(fā)酵甜米酒，會增加甜米酒中的己酸乙酯、丁酸乙酯等酯類和一些醇類、酮類物質，產生令人愉悅的香氣。目前，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚的研究還鮮見報道。

本研究以桑葚為原料，扣囊覆膜酵母為發(fā)酵菌株制備桑葚酒，通過單因素試驗及響應面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，對其理化、微生物指標及揮發(fā)性風味物質進行分析，以期為扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒提供理論參考，同時拓寬桑葚的加工形式，降低豐產后的滯銷問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

桑葚（無核大十）：宜賓市長寧縣；扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）：四川輕化工大學生物工程學院實驗室；安琪釀酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：重慶川東化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PHSJ-3F型pH計：上海精密科學儀器有限公司；WZ101型手持糖度計：海南博漢森科技開發(fā)有限公司；890N-5975B型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀：美國Agilent科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑葚酒加工工藝流程及操作要點

桑葚→打漿→調整成分→接種活化酵母→發(fā)酵→滅菌→倒罐→陳釀→過濾、澄清→桑葚酒

操作要點：

預處理：清洗鮮桑葚表面的灰塵、泥土，瀝干后于打漿機中低速打漿。

調整成分：偏重亞硫酸鉀的使用量為60 mg/L，將糖度調整為18°Bx，用檸檬酸調節(jié)pH至3.5～4.5。

扣囊覆膜酵母的活化：將扣囊覆膜酵母劃線接種到YPD固體培養(yǎng)基，在26 ℃條件下培養(yǎng)20 h。挑取單菌落接種到YPD液體培養(yǎng)基中，在26 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h。將所得菌液于4 ℃、3 000 r/min的條件下離心10 min，棄掉上清液，將菌體重懸后再次離心取沉淀。

接種與發(fā)酵：發(fā)酵罐的裝液量為175 mL/250 mL，扣囊覆膜酵母接種量為2%，在28 ℃的條件下發(fā)酵12 d左右，測其酒精度不再變化時，終止發(fā)酵。

滅菌：將發(fā)酵結束的發(fā)酵液取出，采用7層紗布進行粗濾，然后放入65～85 ℃恒溫水浴鍋滅菌30 min。

倒罐與陳釀：陳釀期間每隔24 h倒罐一次，10 ℃條件下避光陳釀30 d。

過濾、澄清：選用自然澄清法，將果酒放在一個密封的容器中，放置10 d，待果酒中的懸浮物慢慢沉淀后，將上清液轉移到一個新的容器中，得到清澈透明的桑葚酒成品。

1.3.3 桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

本次試驗采用單因素輪換法，依次考察酵母接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、桑葚與水料液比（100∶0、85∶15、70∶30、55∶45、40∶60（g∶mL））和發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）對桑葚酒酒精度及感官品質的影響。

1.3.4 桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

以單因素試驗的結果為依據，以桑葚酒酒精度（Y）為響應值，選擇影響顯著的因素發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）和料液比（C）為自變量進行響應面試驗，對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，響應面試驗設計因素與水平見表1。

1.3.5 分析檢測

還原糖、總酸、總酯含量的測定：參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；酒精度的測定：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》；可溶性固形物含量的測定：參照GB/T 12143—008《飲料通用分析方法》；pH的測定：參照HJ 1147—2020《水質pH值的測定電極法》；花青素含量的測定：參照DB12T885—2019《植物提取物中原花青素的測定紫外-可見分光光度法》。微生物菌落總數、大腸桿菌、致病菌的測定：參照NYT 1508—2017《綠色食品果酒》。

1.3.6 揮發(fā)性風味物質的測定

揮發(fā)性風味物質的測定參照許強等[14]方法并加以修改，具體如下。

預處理：萃取頭在氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀進樣口活化25 min，用精密注射器從樣品瓶中部抽取2.5 mL桑葚酒注入加有磁力攪拌子的密封頂空瓶中，再加入3 g NaCl，采用恒溫磁力攪拌器調節(jié)水浴控制酒樣溫度，將活化好的萃取頭插入頂空瓶進行頂空萃取5 min，達到萃取時間后抽出萃取頭，插入氣相色譜儀進樣口進行解吸。

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣（He），流速1.00mL/min；進樣方式為無分流手動進樣；進樣口溫度250 ℃；初始溫度40 ℃保持3 min，再以5 ℃/min程序升溫至230 ℃，保持10 min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，El）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描范圍20～550 amu。

定性定量方法：根據全掃圖中母離子信息，利用美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）MS Search2.3數據庫做物質鑒定，對檢測出得各組分定性分析，并用峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性風味成分相對含量。

1.3.7 感官評價

由10位經過感官培訓的人員組成評審小組，從色澤、香氣、滋味及典型性方面對桑葚酒進行感官評價[14]，滿分為100分，桑葚酒感官評價標準見表2。

表2 桑葚酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry wine

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 酵母接種量的確定

由圖1可知，酵母接種量為1%～2%時，桑葚酒感官評分和酒精度均逐漸增加；酵母接種量為2%時，桑葚酒感官評分和酒精度均為最高，分別為83分和7.9%vol；當酵母接種量＞2%時，桑葚酒感官評分和酒精度均逐漸下降。其原因可能是，酵母接種量較低時，發(fā)酵速度緩慢，前發(fā)酵時間長，導致酒精度較低，影響風味口感；接種量較高時，酵母過多導致發(fā)酵速度過快、中心溫度過高，產酒率隨之下降，同時酵母菌的細胞壁吸附作用會導致花色素含量降低，酒體色澤不穩(wěn)定，并且發(fā)酵結束后，酒體酵母味大，影響口感風味和營養(yǎng)物質[15]。綜合考慮，確定酵母接種量為2%。

圖1 酵母接種量對桑葚酒酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of mulberry wine

2.1.2 料液比的確定

由圖2可知，料液比為40∶60、55∶45、70∶30（g∶mL）時，桑葚酒酒精度和感官評分均逐漸增加；料液比為70∶30（g∶mL）時，桑葚酒酒精度和感官評分均為最高，分別為8.3%vol和86分；料液比為70∶30、85∶15、100∶0（g∶mL）時，桑葚酒酒精度和感官評分均逐漸下降。料液比的大小會影響酒體香氣和口味的協(xié)調性，當料液比過低時，桑葚原汁較少導致酒體果香較弱，桑葚酒典型性差；當料液比過高時，桑葚原汁較多，酒體相對粘稠，酸感較突出，感官評分較低。綜合考慮，確定最佳料液比為70∶30（g∶mL）。

圖2 料液比對桑葚酒酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effects of material to liquid ratio on alcohol content and sensory score of mulberry wine

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在22～24 ℃范圍內的增加，感官評分逐漸增加；當發(fā)酵溫度為24 ℃時，感官評分達到最大值，為87分；發(fā)酵溫度＞24 ℃時，感官評分逐漸下降。隨著發(fā)酵溫度在22～26 ℃范圍內的增加，酒精度逐漸增加；當發(fā)酵溫度為26 ℃時，酒精度達到最大值，為8.57%vol；發(fā)酵溫度＞26 ℃時，酒精度逐漸下降。發(fā)酵溫度過低時，不僅易染雜菌，而且酵母活性較低，生長繁殖速度緩慢，導致發(fā)酵不充分，因此桑葚酒酒精度偏低和風味口感較差；當溫度較高時，抑制微生物代謝能力的同時，也會使果酒中的花色苷降解，導致酒體酒精度不高、色澤不穩(wěn)定、口感和成分被破壞[16-18]。綜合考慮，確定最佳發(fā)酵溫度為26 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對桑葚酒酒精度和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of mulberry wine

2.2 桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗方案及結果

在單因素試驗結果的基礎上，以發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、料液比（C）為自變量，以酒精度（Y）為響應值進行3因素3水平的響應面試驗設計，響應面試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

采用Design Expert 13.0軟件對表3中的數據進行回歸擬合分析，得到3個因素與酒精度（Y）之間的回歸方程：

由表4可知，用響應面法建立的二次回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），即所構建的模型與試驗的差異較小，說明其他因素對模型的干擾程度低[19-20]，決定系數R2為0.955 6，調整決定系數R2adj為0.898 5，說明89.85%的試驗數據的變異型可用此回歸模型解釋，由表4亦可知，一次項C及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個因素對桑葚酒酒精度影響順序：料液比（C）＞酵母接種量（B）＞發(fā)酵溫度（A）。

2.2.2 各因素間交互作用對酒精度的影響

響應曲面越平緩說明該試驗中的某一因素對酒精度的影響越小，等高線近似于一個圓球面，那么就表示這兩個因素的交互作用越弱[21-22]。采用Design Expert 13.0軟件繪制各因素間交互作用對桑葚酒酒精度影響的響應曲面及等高線見圖4。由圖4可知，在該模型中，AC的等高線呈現明顯的橢圓形，說明AC交互作用顯著（P＜0.05），而AB、和BC響應曲面較為平坦，并且等高線未呈現明顯的橢圓形，說明其有一定的交互作用，但交互作用不顯著（P＞0.05），這與方差分析結果一致。

圖4 各因素間交互作用對桑葚酒酒精度影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the alcohol content of mulberry wine

采用Design Expert 13.0軟件對多元回歸方程預測，得到最優(yōu)桑葚酒發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度為26.1 ℃、酵母接種量為1.9%、料液比為75∶25（g∶mL），在此條件下，桑葚酒酒精度的理論值為8.62%vol，為方便實際操作，將發(fā)酵工藝條件修正為發(fā)酵溫度26 ℃、酵母接種量2%、料液比為75∶25（g∶mL）。為了檢驗響應面法優(yōu)化工藝的可行性，在最佳發(fā)酵條件下進行了3次試驗，測得平均酒精度實際值為8.72%vol，感官評分為90分。與理論值相差不大，證明了響應面法得到的模型參數的準確性和可靠性，可真實反映不同因素對桑葚酒發(fā)酵的影響。

2.3 桑葚酒的理化及微生物指標檢測結果

桑葚酒的理化及微生物指標檢測結果見表5。由表5可知，扣囊覆膜酵母發(fā)酵的桑葚酒各項理化及微生物指標均符合行業(yè)標準NYT 1508—2017《綠色食品果酒》的要求。

表5 桑葚酒的理化及微生物指標的檢測結果Table 5 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of mulberry wine

花青素是桑葚中重要的營養(yǎng)成分，屬于黃酮類化合物，基本結構是2-苯基苯并呋喃，具有預防心腦血管疾病，保護肝臟和抗癌等多種生理功能[23-25]?？勰腋材そ湍干］鼐圃谧罴寻l(fā)酵工藝條件下測得花青素含量高達3.1 mg/mL，分析原因可能是因為酵母種類不同所導致的，非釀酒酵母中膠酶、葡萄糖苷酶等分泌較多，從而發(fā)酵出來的桑葚酒花青素含量增加[26]。除花青素外，還原糖、總酯和多糖也高于商品酵母發(fā)酵的桑葚酒。

綜上所述，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒的感官評分和酒體品質均高于安琪酵母發(fā)酵桑葚酒。

2.4 桑葚酒揮發(fā)性風味成分分析

將最優(yōu)工藝條件下扣囊覆膜酵母發(fā)酵的桑葚酒與安琪酵母發(fā)酵的桑葚酒進行揮發(fā)性成分對比，結果見表6。

表6 桑葚酒主要揮發(fā)性成分測定結果Table 6 Determination results of main volatile components in mulberry wine

由表6可知，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒中共檢測出24種揮發(fā)性風味物質，其中酯類12種，醇類4種，酸類4種，醛類4種，而安琪酵母發(fā)酵桑葚酒僅檢測出14種揮發(fā)性風味物質，其中，酯類8種，醇類4種，酸類1種，酮類1種。在兩種酵母發(fā)酵的桑葚酒中，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒的酯類物質種類較多，扣囊覆膜酵母發(fā)酵對乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯等酯類物質含量的提升較為明顯，增加了桑葚酒中的草莓香、含羞草香等，使得桑葚酒更加厚重[27]。兩種酵母發(fā)酵的桑葚酒對醇類物質種類數量影響不大，均為4種，但扣囊覆膜酵母發(fā)酵增加了桑葚酒中苯乙醇（15.67%）和2,3-丁二醇（2.30%）的含量，同時大幅降低桑葚酒中異戊醇（3.83%）的相對含量，使得桑葚酒的口感更加細膩凈爽?？勰腋材そ湍赴l(fā)酵桑葚酒還降低了乙酸（1.63%）的含量，減少了桑葚酒中的酸味，使桑葚酒后味變得醇和回甜?？勰腋材そ湍赴l(fā)酵桑葚酒還檢測出釀酒酵母發(fā)酵桑葚酒中不具有的4種醛類物質，分別為苯甲醛（0.93%）、乙醛（0.20%）、壬醛（0.74%）和癸醛（0.82%），賦予了桑葚酒獨特的杏仁香和橘皮香[28]。結合感官品質與理化指標分析，扣囊覆膜酵母發(fā)酵的桑葚酒香味與口感顯著增強，能有效提升桑葚酒的品質。

3 結論

經過單因素和響應面優(yōu)化試驗得到適合于扣囊覆膜酵母的發(fā)酵條件：酵母接種量2%，料液比75∶25（g∶mL），發(fā)酵溫度26 ℃。在此優(yōu)化條件下，桑葚酒感官評分為90.0分，酒精度為8.72%vol，總酯含量為5.7 g/L、總酸含量為4.8 g/L、總多酚含量為2.5 mg/mL，理化指標及微生物指標均符合相關國標要求。桑葚酒共檢出24種揮發(fā)性風味物質，其中，酯類12種，醇類4種，酸類4種，醛類4種，并且所得桑葚酒含有乙酸丁酯、乙酸異戊酯和乙酸苯甲酯等多種風味物質，香氣協(xié)調，口感醇厚，具有桑葚酒典型風格。扣囊覆膜酵母用于桑葚酒發(fā)酵能有效改善果酒品質，為非釀酒酵母發(fā)酵果酒提供了一定的數據支撐，為高品質桑葚酒的開發(fā)提供參考。