菌酶協(xié)同轉(zhuǎn)化白酒丟糟制備微晶纖維素及Nisin工藝條件優(yōu)化

張小利，黃銀峰，張鵬翔，張華應(yīng)，李雅麗，鞏東輝，白果云

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點(diǎn)試驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3.包頭海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010；4.包頭市遼禾淵酒廠，內(nèi)蒙古 包頭 014060）

我國(guó)白酒生產(chǎn)企業(yè)每年產(chǎn)生的酒糟約3 600萬(wàn)t以上[1]。國(guó)內(nèi)中小企業(yè)通常采取直接將白酒糟低價(jià)（約0.5元/kg）銷(xiāo)售給養(yǎng)殖戶(hù)；然而相比其他農(nóng)副產(chǎn)品，牲畜難以消化吸收鮮酒糟，而且酒糟含水量高，極易腐敗霉變，因此，酒糟并不受養(yǎng)殖戶(hù)歡迎[2]。除此之外，酒糟還被用來(lái)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、有機(jī)肥、可發(fā)酵碳源、制備微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）等[3-6]。雖然這些酒糟的處理方法有一定的成效，但相關(guān)產(chǎn)品附加值低，收益微薄，以致于出現(xiàn)中小白酒企業(yè)再度丟棄酒糟的現(xiàn)象。酒糟中富含粗纖維、粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪等有機(jī)質(zhì)[7]，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的可再生資源，研究一條體系化、高值化、環(huán)保的丟糟高值化利用途徑迫在眉睫。

MCC具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，在食品、日用化工和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[8]。制備MCC方法主要有酸水解法、酶水解法、近臨界水法等[9-11]。其中，酸水解法對(duì)設(shè)備有很強(qiáng)的腐蝕性，廢液的排放容易造成環(huán)境污染，用強(qiáng)酸制備MCC已不符合新時(shí)代發(fā)展的要求。近臨界水法需要在高壓高熱環(huán)境中進(jìn)行，設(shè)備昂貴、能耗大、成本高，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。酶水解法制備MCC反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)較少[10]，而且多種酶耦合使用可以有效除去目標(biāo)物中的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等其他物質(zhì)而得到MCC[7，11]；制備過(guò)程中產(chǎn)生的廢水是可以被生物直接利用的生物質(zhì)。乳酸鏈球菌素（Nisin）是由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）產(chǎn)生的一個(gè)多肽抗菌物質(zhì)，是國(guó)際上允許商業(yè)化生產(chǎn)食品防腐劑，具有極高的商業(yè)價(jià)值[12]。目前，有菌酶協(xié)同發(fā)酵酒糟生產(chǎn)蛋白飼料的研究報(bào)道[13-14]，但未見(jiàn)菌酶協(xié)同將丟糟轉(zhuǎn)化為MCC和Nisin的研究。

本研究以包頭市遼禾淵酒廠“粹五燒”酒的丟糟為研究對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合酶耦合乳酸乳球菌協(xié)同制備微晶纖維素（MCC）的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)MCC的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。以乳酸乳球菌生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用MCC制備過(guò)程中廢水培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin，并采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。以期實(shí)現(xiàn)菌酶協(xié)同高值化利用丟糟，為實(shí)現(xiàn)原料丟糟高值化利用、控制污染問(wèn)題和增加效益的一體化技術(shù)體系提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

白酒丟糟（釀酒原料由稻米、小麥、高粱、玉米和豌豆構(gòu)成）：包頭市遼禾淵酒廠“粹五燒”牌；乳酸乳球菌（Lactococcuslactissubsp.lactis）F44、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

堿性蛋白酶（200 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；脂肪酶（酶活20 000 U/g）、酸性木聚糖酶（酶活200 000 U/g）、漆酶（酶活700 U/g）、α-中溫淀粉酶溶液（酶活4 154 U/mL）：山東蘇柯漢生物工程公司；纖維素酶（酶活3 U/mg）：美國(guó)Worthington公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin的培養(yǎng)基[12]：酵母浸粉15 g/L、蛋白胨15 g/L、蔗糖15 g/L、KH2PO420 g/L、NaCl 1.5 g/L和MgSO4·7H2O 0.15 g/L。121 ℃、0.11 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本日立公司；KDN-08消化爐：上海洪紀(jì)儀器有限公司；KDN型-102C定氮儀：上海纖檢有限公司；1833品氏黏度計(jì)：上海寶山啟航玻璃儀器廠；UV-7504可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；GmbH高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合酶制備白酒丟糟基MCC[7，11，15-17]

稱(chēng)取100 g白酒丟糟，105 ℃烘干、粉碎過(guò)20目篩，以料液比為1∶10（g∶mL）加水，煮沸半小時(shí)備用；按照2 U/g丟糟的α-中溫淀粉酶，保持pH 5.0和60 ℃條件下振搖（50 r/min、8 min）去除淀粉；按照30 000 U/g丟糟的比例加入堿性蛋白酶，保持在其pH 9.5和40 ℃條件下振搖（50 r/min、5 h）去除蛋白質(zhì)；按照700 U/g丟糟的比例加入脂肪酶，在40 ℃下振搖（50 r/min、6 h）去除脂肪；按照10 000 U/g丟糟的比例加入酸性木聚糖酶，在pH 9.5和40 ℃條件下振搖（50 r/min、1 h），降解半纖維素；再按照70 U/g丟糟的比例加入漆酶，在pH 4.5和40 ℃條件下振搖（50 r/min）保溫2 h，降解木質(zhì)素；之后，調(diào)節(jié)溶液pH值為9.5，加入次氯酸鈉使溶液中次氯酸鈉的終濃度為10%，室溫下作用3 h，直至纖維素漂成白色。最后，用醋酸使溶液pH值降至5.0，在50 ℃作用1 h消除次氯酸根，再用蒸餾水傾瀉洗滌法清洗3遍，烘干得丟糟基粗纖維。所得粗纖維加入1 000 mL蒸餾水，在pH 5.0、55 ℃條件下經(jīng)纖維素酶酶解30 min，酶解完成后于5 000 r/min離心30 min并用蒸餾水沖洗，于真空干燥箱中干燥（60 ℃、6 h）獲得MCC。收集粗纖維及MCC制備過(guò)程中產(chǎn)生的廢水，每處理100 g丟糟約產(chǎn)生和收集2 000 mL廢水。

1.3.2 白酒丟糟基MCC酶解工藝條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：按照上述制備粗纖維工藝流程，準(zhǔn)確稱(chēng)取所得丟糟基粗纖維，加入適量蒸餾水，調(diào)整pH在最佳，以所得丟糟基MCC的聚合度（degree of polymerization，DP）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察纖維素酶添加量（0、12 U/g、18 U/g、24 U/g、30 U/g和36 U/g）、酶解時(shí)間（0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30）（g∶mL）進(jìn)行酶水解丟糟基粗纖維制備MCC的最佳工藝條件。

正交試驗(yàn)：依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以所得丟糟基MCC的聚合度（degree of polymerization，DP）（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取纖維素酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）和料液比（C）3個(gè)因素按L9（33）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.3 白酒丟糟中各有機(jī)成分的測(cè)定

粗纖維的測(cè)定：參考GB/T 5009.10—2003《植物類(lèi)食品中粗纖維的測(cè)定》；淀粉的測(cè)定：參考GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測(cè)定》；蛋白質(zhì)的測(cè)定：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪的測(cè)定：參考GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》；木質(zhì)素的測(cè)定：參考GB/T 20805—2006《飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的測(cè)定》。

1.3.4 纖維素含量、持水力、白度和膨脹度的測(cè)定

白度：采用白度儀進(jìn)行檢測(cè)。

纖維素含量的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[18]。其計(jì)算公式如下：

式中：V1為硫酸亞鐵銨標(biāo)液的消耗量，mL；X為試樣中纖維素的含量，%；m為所取試樣質(zhì)量，mg；V2為滴定時(shí)消耗硫酸亞鐵銨標(biāo)液的體積，mL；V1為空白試驗(yàn)消耗硫酸亞鐵銨標(biāo)液的體積，mL。

持水力的測(cè)定：參考據(jù)文獻(xiàn)[15]。其計(jì)算公式如下：

式中：3為丟糟基MCC的質(zhì)量，g；V1為量筒中平整微晶纖維素體積，mL；V2：加入蒸餾水微晶纖維素在室溫下放置24 h后的體積，mL。

1.3.5 聚合度的測(cè)定

聚合度（DP）的測(cè)定按照GB/T 1548—1989《紙漿粘度的測(cè)定法》，配制銅乙二胺溶液，通過(guò)測(cè)定黏度換算聚合度[19]，用毛細(xì)血管黏度，取的測(cè)試時(shí)間平均值。根據(jù)時(shí)間換算得到η/η0，查黏度表得到[η]*c，再除以濃度c，得到[η]，DP計(jì)算公式如下：

DP0.905=0.75[η]

1.3.6 結(jié)構(gòu)特性分析

將所得樣品粉末噴金后在場(chǎng)掃描電子顯微鏡上進(jìn)行MCC的形貌和結(jié)構(gòu)特性觀測(cè)[20]。

1.3.7 乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin廢水培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin的種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)條件下，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，以稀釋3倍的MCC廢水替代蒸餾水且不添加NaCl，分別考察復(fù)合氮源添加量（酵母浸粉和蛋白胨比例為1∶1）（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L）、蔗糖添加量（0、2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L和15.0 g/L）、KH2PO4添加量（0、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L和35.0 g/L）和MgSO4·7H2O添加量（0、0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L和0.35 g/L）對(duì)菌株F44生物量和Nisin產(chǎn)量的影響。

1.3.8 乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin廢水培養(yǎng)基組分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定影響乳酸乳球菌生長(zhǎng)的主要因素氮源添加量（A）、蔗糖添加量（B）和KH2PO4添加量（C），以乳酸乳球菌生物量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for medium components optimization

1.3.9 乳酸乳球菌生物量及其N(xiāo)isin效價(jià)的檢測(cè)

生物量檢測(cè)：以稀釋涂布平板法計(jì)算乳酸乳球菌數(shù)量[12]。Nisin效價(jià)檢測(cè)：以藤黃八疊球菌為指示菌，使用管碟法通過(guò)對(duì)平板抑菌圈直徑的測(cè)量，以Nisin標(biāo)準(zhǔn)品液效價(jià)的對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)，抑菌圈的直徑（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.187 9X-0.827 7（相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8），通過(guò)測(cè)量待測(cè)樣品的抑菌圈直徑，代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，即可得到Nisin效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酒丟糟中有機(jī)質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

包頭市遼禾淵酒廠“粹五燒”牌白酒丟糟中各類(lèi)有機(jī)質(zhì)含量（以干基計(jì)）為纖維素23.5%、淀粉1.39%、蛋白質(zhì)13.07%、脂肪7.41%、木質(zhì)素14.30%。此丟糟中纖維素含量達(dá)23.50%。由此可知，此丟糟為制備MCC的良好來(lái)源。然而丟糟中含有較多的木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪，這些物質(zhì)是制備MCC過(guò)程中需要去除的雜質(zhì)。

2.2 白酒丟糟基MCC制備工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

纖維素酶的酶解時(shí)間、纖維素酶添加量及料液比對(duì)MCC聚合度影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 白酒丟糟基微晶纖維素制備工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiments for optimization of preparation process conditions of Baijiu distiller's grains to prepare microcrystalline cellulose

由圖1A可知，隨著酶解時(shí)間在0～7 h內(nèi)的延長(zhǎng)，聚合度在不斷下降，說(shuō)明丟糟微晶纖維素在不斷降解，解離速度較快，其原因可能是，中性鹽離子（Na+）等對(duì)纖維素酶具有激活作用[21]。當(dāng)酶解時(shí)間為7 h，聚合度為137；當(dāng)酶解時(shí)間＞7 h，聚合度下降比較平緩。這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，剩余丟糟的木質(zhì)纖維包被結(jié)構(gòu)[11]，導(dǎo)致在開(kāi)始階段使酶很難結(jié)合到其內(nèi)部的酶反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，反應(yīng)速率較低；當(dāng)酶作用一段時(shí)間后，剩余木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)被逐步破壞，使酶結(jié)合位點(diǎn)增加；但隨著水解產(chǎn)物的增加，對(duì)酶解反應(yīng)有抑制作用，丟糟MCC的平衡聚合度的酶解時(shí)間為7 h。因此，最佳酶解時(shí)間為7 h。

由圖1B可知，纖維素酶的添加量為0～12 U/g，聚合度快速下降，丟糟纖維素劇烈降解；纖維素酶的添加量為12 U/g時(shí)，聚合度為150；纖維素酶添加量＞12 U/g，聚合度的下降趨勢(shì)趨于平緩，丟糟MCC的解離基本達(dá)到平衡聚合度，其原因可能是，在酶解反應(yīng)過(guò)程中，纖維素酶催化的產(chǎn)物有纖維二糖及葡萄糖，能降低酶解程度，抑制酶解反應(yīng)[22]，這是導(dǎo)致酶解效率不高的主要因素。因此，最佳纖維素酶添加量為12 U/g。

由圖1C可知，當(dāng)料液比為1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL）時(shí)，聚合度有所下降，其原因可能是，隨著料液比的減小，混合酶體積增加，體系流動(dòng)性加強(qiáng)，而且相同濃度酶液中的酶分子數(shù)量增加，提高了酶與底物的接觸面積和反應(yīng)幾率，酶解作用加強(qiáng)[11]；當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)，丟糟微晶纖維素的聚合度值最低（230），其原因可能是料液較小時(shí)，反應(yīng)底物濃度較高，體系流動(dòng)性較差，溶液難以攪拌均勻，阻止了酶向纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)部的滲透，致使酶與纖維素接觸面積變小，纖維素酶難以和底物充分接觸，難以發(fā)生酶解反應(yīng)，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率變慢[11]。當(dāng)料液比為1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）時(shí)，聚合度增加，其原因可能是溶液又經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)鹄w維素酶濃度降低。因此，最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

2.3 白酒丟糟基MCC制備工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以丟糟基MCC聚合度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取纖維素酶的添加量（A）、酶解時(shí)間（B）和料液比（C）3個(gè)因素進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

表3 白酒丟糟基微晶纖維素制備工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results of orthogonal experiments for optimization of preparation process conditions of microcrystalline cellulose from Baijiu distiller's grains to prepare

由表3可知，3個(gè)因素對(duì)丟糟基MCC影響的主次順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞加酶量＞料液比。另外，由k值可知，得到的最優(yōu)組合為A3B3C2。即加酶量24 U/g，酶解時(shí)間9 h，料液比為1∶20。對(duì)最優(yōu)酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證，所得MCC的聚合度為118。

2.4 白酒丟糟基MCC的結(jié)構(gòu)特性和主要性能指標(biāo)參數(shù)

MCC的持水力為521%，膨脹度為1.27 mL/g，白度為88。丟糟基MCC掃描電鏡圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，丟糟基MCC原來(lái)的纖維結(jié)構(gòu)被破壞，現(xiàn)呈棒狀，粒徑約為20 μm。試驗(yàn)所得丟糟基MCC與文獻(xiàn)[23]中由稻秸稈制成的MCC形態(tài)相似（圖3a）；與文獻(xiàn)[24]中由廢棉制成的纖維素形態(tài)有所差異，文獻(xiàn)中MCC形態(tài)（圖3b）沒(méi)有脫去木質(zhì)素，所得MCC粒徑更大（20～50 μm），外觀較為平滑。

圖2 白酒丟糟基微晶纖維素掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of microcrystalline cellulose from Baijiu distiller's grains

圖3 文獻(xiàn)中的微晶纖維素掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope of microcrystalline cellulose in literature

2.5 制備白酒丟糟基MCC過(guò)程廢水中有機(jī)質(zhì)的含量

100 g丟糟制取MCC過(guò)程收集到約2 000 mL的廢水，廢水中各有機(jī)質(zhì)含量為：總糖11.59g/L、蛋白質(zhì)21.11g/L、脂肪酸2.10 g/L。另外，在粗纖維素漂白后Na+終濃度為0.12 mol/L。

2.6 乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin廢水培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.6.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖4A可知，隨著氮源添加量在5～15 g/L范圍內(nèi)的增加，菌株的生物量明顯上升；氮源添加量為15 g/L時(shí)，生物量達(dá)最高值，為4.0×107CFU/mL；當(dāng)?shù)刺砑恿浚?5 g/L時(shí)，菌株的生物量有所下降。因此，最適氮源添加量為15 g/L。由圖4B可知，當(dāng)蔗糖的添加量為0～7.5 g/L時(shí)，生物量逐漸增加；當(dāng)蔗糖添加量為7.5 g/L時(shí)，生物量為6.3×107CFU/mL；當(dāng)蔗糖添加量＞7.5 g/L時(shí)，生物量變化不明顯。因此，最適蔗糖添加量為7.5 g/L。由圖4C可知，當(dāng)KH2PO4的添加量為0～15 g/L時(shí)，生物量逐漸增加；當(dāng)KH2PO4添加量為15 g/L時(shí)，生物量達(dá)最大值，為6.3×107CFU/mL；當(dāng)KH2PO4添加量＞15 g/L時(shí)，生物量逐漸下降。因?yàn)榫圃阒泻胸S富的微量元素，這些元素的存在，代替了一部分KH2PO4的作用，相對(duì)種子培養(yǎng)基的用量（20 g/L）降低了25%。因此，確定最適KH2PO4添加量為15 g/L。由圖4D可知，硫酸鎂的添加量為0～0.15 g/L時(shí)，生物量逐漸增加；硫酸鎂的添加量為0.15 g/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值，為6.2×107CFU/mL；當(dāng)硫酸鎂的添加量＞0.15 g/L時(shí)，生物量逐漸下降。因此，確定最適硫酸鎂添加量為0.15 g/L。

圖4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of single factor tests for medium component optimization

2.6.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以生物量（Y）為響應(yīng)值，選取氮源添加量（A）、蔗糖添加量（B）和KH2PO4添加量（C）3個(gè)自變量，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化廢水培養(yǎng)基組分。培養(yǎng)基組分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，回歸模型方差分析見(jiàn)表5。

表4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests for medium component optimization

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到乳酸乳球菌生物量與氮源添加量、蔗糖添加量、KH2PO4添加量之間的二次多項(xiàng)回歸模型為：

由表5可知，模型的P值＜0.001，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P值=0.052 6＞0.05，不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。決定系數(shù)R2=0.979 9，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.943 8，表明該模型擬合度良好，由P值可知，一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3個(gè)因素對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)量的影響順序依次為蔗糖添加量（B）＞KH2PO4添加量（C）＞氮源添加量（A）。

各因素間交互作用對(duì)菌株生物量影響的響應(yīng)曲面和等高線見(jiàn)圖5。響應(yīng)面圖越陡峭，等高線圖越接近橢圓，說(shuō)明兩因素間交互作用對(duì)菌株生物量的影響越大。由圖5可知，蔗糖添加量（B）與KH2PO4添加量（C）響應(yīng)曲面圖較陡峭，說(shuō)明兩者具有一定交互作用。

圖5 各因素間交互作用對(duì)菌株生物量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on biomass of strain

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面軟件分析，得到最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：氮源16.78 g/L、蔗糖8.99 g/L、KH2PO419.10 g/L，在此優(yōu)化條件下，乳酸乳球菌的生長(zhǎng)量預(yù)測(cè)值為6.4×107CFU/mL。考慮實(shí)際應(yīng)用，將最佳培養(yǎng)基組分修正為：氮源16 g/L、蔗糖9 g/L、KH2PO419 g/L，進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到乳酸乳球菌的生長(zhǎng)量實(shí)際值為6.3×107CFU/mL，與預(yù)測(cè)值相差不大，因此，可用該模型對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.7 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸乳球菌產(chǎn)Nisin的結(jié)果

試驗(yàn)測(cè)出工業(yè)常用培養(yǎng)乳酸乳球菌的種子培養(yǎng)基、本研究?jī)?yōu)化的廢水培養(yǎng)基和不外加氮源和碳源的培養(yǎng)基產(chǎn)生Nisin效價(jià)分別為487.75 IU/mL、732.52 IU/mL和49.23 IU/mL。Nisin效價(jià)與乳酸乳球菌生長(zhǎng)量呈正相關(guān)，在上述效價(jià)值下乳酸乳球菌的生物量分別為6.4×107CFU/mL、6.3×107CFU/mL和0.4×107CFU/mL。優(yōu)化的廢水培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸乳球菌在生物量上相差不大，但是優(yōu)化的廢水培養(yǎng)基產(chǎn)Nisin的效價(jià)比種子培養(yǎng)基高了50.18%?？赡苁前拙苼G糟廢水中除了含有蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、木質(zhì)素、纖維素外，還含有豐富的微量元素，這些微量元素對(duì)乳酸乳球菌的生長(zhǎng)可能有非常好的促進(jìn)作用，并且能大幅度提高nisin的產(chǎn)量。這類(lèi)nisin產(chǎn)品主要應(yīng)用于飼料防腐，尤其是豬飼料中。

3 結(jié)論

MCC的最佳制備工藝條件為纖維素酶加酶量0.8%，酶解時(shí)間9 h，料液比為1∶20（g∶mL），在此條件下，MCC聚合度為118，其結(jié)構(gòu)呈棒狀。確定最佳酶解丟糟制備MCC過(guò)程中產(chǎn)Nisin的培養(yǎng)基組分為：酵母粉8 g/L和蛋白胨8 g/L、蔗糖9 g/L、KH2PO419 g/L、硫酸鎂為0.15 g/L，在此優(yōu)化條件下，乳酸乳球菌生物量為6.3×107CFU/mL，Nisin效價(jià)為732.52 IU/mL。本研究利用酶法制備出的MCC與硝酸-乙醇法[9]制備丟糟MCC相比聚合度更低，綠色環(huán)保，并且對(duì)環(huán)境零負(fù)荷；同時(shí)把丟糟制備MCC過(guò)程產(chǎn)生的廢水用于培養(yǎng)乳酸乳球菌的碳氮源，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為高附加值的生物防腐劑Nisin。本研究真正實(shí)現(xiàn)了白酒丟糟的高值化利用，為發(fā)展以丟糟為原料的輕工產(chǎn)業(yè)，實(shí)現(xiàn)潔凈生產(chǎn)、原料高值化利用、控制污染問(wèn)題和增加企業(yè)效益的一體化技術(shù)體系提供思路和方法指導(dǎo)。