產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶芽孢桿菌的篩選鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)分析

張傳麗，李同祥，楊 凡，肖凱峰，徐 芳，陳路路，孫會(huì)剛*

（徐州工程學(xué)院 食品與生物程學(xué)院，江蘇 徐州 221018）

淀粉酶和蛋白酶是國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)上應(yīng)用廣泛的兩種重要的工業(yè)酶[1-2]，被廣泛應(yīng)用于紡織、食品、洗滌劑、醫(yī)藥、飼料加工和化工等領(lǐng)域[3]。淀粉酶可催化水解淀粉、糖原和糊精中的糖苷鍵，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶等，而芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物是α-淀粉酶最主要的工業(yè)生產(chǎn)菌屬[4]。蛋白酶能切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，使蛋白質(zhì)分子變成小分子多肽和氨基酸，主要包括酸性、中性和堿性蛋白酶等，目前工業(yè)上2/3以上的蛋白酶由微生物發(fā)酵產(chǎn)生[2]，發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的微生物菌種主要有細(xì)菌、霉菌和放線菌等，其中芽孢桿菌屬主要用于發(fā)酵生產(chǎn)中性和堿性蛋白酶制劑[5]。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧的、能夠產(chǎn)生抗逆性芽孢的細(xì)菌，在環(huán)境中廣泛存在，可分泌多種水解酶類。國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌株研究報(bào)道較多，如ABO-KAMER A M 等[6]從土壤中分離得到的可產(chǎn)α-淀粉酶的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、DUAN X G等[7]分離得到的產(chǎn)β-淀粉酶的阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）GEL-09菌株等，除此之外，已報(bào)道的產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌還有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[8]、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[9-10]、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[11-12]、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）[13]等。同時(shí)，研究者們對(duì)產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌屬也進(jìn)行了很多相關(guān)的研究報(bào)道，如KESHAPAGA U R等[14]分離得到的高產(chǎn)半胱氨酸蛋白酶的枯草芽孢桿菌A4；JAYAKUMAR D等[15]從土壤中分離得到的可產(chǎn)具有熱穩(wěn)定性的堿性蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌KM05；YU P等[16]分離得到的可產(chǎn)中性蛋白酶的芽孢桿菌（Bacillus）ZG20等。此外，已報(bào)道的產(chǎn)中性或堿性蛋白酶的芽孢桿菌還有解淀粉芽孢桿菌[17]等，其中枯草芽孢桿菌AS1.398、地衣芽孢桿菌2709是我國(guó)較早用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的菌株[18-20]。

本研究從本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的61株芽孢桿菌菌株中篩選產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的菌株，采用菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定方法對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定，并研究溫度、pH和金屬離子等對(duì)其所產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響，以期為后續(xù)酶促反應(yīng)特異性分析、酶促動(dòng)力學(xué)分析以及該菌株在食品飲料、醫(yī)藥等生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種芽孢桿菌菌株（共61株，編號(hào)CX-1～CX-61）：前期從土壤中分離得到，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

干酪素、酪氨酸、可溶性淀粉、麥芽糖、脫脂奶粉、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉浸膏、酒石酸鉀鈉、苯酚、三氯乙酸、乙酸、乙酸鈉、氯化鈉、鹽酸、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、硼酸、硼砂、亞硫酸鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋰、氯化錳：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林-酚：南京奧多福尼生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基采用LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉10.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0。121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

淀粉酶篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉2.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，脫脂奶粉15.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

732C可見(jiàn)分光光度計(jì)、JY4001電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SX500立式高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy Digital Biology公司；HWS-80B恒溫培養(yǎng)箱：北京恒諾利興科技有限公司；NRY-100C恒溫?fù)u床：上海南榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：上海蘇凈凈化有限公司；Centrifuge5418R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；PHS-3E pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；MiniAmp聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Applied Biosystems公司；DYY-8C電泳儀、DYCP-31E脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）水平電泳槽：北京六一儀器廠；JS-8000全自動(dòng)凝膠成像儀：上海培清科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

（1）初篩

取1 mL待測(cè)菌液接入20 mL種子液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，吸取富集菌液0.5 mL按10倍梯度稀釋至10-6，取0.1 mL稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，分別點(diǎn)接種于淀粉酶篩選培養(yǎng)基和蛋白酶篩選培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落透明圈，計(jì)算透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）值，挑選同時(shí)具有較大淀粉酶和蛋白酶H/C值的菌落為初篩菌株。

（2）復(fù)篩

挑取初篩得到的目的菌株接種于20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，棄菌體，取上清液，分別測(cè)定淀粉酶和蛋白酶活力，選擇淀粉酶和蛋白酶活力高的菌株。

1.3.2 淀粉酶和蛋白酶酶活力測(cè)定

（1）種子液制備

挑取復(fù)篩得到的目的菌株接種于20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，即為篩選菌株種子液。

（2）粗酶液制備

按照1%（V/V）的接種量取5 mL種子液接種于裝液量為50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

（3）淀粉酶酶活測(cè)定

采用DNS比色法測(cè)定淀粉酶酶活[21]。淀粉酶活力單位定義：在40 ℃、pH 6.0的條件下，每分鐘從1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的可溶性淀粉中水解釋放出1 μmol還原糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

（4）蛋白酶酶活測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶酶活[22]。蛋白酶活力單位定義：在40 ℃、pH 7.5的條件下，每分鐘將酪蛋白水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 菌株鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

將菌株CX-47接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h后，參考文獻(xiàn)[23]對(duì)菌株CX-47進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

（2）生理生化試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[24]對(duì)菌株CX-47進(jìn)行革蘭氏染色、V.P試驗(yàn)、水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

（3）分子生物學(xué)鑒定

挑取少量待測(cè)菌株于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，取2 μL菌液，用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：2 μL DNA模板，2 μL引物27F，2 μL引物1492R，5 μL 10×PCR Buffer，4 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/each），34.5 μL雙蒸水（ddH2O），0.5 μLTaqDNA聚合酶（5 U/L）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。將菌落PCR的16S rDNA測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology infor mation，NCBI）中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)

（1）反應(yīng)溫度對(duì)淀粉酶和蛋白酶活性影響

反應(yīng)溫度分別設(shè)定為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，以最高酶活定義為100%，分別計(jì)算不同反應(yīng)溫度條件下淀粉酶和蛋白酶的相對(duì)酶活。

（2）反應(yīng)pH值對(duì)淀粉酶和蛋白酶活性影響

在反應(yīng)溫度40 ℃條件下，分別測(cè)定反應(yīng)pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0時(shí)的酶活，以最高酶活定義為100%，分別計(jì)算不同反應(yīng)pH值條件下淀粉酶和蛋白酶的相對(duì)酶活。

（3）金屬離子對(duì)淀粉酶和蛋白酶活性影響

粗酶液中分別加入K+、Ca2+、Li+和Mn2+，使金屬離子終濃度為20 mmol/L，4 ℃條件下放置1 h，測(cè)定酶活力，以不添加金屬離子的酶活定義為100%，分別計(jì)算不同金屬離子條件下淀粉酶和蛋白酶的相對(duì)酶活。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)分析采用Excel 2016，并用Origin 9.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株篩選

將實(shí)驗(yàn)室保藏的61株土壤源芽孢桿菌分別在淀粉酶篩選培養(yǎng)基和蛋白酶篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，利用目的菌株能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生透明圈、產(chǎn)生蛋白酶水解脫脂奶粉產(chǎn)生透明圈等特性進(jìn)行初篩，其中代表菌株在培養(yǎng)基上淀粉酶、蛋白酶水解圈及菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1a和圖1b可知，能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶的菌株分別在淀粉酶篩選培養(yǎng)基和蛋白酶篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生了清晰、較大的透明圈。由圖1c可知，菌落形態(tài)為圓形或橢圓形，有褶皺、表面粗糙、無(wú)光澤，呈白色不透明狀、邊緣整齊。分別測(cè)量記錄61株供試菌株透明圈直徑（H）和菌落直徑（C），計(jì)算H/C值，選出9株H/C值較大的菌株CX-3、CX-7、CX-16、CX-23、CX-35、CX-41、CX-47、CX-50和CX-58進(jìn)行復(fù)篩。

對(duì)初篩得到的9株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其發(fā)酵所產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶活性，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株CX-47產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶H/C值均最高，分別為4.47、3.35，該菌株發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶活性也最高，分別為10.24 U/mL、249.42 U/mL。因此，確定菌株CX-47為篩選目的菌株。

2.2 菌株CX-47鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株CX-47在LB固體培養(yǎng)基上形成圓形或橢圓形菌落，菌落有褶皺、表面粗糙、無(wú)光澤，呈白色不透明狀、邊緣整齊。

2.2.2 生理生化試驗(yàn)

菌株CX-47主要生理生化特征見(jiàn)表2。由表2可知，菌株CX-47屬革蘭氏陽(yáng)性菌，可厭氧生長(zhǎng)，能水解淀粉、酪蛋白和明膠，能分解過(guò)氧化氫，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，能利用硝酸鹽、檸檬酸，能耐受10%NaCl和pH 8.5的培養(yǎng)條件，但不能耐受55 ℃的高溫培養(yǎng)，V.P試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，氧化酶試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中相關(guān)菌屬的描述特征，初步鑒定菌株CX-47為芽孢桿菌（Bacillus）。

表2 菌株CX-47的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain CX-47

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株CX-47的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16SrDNA基因序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在1 500 bp左右出現(xiàn)條帶，說(shuō)明PCR成功擴(kuò)增出了目標(biāo)序列。

圖2 菌株CX-47 16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplification products of 16S rDNA gene sequence for strain CX-47

采用MEGA7.0軟件以NJ法構(gòu)建菌株CX-47系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株CX-47的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain CX-47 based on 16S rDNA gene sequence

由圖3可知，將基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株CX-47的16S rDNA基因序列與解淀粉芽孢桿菌屬同源性最高，達(dá)99%以上。菌株CX-47與Bacillus amyloliquefaciens（MK959037）進(jìn)化親緣關(guān)系最近。因此，菌株CX-47被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.3 淀粉酶和蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響

根據(jù)最適反應(yīng)溫度的不同，可將淀粉酶分為低溫淀粉酶（低于30 ℃）、中溫淀粉酶（30～60 ℃）和高溫淀粉酶（最適催化溫度60 ℃以上）[25]。反應(yīng)溫度對(duì)菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在反應(yīng)溫度在20～50 ℃時(shí)，菌株CX-47發(fā)酵產(chǎn)生的淀粉酶催化活性隨著溫度的升高而升高；在反應(yīng)溫度50 ℃時(shí)，淀粉酶催化水解淀粉的能力最強(qiáng)，其催化能力是20 ℃時(shí)的5倍多；之后，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，淀粉酶催化活力快速下降，當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，其酶活性僅為50 ℃時(shí)的約10%。結(jié)果表明，菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶的最適溫度為50 ℃，為中溫淀粉酶。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)菌株CX-47產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on activities of amylase and protease produced by strain CX-47

根據(jù)最適催化反應(yīng)溫度的不同，蛋白酶也可分為嗜熱、中溫和嗜冷蛋白酶，其中嗜熱蛋白酶的最適反應(yīng)溫度通常在60 ℃以上[26]，嗜冷蛋白酶最適反應(yīng)溫度一般在40 ℃以下[27]，由圖4可知，在20～50 ℃反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，隨著酶促反應(yīng)溫度的升高，蛋白酶催化反應(yīng)活性逐步增加；在溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最高，之后，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，蛋白酶催化活性迅速降低。結(jié)果表明，菌株CX-47發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶最適催化反應(yīng)溫度為50 ℃，為中溫蛋白酶。

2.3.2 反應(yīng)pH對(duì)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響

根據(jù)最適反應(yīng)pH值不同，可將淀粉酶分為堿性淀粉酶、中性淀粉酶和酸性淀粉酶等，其中堿性淀粉酶最適反應(yīng)pH值＞8.0、中性淀粉酶最適反應(yīng)pH值為6.0～8.0、酸性淀粉酶最適反應(yīng)pH值＜6.0[25]。反應(yīng)pH對(duì)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著反應(yīng)pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)增加，菌株CX-47產(chǎn)淀粉酶酶促反應(yīng)活性隨之增加；反應(yīng)pH值為7.0時(shí)，淀粉酶活性最高；反應(yīng)pH值＞7.0之后，淀粉酶活性隨之下降。因此，菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶最適反應(yīng)pH值為7.0，屬于中性淀粉酶。

圖5 反應(yīng)pH值對(duì)菌株CX-47產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of reaction pH on activities of amylase and protease produced by strain CX-47

根據(jù)蛋白酶作用的最適pH不同，可將其分為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶，其中堿性蛋白酶的最適作用pH為9～11，中性蛋白酶的最適作用pH為6.0～7.5，酸性蛋白酶的最適作用pH值為2.0～4.0[28]。由圖5可知，隨著pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)增加，菌株CX-47產(chǎn)蛋白酶活性隨之增加；在pH值7.0時(shí)，蛋白酶活性最高；pH＞7.0之后，蛋白酶活性隨之下降。因此，菌株CX-47產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)pH值為7.0，屬中性蛋白酶。

綜上所述，CX-47菌株所產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶均為中溫中性酶。

可同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生多種活性成分的微生物越來(lái)越受到研究者們的重視，到目前為止已有較多相關(guān)的研究報(bào)道。ZHANG A D等[29]采用ARTP法誘變具有產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的特性地衣芽孢桿菌XS-4，得到了淀粉酶和酸性蛋白酶活性極顯著提高的mut80突變株，該突變株可顯著提升傳統(tǒng)的醬油發(fā)酵工藝水平。BHANGE K等[30]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌PF1菌株可發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和表面活性劑等成分，其發(fā)酵所產(chǎn)淀粉酶與蛋白酶的最適pH/最適溫度分別為6.0/70 ℃、9.0/60 ℃，分別屬于高溫中性淀粉酶、中溫堿性蛋白酶，該淀粉酶、蛋白酶和表面活性劑等作為洗滌劑添加劑的去污能力極強(qiáng)，表明PF1菌株在發(fā)酵生產(chǎn)洗滌劑添加劑方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。RAI A K等[31]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌KN12C菌株、解淀粉芽孢桿菌KN2G菌株和地衣芽孢桿菌KN13C菌株等3株芽孢桿菌均可同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和蛋白酶等3種水解酶，分別利用這3個(gè)菌株發(fā)酵水解大豆均獲得了具有較高生物活性的大豆水解產(chǎn)物，表明這3個(gè)菌株在大豆加工等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)中，菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶在溫度40～60 ℃/pH 6.0～8.0范圍內(nèi)、所產(chǎn)蛋白酶在溫度40～50 ℃/pH6.0～7.0范圍內(nèi)均具有相對(duì)較高的水解活性，可在酶催化反應(yīng)最容易達(dá)到的反應(yīng)條件范圍內(nèi)將淀粉等大分子糖類物質(zhì)水解成小分子糖類、將動(dòng)植物蛋白水解成為小分子的氨基酸或者多肽等，因此，推測(cè)菌株CX-47在食品加工、皮革加工、釀造、洗滌等行業(yè)具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.3.3 金屬離子對(duì)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響

金屬離子對(duì)淀粉酶和蛋白酶催化活性的影響見(jiàn)圖6。由圖6A可知，K+和Ca2+對(duì)菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶催化活性具有一定的促進(jìn)作用，而Li+和Mn2+則對(duì)其有一定程度的抑制作用。

圖6 金屬離子對(duì)菌株CX-47產(chǎn)淀粉酶（A）和蛋白酶（B）活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on activities of amylase (A) and protease(B) produced by strain CX-47

淀粉酶根據(jù)水解產(chǎn)物異頭碳的不同，可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶等，其中多數(shù)α-淀粉酶結(jié)構(gòu)中含有鈣離子結(jié)合域，屬鈣離子依賴型淀粉酶[32]。ABD-ELAZIZ A M等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Mg2+和Ba2+等可顯著促進(jìn)萎縮芽孢桿菌NRC1菌株α-淀粉酶活性，而K+、Ni2+、Zn2+、Na+和Cu2+等則可抑制其催化活性；張巧格[33]研究發(fā)現(xiàn)，Na+和Ca2+等可顯著促進(jìn)解淀粉芽孢桿菌BH072菌株α-淀粉酶催化活性，而K+和Mn2+等則抑制其水解活性。本試驗(yàn)中Ca2+僅可輕微程度促進(jìn)淀粉酶催化活性，分析其原因，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中所使用的金屬氯化物濃度高（40 mmo/L）導(dǎo)致氯離子濃度過(guò)高而引起的。HAN N等[34]研究發(fā)現(xiàn)，氯離子可通過(guò)改變解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶結(jié)構(gòu)而影響其活性，當(dāng)氯離子濃度低于20 mmo/L時(shí)，可促進(jìn)其催化活性，而當(dāng)氯離子濃度高于20 mmo/L時(shí)，則會(huì)抑制其催化活性。本試驗(yàn)中高濃度的氯離子可能較大程度地抵消了Ca2+對(duì)CX-47菌株α-淀粉酶的催化促進(jìn)作用，從而使得Ca2+對(duì)總淀粉酶活性增幅較小。

由圖6B可知，經(jīng)40 mmo/L金屬離子處理后菌株CX-47蛋白酶催化活性較對(duì)照組均有較大提高，K+、Ca2+、Li+和Mn2+分別提高了約1.3倍、1.5倍、1.5倍和2.7倍，均可顯著提高菌株CX-47蛋白酶催化活性（P＜0.05）。

PATHAK A P等[35]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+、K+、Ca2+、Mg2+等可促進(jìn)阿氏芽孢桿菌P1菌株蛋白酶的催化活性；PRIHANTO A A等[36]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌UBT7菌株產(chǎn)中性蛋白酶可被K+、Fe2+等提高其催化活性；AO X L等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Ca2+、Li+、Na+、Sn2+、Cu2+、Pb2+、Fe2+和Al3+等多種金屬離子均可促進(jìn)米曲霉Y1菌株產(chǎn)中性蛋白酶催化活性，Mg2+、Ba2+和Zn2+等則可抑制其活性。本研究結(jié)果與他們的研究報(bào)道內(nèi)容基本相同，但菌株CX-47蛋白酶在Mn2+存在條件下的相對(duì)酶活遠(yuǎn)高于阿氏芽孢桿菌P1菌株、枯草芽孢桿菌UBT7菌株和米曲霉Y1菌株等的相對(duì)酶活。

3 結(jié)論

本研究篩選到一株產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的土壤源菌株CX-47，其被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶最適水解反應(yīng)溫度均為50 ℃、最適反應(yīng)pH值均為7.0；K+和Ca2+對(duì)菌株CX-47所產(chǎn)淀粉酶具有一定的激活作用；K+、Ca2+、Li+和Mn2+均可顯著提高菌株CX-47蛋白酶催化活性（P＜0.05）。綜上所述，菌株CX-47發(fā)酵產(chǎn)物具有較高的淀粉酶和蛋白酶活性，后續(xù)有望通過(guò)傳統(tǒng)育種或基因工程育種等手段進(jìn)一步優(yōu)化其所產(chǎn)兩種酶的性能，為我國(guó)酶制劑的發(fā)展應(yīng)用提供一定的依據(jù)。