人工培養(yǎng)窖泥中微生物菌群多樣性解析

楊少勇，賀子豪，李 娜，郭 壯，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.釀造微生物研究與應(yīng)用襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441053）

濃香型白酒是中國(guó)十二大香型白酒之一，其生產(chǎn)工藝一般采用固態(tài)發(fā)酵[1]。在生產(chǎn)過(guò)程中最主要的發(fā)酵設(shè)備是窖池，窖池的質(zhì)量與白酒的品質(zhì)息息相關(guān)，而窖池的好壞本質(zhì)上在于窖泥的品質(zhì)[2]。窖泥本身是新鮮的土壤，在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中形成了一個(gè)獨(dú)特的微生物群落[3]。在窖池中，微生物以窖泥為載體，酒醅為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在生長(zhǎng)繁殖時(shí)代謝出各種影響白酒品質(zhì)的風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)[4]。然而，新建窖池一般至少經(jīng)過(guò)20年的自然成熟期才能產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的白酒，這導(dǎo)致自然成熟窖泥的數(shù)量無(wú)法滿足白酒行業(yè)的快速發(fā)展[5]。因此，研究人員利用現(xiàn)代微生物技術(shù)培養(yǎng)出人工窖泥，大大縮短了窖泥自然成熟的時(shí)間。

人工窖泥的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是研究人員將發(fā)酵劑接種到按比例混合的新鮮土壤、自然成熟窖泥、豆粕和小麥的混合物中，然后在厭氧條件下培養(yǎng)30～60 d[6]。MU Y等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在人工窖泥中添加強(qiáng)化大曲可以改變其原核微生物群落，從而提升人工窖泥的風(fēng)味品質(zhì)。魯少文等[8]在人工窖泥中添加前期研究發(fā)現(xiàn)的新型己酸菌可以大大縮短窖泥自然成熟的時(shí)間。

目前，對(duì)人工窖泥品質(zhì)提升的研究較為深入，但關(guān)于人工窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較少。本研究利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采集自湖北省襄陽(yáng)市的人工窖泥中微生物菌群多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以此探究人工窖泥中微生物群落組成，以期為人工窖泥培養(yǎng)方法的改良以及品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

人工窖泥：于2022年10月在湖北省襄陽(yáng)市某酒廠采集，共3份，編號(hào)為XF1～XF3。3份人工窖泥均由該酒廠自制：用含沙量低、粘性強(qiáng)、無(wú)污染的黃土做載體，輔以優(yōu)質(zhì)曲粉，高蛋白、高能量的農(nóng)副產(chǎn)品以及優(yōu)良醅糟、復(fù)合功能菌液、黃水和酒尾等原料，于溫度、水分、pH值等適宜的窖泥培養(yǎng)池中厭氧培養(yǎng)，采集的樣品均已厭氧培養(yǎng)50 d左右，采集后裝入無(wú)菌袋中迅速運(yùn)回至實(shí)驗(yàn)室，置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國(guó)Omega Bio-Tek公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、DNA聚合酶（5 U/μL）、2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）mix：上海桑尼生物科技有限公司；引物338F/806R、ITS3F/ITS4R：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；DNA Marker、10倍緩沖液：青島蔚來(lái)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；TG16MW微量高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；Vortex-2旋渦混勻儀：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；FluorChem HD2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：普諾森生物科技（上海）有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；R930機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司；S1000梯度PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人工窖泥樣品微生物菌群總基因組DNA的提取

稱取2.0 g混勻的人工窖泥樣品，按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)3份人工窖泥樣品的基因組DNA進(jìn)行提取[9]，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA的完整性和純度，檢驗(yàn)合格并測(cè)定其濃度，置于-40 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 人工窖泥樣品微生物菌群PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq高通量測(cè)序

以檢驗(yàn)合格總基因組DNA為模板，使用帶有細(xì)菌特異性核苷酸標(biāo)簽的引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照周文等[10]的方法進(jìn)行；使用帶有真菌特異性核苷酸標(biāo)簽的引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3'）對(duì)真菌ITS區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照李斌等[11]的方法進(jìn)行。合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物技術(shù)有限公司的Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行第二代高通量測(cè)序。

1.3.3 下機(jī)數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

測(cè)序返回的原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)校正、拼接和質(zhì)控等優(yōu)化處理后得到合格的序列[12]。再經(jīng)去除嵌合體序列后，得到優(yōu)質(zhì)序列。將優(yōu)質(zhì)序列上傳至QIIME（v1.7.1）平臺(tái)進(jìn)行微生物多樣性評(píng)價(jià)。采用UPARSE軟件對(duì)優(yōu)質(zhì)序列以97%的相似度劃分并創(chuàng)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），選取具有代表性的OTU優(yōu)質(zhì)序列在GREENGENE數(shù)據(jù)庫(kù)[13]和核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）數(shù)據(jù)庫(kù)[14]中對(duì)細(xì)菌和真菌序列進(jìn)行物種分類和注釋，并對(duì)人工窖泥樣品中微生物菌群多樣性進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)R軟件（v4.1.1）繪制韋恩圖，通過(guò)繪圖網(wǎng)站（http：//www.cloudtutu.com）繪制人工窖泥樣品中優(yōu)勢(shì)菌門的物種豐度星圖和優(yōu)勢(shì)菌屬的環(huán)狀熱圖，使用R軟件（v4.1.1）的corrplot包繪制樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬的相關(guān)性熱圖，其他可視化分析圖均由軟件Origin 2018繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工窖泥樣品微生物菌群的多樣性分析

對(duì)3份人工窖泥樣品的細(xì)菌和真菌共277 849條和163 359條原始下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控，平均每份樣品包含92 614條細(xì)菌有效序列和54 453條真菌有效序列。在97%的相似度下劃分優(yōu)質(zhì)序列，共獲得12 128個(gè)細(xì)菌OTU和1 034個(gè)真菌OTU。人工窖泥樣品中細(xì)菌和真菌的稀疏曲線見圖1。

圖1 人工窖泥樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）菌群的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curve of bacterial (a) and fungal (b) communities in artificial pit mud samples

由圖1可知，隨著測(cè)序深度的增加，樣品中OTU的數(shù)量逐漸趨于飽和，只有少量新的OTU產(chǎn)生，說(shuō)明樣品的測(cè)序量和深度合理，能夠真實(shí)的反映樣品中微生物多樣性，滿足后續(xù)分析的要求。由圖1亦可知，在同一測(cè)序深度下，XF2樣品的細(xì)菌菌群多樣性較其他樣品高，真菌菌群多樣性較其他樣品低。

為進(jìn)一步探究樣品間微生物菌群的相似性和差異性，基于OTU水平對(duì)人工窖泥樣品的微生物進(jìn)行韋恩圖分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于操作分類單元水平人工窖泥樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacteria (a) and fungi (b) in artificial pit mud samples based on operational taxonomic unit level

由圖2可知，在細(xì)菌OTU水平上，XF1、XF2和XF3樣品中分別劃分出8 038、9 376和9 698個(gè)OTU，其中共有OTU為4 801個(gè)，占細(xì)菌總OTU數(shù)的17.71%；在真菌OTU水平上，XF1、XF2和XF3樣品中分別劃分出703、678和733個(gè)OTU，其中共有OTU數(shù)為383個(gè)，占真菌總OTU數(shù)的18.12%。由此可見，人工窖泥中微生物菌群組成較為豐富且存在一定的共有菌群。除此之外，各樣品中還包含有數(shù)量不等的細(xì)菌、真菌OTU序列，表明不同人工窖泥樣品的菌群組成亦存在一定的特異性。

2.2 人工窖泥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

在對(duì)人工窖泥微生物菌群多樣性分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行物種分類和注釋，在門和屬水平上共注釋到14個(gè)細(xì)菌門和343個(gè)細(xì)菌屬，13個(gè)真菌門和106個(gè)真菌屬。將平均相對(duì)豐度＞1.0%的菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)菌門或優(yōu)勢(shì)菌屬，將其他已知但平均相對(duì)豐度＜1.0%的門或?qū)贇w類為“others”，將未知物種歸類為“unclassified”。基于門水平，人工窖泥樣品中細(xì)菌和真菌菌群的結(jié)構(gòu)組成見圖3。

圖3 基于門水平人工窖泥樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of bacterial (a) and fungal (b) communities in artificial pit mud samples based on phylum level

由圖3a可知，在注釋到的14個(gè)細(xì)菌門中，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的平均相對(duì)豐度分別為70.69%、22.41%和3.04%，是人工窖泥樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。LIANG H等[15]運(yùn)用PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria在老窖泥和新窖泥兩種類型的窖泥中占優(yōu)勢(shì)，與本研究的結(jié)果較為相似，說(shuō)明在細(xì)菌門水平上，人工窖泥和正常窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的相似性。由圖3b可知，在注釋到的35個(gè)真菌門中，子囊菌門（Ascomycota）（89.60%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（3.52%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（3.48%）是人工窖泥樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌門。LIU Y等[16]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)陶融型白酒上、中、下和底層窖泥的微生群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota是上、中、下和底層窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌門，亦與本研究結(jié)果一致。由圖3亦可知，各樣品間細(xì)菌、真菌門水平組成相似但相對(duì)豐度不同，如放線菌門在各樣品中的相對(duì)豐度分別為23.64%、21.06%和22.55%；毛霉菌門在各樣品中的相對(duì)豐度分別為2.85%、3.39%和4.35%。

基于屬水平，進(jìn)一步對(duì)人工窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于屬水平人工窖泥樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）菌群結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of bacterial (a) and fungal (b) communities in artificial pit mud samples based on genus level

由圖4a可知，在細(xì)菌屬水平上，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有13個(gè)，包括魏斯氏菌屬（Weissella）（14.32%）、真桿菌屬（Eubacterium）（11.89%）、新斯氏菌屬（Neoscardovia）（9.42%）、片球菌屬（Pediococcus）（5.49%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（4.22%）、Caproicibacter（3.18%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）（2.02%）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）（1.71%）、真絲菌屬（Planifilum）（1.65%）、狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）（1.57%）、腸球菌屬（Enterococcus）（1.49%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.08%）和聯(lián)合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）（1.02%）。其中魏斯氏菌屬、片球菌屬和芽孢桿菌屬均屬于乳酸菌，其產(chǎn)生的乳酸與乙醇反應(yīng)可以生成白酒中重要的風(fēng)味成分乳酸乙酯[17]；高溫放線菌屬是大曲中產(chǎn)淀粉酶、果膠酶和纖維素酶等水解酶類的重要來(lái)源，對(duì)大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)的疏松和大曲骨架的維持有重要作用[18]；狹義梭菌屬是一類厭氧菌，能利用乙酸和乙醇等生成白酒中重要的香味成分己酸乙酯和丁酸乙酯[19]；真桿菌屬中部分菌種的發(fā)酵代謝產(chǎn)物為丁酸、乙酸或甲酸，這些菌屬均是釀酒過(guò)程中重要的釀酒功能菌屬[20]。由圖4b可知，在真菌屬水平上，優(yōu)勢(shì)真菌屬有6個(gè)，包括耐干霉菌屬（Xeromyces）（65.04%）、曲霉屬（Aspergillus）（9.57%）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）（2.71%）、Trichomonascus（2.18%）、根霉屬（Rhizopus）（2.04%）和畢赤酵母屬（Pichia）（1.07%）。其中耐干霉菌屬、曲霉屬和根霉屬等菌屬具有較強(qiáng)的分泌糖化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶類的能力，進(jìn)而促進(jìn)酵母菌繁殖，產(chǎn)生更多的乙醇，提升白酒的風(fēng)味和品質(zhì)[21]；畢赤酵母屬是酵母菌的一類，可以將甲醇作為碳源生成乙醇[22]。

由圖4亦可知，在細(xì)菌和真菌屬水平上，未知物種的平均相對(duì)豐度分別為22.82%和11.05%，在人工窖泥樣品中占比較大。綜上所述，人工窖泥樣品中不僅含有多種重要的釀酒功能菌屬，還有較多的未知物種，這對(duì)人工窖泥微生物菌庫(kù)的擴(kuò)充有著重要的意義。

2.3 人工窖泥樣品優(yōu)勢(shì)菌屬間的相關(guān)性分析

人工窖泥樣品中微生物菌群組成較為豐富，且各樣品細(xì)菌和真菌菌群存在一定的相似性和特異性，而高質(zhì)量人工窖泥形成的重要因素之一是微生物菌群的共同作用。為進(jìn)一步探究人工窖泥樣品中微生物菌群間的關(guān)系，對(duì)人工窖泥樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 人工窖泥樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬間相關(guān)性分析熱圖Fig.5 Heat map of correlation analysis between dominant microbial genera in artificial pit mud samples

由圖5可知，真絲菌屬（Planifilum）與芽孢桿菌屬（Bacillus）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），聯(lián)合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）與腸球菌屬（Enterococcus）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。其中，芽孢桿菌屬參與了白酒釀造全過(guò)程，其代謝產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等水解酶類可以將原料分解成各種風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)[23]；而聯(lián)合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）屬于乳酸菌，在一定條件下，其部分菌種產(chǎn)生的酸類物質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合會(huì)生成白酒的主體香型物質(zhì)乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯等[24]。由此可知，不同細(xì)菌類群間的協(xié)同效應(yīng)賦予了白酒獨(dú)特的酒體風(fēng)味。此外，人工窖泥樣品中部分優(yōu)勢(shì)菌屬間存在拮抗或競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，如曲霉屬（Aspergillus）與腸球菌屬（Enterococcus）呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；魏斯氏菌屬（Weissella）與高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）及畢赤酵母屬（Pichia）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），真絲菌屬（Planifilum）與真桿菌屬（Eubacterium）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）與新斯氏菌屬（Neoscardovia）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），聯(lián)合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）與狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）及曲霉屬（Aspergillus）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。曲霉屬為白酒釀制提供了種類繁多的酶類，如糖化酶、蛋白酶、液化酶和脂肪酶等酶類[21]；畢赤酵母屬產(chǎn)酯能力強(qiáng)，能以有機(jī)酸為原料合成酯類，對(duì)白酒出酒率、風(fēng)味和品質(zhì)都有一定的影響[25]；魏斯氏菌屬和真桿菌屬可以產(chǎn)生乳酸、丁酸、乙酸或甲酸等有機(jī)酸，其在人工窖泥樣品中的相對(duì)豐度分別為14.32%和11.89%，可能是白酒滋味品質(zhì)形成的重要來(lái)源[26-27]；而真絲菌屬是窖泥老化或者質(zhì)量較差窖泥中所含有的指示菌屬，其在人工窖泥樣品中的平均相對(duì)豐度為1.65%，如果此菌屬含量過(guò)高，會(huì)影響人工窖泥的品質(zhì)[28]。因此，在后續(xù)對(duì)人工窖泥的研究中，可以采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)收集魏斯氏菌屬、腸球菌屬、畢赤酵母屬和曲霉屬等釀酒菌屬的部分性狀優(yōu)良菌種，選擇性的應(yīng)用到人工窖泥品質(zhì)提升中。

3 結(jié)論

納入本研究的人工窖泥樣品中，微生物菌群組成較為豐富且存在一定的特異性，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)從中共注釋到13個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和6個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為Weissella、Eubacterium、Neoscardovia、Pediococcus、Bacillus、Caproicibacter、Thermoactinomyces、Corynebacterium、Planifilum、Clostridium sensu stricto、Enterococcus、Streptomyces和Ligilactobacillus，優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為Xeromyces、Aspergillus、Wallemia、Trichomonascus、Rhizopus和Pichia。優(yōu)勢(shì)菌屬間的相關(guān)性分析表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）、聯(lián)合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）等菌屬對(duì)人工窖泥品質(zhì)的調(diào)節(jié)有積極的正向協(xié)同效應(yīng)，而部分細(xì)菌屬與真菌屬之間存在一定的拮抗或競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。在后續(xù)研究中可對(duì)人工窖泥中未知物種進(jìn)行深入探究，還可以采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)釀酒功能菌屬進(jìn)行分離鑒定，依據(jù)各菌屬間的相關(guān)性適時(shí)添加合適菌株調(diào)節(jié)窖泥微生態(tài)。