高產(chǎn)酯酶細菌的篩選、鑒定及復合誘變選育

湯秀娟，吳成澤，陳 聰，葉光斌，張楷正，鄒 偉，3*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644005；2.樂山職業(yè)技術(shù)學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)學院，四川 樂山 614000；3.四川輕化工大學 四川省釀酒生物技術(shù)及應用重點實驗室，四川 宜賓 644005）

酯酶（EC 3.1.1.1）具有催化多種底物的裂解和酯鍵形成的功能，也稱酯化酶，是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶、磷酸酯酶的統(tǒng)稱[1-2]。酯酶在催化酯類物質(zhì)合成時，其催化作用會受到反應介質(zhì)、產(chǎn)物濃度等因素的影響[3]。酯酶具有廣泛的工業(yè)應用，一般被用于提升白酒質(zhì)量[4]，以及作為食品工業(yè)的催化劑，比如黃油制造、奶酪增香劑和合成風味酯[5]，同時還可以應用于化妝品、制藥和造紙等領域[6-7]。在白酒的釀造過程中，酯酶可以發(fā)揮極為強大的合成作用，促進己酸乙酯等酯類物質(zhì)的生成，增強白酒風味，提升白酒品質(zhì)。因此，篩選出產(chǎn)酯酶能力較強的功能菌株將酯酶制劑應用于白酒生產(chǎn)過程，可有效縮短發(fā)酵時間，減少用曲量，提高生產(chǎn)效率，增加己酸乙酯的含量，為酒質(zhì)的提升提供理論依據(jù)[8]。微生物酯化酶廣泛存在于多種細菌中，包括鏈球菌、葡萄球菌、新型隱球菌、乳酸菌、魏斯氏菌等，不同種屬的菌種產(chǎn)酯酶的產(chǎn)量和性質(zhì)不同[9-10]?，F(xiàn)已知的產(chǎn)酯酶微生物資源種類有限，對產(chǎn)酯酶細菌的研究較少，大多數(shù)細菌代謝產(chǎn)生的酯酶最適pH較廣，穩(wěn)定范圍一般在pH 4.0～11.0，且細菌所產(chǎn)的酯酶作用溫度較高[11]。

紫外（ultraviolet，UV）誘變是微生物育種中常用和有效的誘變方法之一[12]。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）是近年來發(fā)展出的一種新的菌種誘變育種方法[13]，利用均勻分布的活性粒子作用于微生物細胞壁或細胞膜，通過提高通透性及損傷基因影響微生物的遺傳物質(zhì)[14]。ARTP-UV復合誘變同時誘發(fā)菌體，使突變株具有更高突變率、更強的遺傳穩(wěn)定性，且操作簡單、安全，對環(huán)境無污染、危害[15]。

本實驗從大曲中篩選高產(chǎn)酯酶細菌，對其進行形態(tài)和分子生物學鑒定，利用ARTP-UV復合誘變選育出穩(wěn)定優(yōu)良的突變株，提升突變株的產(chǎn)酯酶能力，為酯酶的工業(yè)應用和脂肪酸乙酯類化合物的生成提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大曲：四川某濃香型酒廠。

1.1.2 化學試劑

三丁酸甘油酯、聚乙烯醇、制霉菌素（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基[16]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，乳化液20%，制霉菌素質(zhì)量濃度25 μg/mL，自然pH。

種子液培養(yǎng)基[17]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：葡萄糖20 g/L，牛肉膏20 g/L，氯化鈉5 g/L，K2HPO41.0g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，pH7.0。121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

IIIS常壓室溫等離子體（ARTP）誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；V-1000可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；HZ150L型恒溫培養(yǎng)搖床：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；MJ-250恒溫培養(yǎng)箱、TG-16醫(yī)用離心機：四川蜀科儀器有限公司；LS-50HJ立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；SW-CJ2D超凈工作臺：上海蘇凈實業(yè)有限公司；DHG-9023A電熱干燥箱：上海瑯殲實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的篩選

將大曲樣品均勻混合并研細后，稱取5 g樣品于45 mL生理鹽水中，置于搖床中振蕩2 h，靜置30 min，將其稀釋為10-1～10-7菌懸液，并涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，每個梯度涂布3個平行，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，同時觀察菌落周圍產(chǎn)生透明圈的情況，選取透明圈較大的菌落在篩選培養(yǎng)基上劃線分離至純種。

1.3.2 菌株的活化及培養(yǎng)

將分離出的純種菌株勾取一環(huán)于25 mL種子液培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，同上條件連續(xù)活化3次以后，吸取0.8 mL菌懸液于裝有1 mL體積分數(shù)40%甘油的甘油管中，置于-80 ℃冰箱中保存菌種，并做好斜面保藏，同時轉(zhuǎn)接5 mL種子液于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，吸取4 mL發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，將上清液保存在4 ℃條件下，備用。

1.3.3 酯酶酶活力的測定

酯酶酶活力的測定采用滴定法。取4 mL 3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液（將3%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以體積比4∶1均勻混合）與5 mL磷酸緩沖溶液（0.025 mol/L，pH7.5）于錐形瓶中混勻，將錐形瓶置于40 ℃水浴鍋中預熱5 min，加入1 mL提前制備好的粗酶液，反應15 min后取出錐形瓶，再加入15 mL 體積分數(shù)95%乙醇，滴加2～3滴酚酞指示劑，最后用0.05 mol/L的NaOH標準溶液滴定，空白組加入等量滅菌后的無菌水[19]。酯酶酶活計算公式如下：

式中：V1為消耗的NaOH溶液體積，mL；V2為空白對照體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；t為反應時間，min。

酯酶酶活力的定義：40 ℃、酯酶每15 min水解4 mL3%三丁酸甘油酯乳化液所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.3.4 菌種鑒定

篩選出產(chǎn)酯酶酶活力最高的菌株進行形態(tài)學觀察，觀察菌落的大小，顏色、表面形態(tài)、邊緣形狀、質(zhì)地等并記錄。同時挑取平板培養(yǎng)的單菌落，通過革蘭氏染色法在光學顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

對目的菌株進行分子生物學鑒定，將目的菌株在篩選培養(yǎng)基上劃線至培養(yǎng)出單菌落，培養(yǎng)3 d后送至派森諾有限公司進行菌種鑒定。采用16S rDNA測序，主要步驟如下：采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）對目的菌株的16S rDNA基因序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增體系：基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）1 μL，10×Buffer 5.0 μL，Taq聚合酶1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.0 μL，引物1.5 μL，去離子水39 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸7 min，循環(huán)35次。取目的菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測序儀ABI3730-XL進行DNA 測序。將拼接結(jié)果提交至美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對搜索，選擇同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列使用MEGA11.0軟件，選擇鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.5 菌懸液的制備

在進行ARTP-UV復合誘變時，需要制備菌株對數(shù)期的菌懸液。從保藏的斜面上挑取目的菌株并接種至種子液培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)期后，吸取5 mL菌液于無菌離心管中，5 000 r/min離心10 min，無菌操作下吸取上清液并廢棄，加入4 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS），振蕩均勻后，同上條件離心，廢棄上清液，反復操作3次后，最后用PBS重懸菌體，控制菌懸液OD600nm值為0.6～1.0。

1.3.6 ARTP-UV復合誘變

移取10 μL菌懸液于金屬載片表面，用專用鑷子將菌液載片轉(zhuǎn)移至載物臺，設定ARTP參數(shù)，射頻功率130 W，工作氣流為10L/min，等離子體發(fā)射源與載物臺距離為2mm，操作溫度為室溫（20～30 ℃），處理時間為0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130 s。將誘變完成的載片轉(zhuǎn)移至裝有1 mL無菌PBS的EP管中，振蕩均勻后，稀釋至10-1～10-3的菌懸液，再各吸取100 μL均勻涂布于平板篩選培養(yǎng)基中，每個梯度做3個平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)，計算致死率。選擇致死率在90%以上的時間對菌懸液按照上述方法對目的菌株進行ARTP誘變，將涂布后的平板在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測量其透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），選擇D/d值較大的菌落進行UV誘變。

多種誘變方式復合使用，誘變位點增多，獲得高產(chǎn)菌株的幾率增多[23]。所以，將酶活較高的ARTP突變株按照上述步驟中的操作制成菌懸液，吸取5 mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，距離UV誘變燈50 cm左右進行紫外照射，照射時間分別為0、20 s、40 s、60 s、80 s、100s、120s、150s、180s、200s。照射完成后，避光穩(wěn)定10min，再從培養(yǎng)皿中吸取1 mL誘變后的菌液，進行梯度稀釋至10-1～10-3的菌懸液，再移取100 μL涂布在篩選培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，計數(shù)菌落數(shù)并計算致死率。選擇致死率在90%以上的照射時間對菌懸液按照上述方法進行UV誘變，將誘變后的菌懸液涂布在篩選培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測量其透明圈直徑[17，21]。致死率計算公式如下[20]：

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 13.0、IBM SPSS Statistics 27.0、MEGA 11、Origin 2021對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

菌株的酯酶酶活力可以通過透明圈菌落直徑比（D/d）的大小來反應[22]。通過D/d值大小比較，得到10株D/d值較大的菌株，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株S3-51的D/d值最大，為2.15±0.02，對篩選出的10株產(chǎn)酯酶菌的酶活力進行測定，結(jié)果表明，菌株S3-51酶活力最高，為（13.73±0.04）U/mL，其他菌株酶活力為（10.75±0.03）～（12.55±0.02）U/mL。以菌株S3-51作為出發(fā)菌株，對其進行形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定、ARTP-UV復合誘變試驗及遺傳穩(wěn)定性試驗。

表1 產(chǎn)酯化酶菌株透明圈直徑與菌落直徑之比Table 1 Transparent circle diameter and colony diameter ratio of esterifying enzyme-producing strains

2.2 菌株形態(tài)學觀察及菌株分子生物學鑒定

菌株S3-51經(jīng)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后，其菌落、細胞形態(tài)見圖1。由圖1a可知，菌株S3-51產(chǎn)透明圈，菌落為淡黃色，較小，表面光滑，低凸起，菌落規(guī)則，有光澤，質(zhì)地黏稠，易挑取，菌落周圍與邊緣顏色一致，不透明。由圖1b可知，經(jīng)革蘭氏染色后，為紅色，是革蘭氏陰性菌，在100倍油鏡下觀察，呈短桿狀，無芽孢。

圖1 菌株S3-51菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain S3-51

提取菌株S3-51的DNA進行PCR擴增，擴增得到的電泳圖無拖尾、分子質(zhì)量大小為2 000 bp。上機測序，測得的基因序列在NCBI當中進行比對，將同源性較高的序列下載后利用MEGA 11.0進行分析，采用NJ法系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株S3-51的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，菌株S3-51與Sphingomonas paucimobilis聚于同一支，最大序列相似度為100%。因此，菌株S3-51被鑒定為少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）。SMALLEY D L[23]證實了少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）具有酯酶（C4）、酯酶脂肪酶（C8）、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性。此前有學者在活性污泥中分離出的鞘氨醇單胞菌具有多種降解基因和高活性酶、優(yōu)質(zhì)的流變特性和多功能性，廣泛應用于食品和日用品行業(yè)[24-27]。黃丹等[28]從濃香型大曲中分離得到一株血紅鞘氨醇單胞菌，初篩酯酶酶活為15.35 U/mL。本次篩選得到的S.paucimobilisS3-51酯酶酶活為（13.73±0.04）U/mL。

圖2 菌株S3-51基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain S3-51 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 ARTP-UV復合誘變及選育

2.3.1 ARTP-UV復合誘變致死率與時間的關系

對菌株S3-51進行ARTP-UV復合誘變，測定不同誘變時間下菌株的致死率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著ARTP和UV誘變時間的增加，菌株致死率增加，在ARTP誘變時間為90～120 s時，菌株的致死率在90%以上，ARTP誘變時間為130 s時，致死率為100%。為了達到較理想的誘變效果，此后在進行ARTP誘變時，選擇菌株致死率在90%左右時作為后續(xù)誘變的處理時間[32]。因此，ARTP誘變時間選擇90～120s。在進行UV誘變時，當誘變時間增加到150～180s，菌株的致死率在92%～96%，誘變時間為200 s時，致死率為100%。因此，在進行UV誘變時，誘變時間選擇150～180 s。

圖3 不同ARTP和UV誘變處理時間下菌株S3-51的致死率Fig.3 Lethal rates of strain S3-51 under different ARTP and UV mutation time

2.3.2 ARTP-UV復合迭代誘變選育

對出發(fā)菌株S3-51進行ARTP誘變，誘變完成后，在篩選培養(yǎng)基平板上選擇D/d值較大的菌落進行活化并測定酶活。制備酶活力較高突變株的菌懸液，然后對其進行UV誘變，用篩選培養(yǎng)基平板進行初步篩選并對D/d值較大的突變株液態(tài)發(fā)酵測定酯酶酶活力。選擇酶活力較高的突變株進行保存，完成ARTP-UV復合第一輪誘變。重復上述操作，對突變株進行第二輪及第三輪ARTP-UV復合誘變，最后選擇酶活最高的突變株進行遺傳穩(wěn)定性測試。對同一菌株進行傳代培養(yǎng)過程中，若連續(xù)培養(yǎng)三代的產(chǎn)物產(chǎn)量無顯著性差異，即認為突變株具有較好的穩(wěn)定性[33]。

ARTP-UV復合迭代誘變突變株酯酶酶活力測定結(jié)果見圖4。

圖4 ARTP-UV復合迭代誘變突變株酯酶酶活力Fig.4 Esterase activities of mutant strains by ARTP-UV composite iterative mutation

進行ARTP第一輪誘變后，對D/d值較大的菌株進行劃線分離，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵2 d后測定其酶活力，如圖4a所示，突變株均出現(xiàn)了正向突變，將突變株活化后制成菌懸液，其中菌株AR1-18酶活力最高，為（16.58±0.02）U/mL，其他突變株酶活力為（15.05±0.04）～（16.53±0.02）U/mL。對突變株AR1-18進行UV誘變，共計篩選了31株透明圈較大的突變株并測定其酶活，如圖4b所示，相對于原始菌株，均出現(xiàn)了正向突變，突變株ARUV1-27酶活力最高，為（17.32±0.02）U/mL，其余突變株酶活力為（15.97±0.03）～（17.29±0.03）U/mL。

將ARTP-UV復合第一輪誘變后酶活力最高的突變株ARUV1-27制成菌懸液，進行第二輪ARTP-UV復合誘變，如圖4c、圖4d所示，部分突變株開始出現(xiàn)負向突變。在ARTP第二輪誘變后，酶活力最高的是菌株AR2-13，酶活力為（17.53±0.03）U/mL，其次是菌株AR2-2，酶活力為（17.52±0.04）U/mL，其余突變株酶活力為（15.07±0.03）～（17.49±0.01）U/mL。隨后進行UV第二輪誘變，其中突變株ARUV2-21酶活力最高，為（18.07±0.03）U/mL，其余突變株酶活力為（14.57±0.03）～（18.06±0.03）U/mL，為了保證菌株產(chǎn)酶能力的穩(wěn)定性，對第二輪復合誘變酶活力最高的ARUV2-21進行第三輪ARTP-UV復合誘變。

在進行ARTP-UV復合第三輪誘變以后，如圖4e和圖4f所示，部分突變株的產(chǎn)酯化酶酶活力在不斷上升，說明隨著ARTP-UV復合誘變次數(shù)的增加，菌株產(chǎn)酯化酶能力具有一定的累加效應，有部分突變株產(chǎn)酯化酶能力趨于穩(wěn)定，但也有部分突變株產(chǎn)酯化酶能力依然出現(xiàn)負向突變。第三輪ARTP-UV復合誘變的突變株中，ARUV3-2酶活力達到（19.41±0.02）U/mL，相比于初篩提高了41.37%，其余突變株酶活力為（13.21±0.02）～（18.78±0.03）U/mL。因此，得到高產(chǎn)酯化酶突變菌株ARUV3-2。

2.3.3 遺傳穩(wěn)定性試驗

ARTP-UV復合誘變選育出的突變株在傳代過程中會出現(xiàn)負向突變，使得篩選出來的高產(chǎn)酯化酶的突變株在傳代過程中產(chǎn)酶性能下降。對產(chǎn)酯酶酶活力最高的突變株ARUV3-2進行遺傳穩(wěn)定性測試，連續(xù)傳代培養(yǎng)15代并測定其產(chǎn)酯酶酶活力，比較不同傳代次數(shù)突變株產(chǎn)酯酶酶活力的高低，以確定其遺傳是否穩(wěn)定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，突變株ARUV3-2在經(jīng)過第一次傳代以后，酯化酶酶活力由（19.21±0.18）U/mL下降至（18.01±0.30）U/mL。再經(jīng)過14次傳代，突變株ARUV3-2所產(chǎn)酯化酶酶活力穩(wěn)定在（17.42±0.32）～（17.84±0.28）U/mL，相比于原始菌株S.spaucimobilisS3-51初篩酶活（13.73±0.04）U/mL，突變株ARUV3-2酶活提升了26.88%～29.93%。由此可見，本次選育出的突變株ARUV3-2的遺傳穩(wěn)定性良好。高榮等[30]以高產(chǎn)褐藻膠裂解酶海藻類芽孢桿菌（Paenibacillus algicola）HB172198T作為原始菌株，利用ARTP誘變技術(shù)選育獲得2株褐藻膠裂解酶活力明顯提高的突變株（編號分別為30-19、80-6），其酶活力分別比原始菌株提高了32.6%和21.6%，且連續(xù)6次傳代培養(yǎng)誘變菌株的產(chǎn)酶遺傳性狀穩(wěn)定。

圖5 突變株ARUV3-2遺傳穩(wěn)定性測試結(jié)果Fig.5 Determination results of genetic stability of mutant strain ARUV3-2

3 結(jié)論

從大曲樣品中篩選得到一株高產(chǎn)酯酶細菌，鑒定為少見鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis），初篩酶活為（13.73±0.04）U/mL，對其進行ARTP-UV復合誘變選育，篩選出一株產(chǎn)酯酶酶活力為（17.42±0.32）U/mL的突變株ARUV3-2，與初篩原始菌株產(chǎn)酯酶酶活力比較，酶活力提高了26.88%，產(chǎn)酯化酶性能優(yōu)良且穩(wěn)定。該研究豐富了優(yōu)質(zhì)菌種來源，為白酒質(zhì)量和產(chǎn)量提升的研究提供參考。