殷 嫻,曹 爽,郭慧敏,王家棟,廖永紅*
(1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100048;2.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)
中醫(yī)藥寶庫中有著大量可以藥食兩用的中藥,不但可以作為食品長期服用,而且具有一定的臨床效果。中藥發(fā)酵是利用微生物的降解和催化作用改變藥物的原有性質(zhì)并增強(qiáng)或創(chuàng)造新的功效[1-2]。比如人參經(jīng)過發(fā)酵后總皂苷的含量增加了40%,其中人參皂苷Rb1或Rb2隨著發(fā)酵逐漸轉(zhuǎn)化為稀有的人參皂苷Rg3[3]。中藥經(jīng)發(fā)酵后通過微生物的分解轉(zhuǎn)化,可降低藥物毒性,將毒性成分進(jìn)行分解或結(jié)構(gòu)上的修飾使其毒性降低或者消失[4]。潘揚(yáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后馬錢子堿的成分在質(zhì)量和數(shù)量上都發(fā)生了明顯的變化??鄥⒃诮?jīng)過靈芝菌絲體發(fā)酵進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后,其毒性明顯降低,且發(fā)酵液的抗乙型肝炎病毒的效果顯著[6]。
六神曲是中國藥典中記載最早的傳統(tǒng)發(fā)酵藥物之一,被廣泛用作消化劑,治療因飲食不良引起的低胃酸性消化不良、胃腸炎、嘔吐和腹瀉[7]。六神曲由赤小豆、苦杏仁、青蒿、蒼耳草、辣蓼和面粉按一定比例混勻后自然發(fā)酵而成。在微生物群落演替和代謝過程中,微生物分泌各種水解酶[8],通過酶促分解作用,催化發(fā)酵基質(zhì)合成生物活性成分,形成易于腸道吸收的小分子糖苷、脂肪酸、小肽等功能物質(zhì)[9-10],達(dá)到健胃消食的作用[11]。因此解析六神曲的微生物結(jié)構(gòu)并預(yù)測微生物群落的代謝功能對(duì)揭示六神曲的功效具有重要的意義。
傳統(tǒng)的六神曲炮制在原料上可分別使用鮮藥材和干藥材,制備流程存在一定差別。使用鮮藥材制備只進(jìn)行一步發(fā)酵:赤小豆和苦杏仁粉碎成粗粉,與面粉混勻后,將鮮青蒿、鮮辣蓼和鮮蒼耳秧的煎液加入其中,攪拌均勻,得到柔軟的松散固體,將其揉搓成塊狀進(jìn)行自然發(fā)酵。使用干藥材需要兩步發(fā)酵,取赤小豆加工成粗粉,加4倍左右的熱水(60~80 ℃)攪拌均勻,自然環(huán)境中敞開發(fā)酵3 d成赤小豆粥;另取苦杏仁、干青蒿、干辣蓼和干蒼耳秧分別粉碎成粉,加面粉后與赤小豆粥混勻,制成握之成團(tuán)、擲之即散的軟材,置適宜容器內(nèi)再進(jìn)行六神曲發(fā)酵。使用新鮮藥材需要煎湯,且受季節(jié)限制,而使用干藥材不受季節(jié)約束,更符合現(xiàn)代生產(chǎn)要求,本試驗(yàn)中采用干藥材的炮制工藝進(jìn)行發(fā)酵。
六神曲發(fā)酵是自然條件下多菌種混合發(fā)酵[12],在炮制過程中其原料主要依靠微生物對(duì)其進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化,因此探究六神曲中存在的微生物菌群尤為重要。賈丹丹[13]在鮮藥材制備的六神曲中,分離純化到兼具淀粉酶和蛋白酶合成能力的菌種,包括枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型枯草芽孢桿菌等;且多數(shù)菌株的菌數(shù)在炮制過程中呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。鄔吉野等[14]從六神曲中分離得到12株霉菌,并利用優(yōu)勢菌株進(jìn)行純菌發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)黃曲霉顯著提高了神曲淀粉酶和蛋白酶活性,雜色曲霉顯著提高了蛋白酶產(chǎn)生的酶活力,提高了六神曲質(zhì)量。目前干藥材制備六神曲采用兩步發(fā)酵的微生物菌群結(jié)構(gòu)尚有待研究,且中藥原料對(duì)六神曲發(fā)酵的影響尚不明確。
本研究利用基于擴(kuò)增子的高通量測序技術(shù),對(duì)干藥材六神曲兩步發(fā)酵過程的微生物多樣性進(jìn)行分析,明確其微生物的區(qū)系構(gòu)成,并通過PICRUSt菌群代謝預(yù)測的工具推測六神曲發(fā)酵期間代謝功能的差異,為六神曲功效的作用機(jī)理提供理論參考;同時(shí)對(duì)發(fā)酵原料分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁的六神曲進(jìn)行微生物多樣性研究,探究單一中藥原料對(duì)六神曲發(fā)酵的影響。旨在為六神曲功效揭示提供科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 材料赤小豆、干青蒿、干辣蓼、干蒼耳秧、苦杏仁:河北省安國市廣盛商貿(mào)有限公司。
1.1.2 試劑
Fast 脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)Spin Kit for Soil:美國MP Biomedicals公司;瓊脂糖:法國Biowest公司;TransStart Fast Pfu DNA聚合酶(250 U):北京全式金生物技術(shù)有限公司。
FW-100粉碎機(jī):北京中興偉業(yè)儀器有限公司;PHS-3D pH計(jì):上海精科實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;ABI GeneAmpR9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀:紹興微泰生物科技有限公司;Nanodrop-2000分光光度計(jì):美國Thermo Fisher Scientific公司;安捷倫2100生物分析儀:美國Agilent公司;Illumina MiSeq測序儀:美國Illumina公司。
1.3.1 六神曲兩步法發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)
赤小豆粥發(fā)酵:將赤小豆粉碎成粉,加入4倍左右的60~80 ℃熱水,攪拌成粥狀,在32 ℃水浴中敞開培養(yǎng)3 d,發(fā)酵得赤小豆粥。
固態(tài)發(fā)酵:取苦杏仁、干青蒿、干辣蓼和干蒼耳秧分別粉碎成粗粉,按一定比例與面粉混合。加入上述發(fā)酵赤小豆粥,混勻并制成握之成團(tuán)、擲之即散的軟材,放入盤中,置于發(fā)酵箱32 ℃和85%濕度環(huán)境中培養(yǎng)3 d,即得六神曲。
1.3.2 樣本采集
赤小豆粥發(fā)酵時(shí),在發(fā)酵0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)取樣于無菌離心管中,編號(hào)分別為c0、c1、c2和c3。固態(tài)發(fā)酵時(shí),在發(fā)酵0 h、48 h和72 h時(shí)取樣,編號(hào)分別為b0、b2和b3。在原料缺失實(shí)驗(yàn)時(shí),分別缺少干青蒿、干辣蓼、干蒼耳秧和苦杏仁中的一種藥材,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,在發(fā)酵72 h時(shí)取樣,編號(hào)分別為B、C、D和E。所有樣本均凍存于-80 ℃。三批發(fā)酵,每批發(fā)酵多點(diǎn)取樣并混勻,為實(shí)驗(yàn)樣本。
1.3.3 DNA提取
利用試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil提取微生物基因組DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量,并使用Nanodrop-2000分光光度計(jì)測定DNA純度和濃度。
1.3.4 擴(kuò)增子測序
使用通用引物338F和806R擴(kuò)增原核微生物16S rRNA基因V3~V4區(qū),用通用引物ITS1F和ITS2R擴(kuò)增真菌ITS區(qū)。通用原核引物338F和806R的PCR擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min,27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在10 ℃進(jìn)行保存。通用真菌引物ITS1F和ITS2R的PCR擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min,35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在10 ℃進(jìn)行保存。PCR擴(kuò)增體系為:緩沖液4 μL,2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates,dNTPs)2 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,超純水補(bǔ)足至20 μL。純化PCR產(chǎn)物,并通過安捷倫2100生物分析儀和Quantu Fluorometer評(píng)估最終產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量。使用NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫。
由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina MiSeq測序平臺(tái)進(jìn)行雙端測序(GenBank登錄號(hào)PRJNA860715)。
1.3.5 高通量測序數(shù)據(jù)分析
使用Fastp軟件[15]對(duì)原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控,再通過FLASH[16]組裝過濾后的序列;區(qū)分樣本后使用UPARSE軟件[17]進(jìn)行序列分析,以97%[17-18]的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類并剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目(ribosomal database project,RDP)分類器[19]進(jìn)行注釋(KEGG數(shù)據(jù)庫v94.2版本)。對(duì)OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析[20];基于分類學(xué)信息,在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。
環(huán)境是影響微生物存活的重要因素,分析制備過程pH變化,結(jié)果見圖1。由圖1可知,赤小豆粥發(fā)酵階段第1天pH出現(xiàn)明顯下降,從6.64下降至4.68,隨后保持在4.1左右。在赤小豆粥發(fā)酵第3天,與適當(dāng)比例的苦杏仁、干青蒿、干辣蓼、干蒼耳秧和面粉混合,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,繼續(xù)發(fā)酵3 d,pH從5.45逐漸下降至3.65。由此可知,發(fā)酵兩階段pH均下降至酸性,且范圍相近。
圖1 六神曲發(fā)酵過程pH值變化Fig.1 Changes of pH value during LiuShenqu fermentation
由表1可知,按1.3.2獲得六神曲發(fā)酵過程的7個(gè)樣本,進(jìn)行測序,共得到462 819條序列,樣本的覆蓋率指數(shù)均達(dá)到96%以上,樣本測序深度滿足反映六神曲發(fā)酵微生物全部信息的要求。以Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估的細(xì)菌群落的α-多樣性變化,赤小豆粥樣本的細(xì)菌多樣性在發(fā)酵24 h后出現(xiàn)明顯下降,固態(tài)發(fā)酵樣本的細(xì)菌多樣性在發(fā)酵48 h后出現(xiàn)明顯的下降。六神曲樣本細(xì)菌群落α-多樣性的變化可能與發(fā)酵環(huán)境有關(guān),微生物群落的多樣性受酸度增加的影響,不耐酸的微生物隨發(fā)酵環(huán)境酸度的提升而死亡[21],發(fā)酵過程中,優(yōu)勢菌群的生長也會(huì)降低赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵樣本的細(xì)菌微生物多樣性。
表1 赤小豆粥發(fā)酵及六神曲固態(tài)發(fā)酵過程的細(xì)菌Alpha多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis of bacteria during red bean porridge fermentation and solid-state fermentation of LiuShenqu
對(duì)赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,共檢測到38個(gè)門,其中11個(gè)門的相對(duì)豐度>1%;共鑒定出836個(gè)屬,其中38個(gè)屬的相對(duì)豐度>1%。
由圖2可知,在赤小豆粥發(fā)酵和六神曲固態(tài)發(fā)酵起始時(shí),細(xì)菌的優(yōu)勢菌門基本一致,菌群的門水平相對(duì)豐度存在差別,豐度最高的5類細(xì)菌均依次為放線菌門(Actinobacteriota)(31.03%~34.81%)、變形菌門(Proteobacteria)(25.31%~25.87%)、酸桿菌門(Acidobacteriota)(10.82%~13.74%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(8.54%~11.00%)和厚壁菌門(Firmicutes)(2.52%~5.93%),這5個(gè)門的相對(duì)豐度占總豐度的84.68%~84.92%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度明顯降低,厚壁菌門相對(duì)豐度均顯著增加。在赤小豆粥發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的第3天,厚壁菌門分別占總豐度的97.57%和99.53%。說明六神曲發(fā)酵過程中存在明顯的細(xì)菌演替過程。
圖2 基于門水平赤小豆粥(A)及六神曲固態(tài)發(fā)酵(B)過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure during red bean porridge (A)and Liushenqu solid-state fermentation (B) based on phylum level
在屬水平上,對(duì)六神曲發(fā)酵樣本的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,揭示其組成差異。選取相對(duì)豐度>10%的屬為優(yōu)勢菌群,篩選得到5個(gè)屬,分別是魏斯氏菌屬(Weissella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)以及片球菌屬(Pediococcus)。由7個(gè)樣本的細(xì)菌菌群熱圖(圖3)可見,發(fā)酵后的赤小豆粥以腸球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬為主要菌屬,占總豐度的76.03%。鑒于赤小豆粥發(fā)酵時(shí),體系迅速變酸(圖1),耐酸的乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢菌屬。將發(fā)酵后的赤小豆粥和藥材混合后進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,則僅乳桿菌屬和片球菌屬成為固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢菌,總豐度占比達(dá)98.67%,尤其是乳桿菌屬,占總豐度的85.01%,說明赤小豆粥發(fā)酵的優(yōu)勢菌群,在固態(tài)發(fā)酵時(shí),僅乳桿菌屬和片球菌屬的生長優(yōu)勢更明顯。魏斯氏菌屬在赤小豆粥發(fā)酵24 h時(shí)相對(duì)豐度增加,72 h時(shí)相對(duì)豐度亦維持在較高水平,但在固態(tài)發(fā)酵過程中則直至72 h相對(duì)豐度才略上升,且相對(duì)豐度水平不高,因此魏斯氏菌屬雖然在赤小豆粥發(fā)酵時(shí)具有一定的生長優(yōu)勢,但也不是固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢菌。同處發(fā)酵后期的赤小豆粥樣本(48h和72h)和固態(tài)發(fā)酵樣本(72 h)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)較相似,說明赤小豆粥發(fā)酵起到富集優(yōu)勢細(xì)菌的作用,為后續(xù)固態(tài)發(fā)酵提供優(yōu)勢細(xì)菌。XU Y等[9]對(duì)六神曲一步發(fā)酵的微生物多樣性采用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)進(jìn)行分析,擴(kuò)增到的14個(gè)條帶中包含乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)形成的條帶,與本研究結(jié)論相似。腸球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和片球菌屬均為益生菌菌株屬[22-23]。乳酸桿菌是有助于消食的益生菌,常在乳制品工業(yè)中用于制造發(fā)酵產(chǎn)品[24],其在防止乳制品中由于酸化而導(dǎo)致的腐敗菌生長方面起到重要的作用[22],可維持腸道微生態(tài)平衡,促進(jìn)消化,合成氨基酸和維生素,降低膽固醇,抑制內(nèi)毒素的合成[25]。同時(shí),乳酸桿菌屬是兼性厭氧菌,廣泛存在于白酒釀造過程,可將谷物中的淀粉通過自身代謝系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為乳酸[26-28],這可能會(huì)促使六神曲樣本在發(fā)酵期間的酸度增加。片球菌屬具有抗微生物和益生菌的特性,以產(chǎn)生細(xì)胞素的形式到達(dá)結(jié)腸,并可能發(fā)揮其潛在的有益作用[22,29]。
按1.3.2獲得六神曲發(fā)酵過程的7個(gè)樣本,進(jìn)行真菌核酸測序,共產(chǎn)出1 137 675條序列,樣本的覆蓋率指數(shù)均達(dá)到99%以上(表2),測序深度滿足反映六神曲發(fā)酵微生物全部信息的要求。使用Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估真菌微生物多樣性,赤小豆粥樣本的真菌多樣性在發(fā)酵24 h后出現(xiàn)明顯下降,固態(tài)發(fā)酵樣本的真菌多樣性在發(fā)酵48 h后出現(xiàn)明顯的下降。發(fā)酵過程中,優(yōu)勢菌群的生長降低了赤小豆粥和六神曲樣本的真菌微生物多樣性。
表2 赤小豆粥發(fā)酵及六神曲固態(tài)發(fā)酵過程的真菌Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of fungi during red bean porridge fermentation and solid-state fermentation of LiuShenqu
對(duì)赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵時(shí)的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,共檢測到15個(gè)門,其中5個(gè)門的相對(duì)豐度超過1%;共鑒定出573個(gè)屬,其中39個(gè)屬的相對(duì)豐度超過1%。
由圖4可見,在相同發(fā)酵時(shí)期,赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵樣本中真菌的優(yōu)勢菌門基本一致,但各菌群的相對(duì)豐度差異很大。其中,赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵在發(fā)酵起始時(shí),子囊菌門(Ascomycota)(68.89%~74.55%)、孢霉菌門(Mortierellomycota)(10.55%~18.84%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)(9.87%~13.51%)相對(duì)豐度較高。赤小豆粥發(fā)酵第三天,擔(dān)子菌門和子囊菌門的相對(duì)豐度接近,分別為50.57%和49.04%;而固態(tài)發(fā)酵末期的六神曲樣本中擔(dān)子菌門占優(yōu)勢,豐度達(dá)73.23%,子囊菌門的豐度次之,為26.52%。
圖4 基于門水平赤小豆粥(A)及六神曲固態(tài)發(fā)酵(B)過程中真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungal community structure during red bean porridge (A) and Liushenqusolid-state fermentation (B) based on phylum level
選取相對(duì)豐度>10%的屬為優(yōu)勢菌群,篩選得到6個(gè)真菌屬,分別為毛孢子菌屬(Trichosporon)、Diutina、被孢霉屬(Mortierella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、赤霉菌屬(Gibberella)以及鐮刀菌屬(Fusarium)。六神曲發(fā)酵過程中7個(gè)樣本的真菌群落結(jié)構(gòu)見圖5,發(fā)酵初期的赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵樣本均以赤霉菌屬、被孢霉屬、毛殼菌屬和鐮刀菌屬為主,占總豐度的31.24%~46.67%;發(fā)酵末期的赤小豆粥以毛孢子菌屬(50.33%)和Diutina(39.40%)為主;六神曲固態(tài)發(fā)酵第3天結(jié)束時(shí)樣本以毛孢子菌屬為主,占總豐度的67.27%。赤小豆粥樣本(48 h和72 h)和六神曲樣本(72 h)真菌菌群結(jié)構(gòu)相似,說明赤小豆粥富集發(fā)酵的真菌可為固態(tài)發(fā)酵提供優(yōu)勢菌種。
圖5 基于屬水平六神曲發(fā)酵過程中真菌的熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of fungi during LiuShenqu fermentation based on genus level
利用PICRUSt2軟件將測序獲得的基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測。六神曲發(fā)酵各階段的菌群菌落豐度集中于代謝(圖6),其中代謝途徑(Metabolic pathways)、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、不同環(huán)境中的微生物代謝(Microbial metabolism in diverse environments)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)和碳代謝(Carbon metabolism)的豐度最高。推測六神曲在發(fā)酵期間的菌群結(jié)構(gòu)受代謝影響較為顯著,產(chǎn)生各種酶類,促進(jìn)六神曲功效的產(chǎn)生。
圖6 六神曲發(fā)酵過程中菌群群落代謝功能第三級(jí)分布結(jié)果Fig.6 The third order distribution results of microbial community metabolic function during LiuShenqu fermentation
進(jìn)一步利用KEGG Enzyme注釋,進(jìn)行更詳細(xì)的基因功能信息分析。對(duì)六神曲發(fā)酵過程中總豐度排名前50的酶進(jìn)行分析,并繪制熱圖,結(jié)果見圖7。由圖7可知,7個(gè)樣本在Enzyme水平存在顯著差異。細(xì)菌群落功能預(yù)測結(jié)果如圖7a所示,發(fā)酵期間的依賴于DNA的DNA聚合酶(EC 2.7.7.7)和DNA解旋酶(EC 3.6.4.12)豐度較高,說明菌群的DNA復(fù)制活躍。發(fā)酵后期,6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)基因豐度顯著增加,有利于降解纖維二糖。此外,糖酵解通路中的磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.12)、蛋白質(zhì)-N(pi)-磷酸組氨酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.7.1.69)、23S rRNA假尿苷合成酶(EC 5.4.99.23)和蛋白酪氨酸磷酸酶(EC 3.1.3.48)基因豐度明顯升高,蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶被證實(shí)為腫瘤抑制基因的產(chǎn)物,具有抑制腫瘤發(fā)生的作用[30]。真菌群落功能預(yù)測結(jié)果如圖7b所示,發(fā)酵后六神曲中葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)基因豐度明顯上升,說明六神曲具有淀粉酶和糖化酶活力,可產(chǎn)生助消化功效,該酶主要依賴于真菌合成。
圖7 六神曲發(fā)酵過程中細(xì)菌(a)、真菌(b)PICRUSt基因功能預(yù)測熱圖Fig.7 Heatmap of bacterial (a) and fungal (b) gene function prediction by PICRUSt during LiuShenqu fermentation
對(duì)分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁藥材之一的原料,按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,在發(fā)酵72 h時(shí)取樣,編號(hào)分別為B、C、D和E,4個(gè)樣本測序細(xì)菌共獲得350 616條序列,真菌共獲得363 264條序列,樣本覆蓋率指數(shù)均達(dá)到99%以上,樣本測序深度滿足反映微生物全部信息的要求。由表3和表4可知,缺少四種藥材的任何一種,細(xì)菌的多樣性降低,而真菌的多樣性增加。
表3 藥材缺失條件下六神曲固態(tài)發(fā)酵的細(xì)菌Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of bacteria in LiuShenqu with medicinal materials deficiency during solid-state fermentation
表4 藥材缺失條件下六神曲固態(tài)發(fā)酵的真菌Alpha多樣性分析Table 4 Alpha diversity analysis of fungi in LiuShenqu with medicinal materials deficiency during solid-state fermentation
對(duì)b3、B、C、D、E五個(gè)樣本進(jìn)行OTU水平的Venn圖分析,直觀的展現(xiàn)不同樣本中物種(OTU)組成相似性及重疊情況,結(jié)果見圖8。由圖8a知,5個(gè)樣本細(xì)菌共有的OTU有25個(gè),b3樣本獨(dú)有的OTU有53個(gè);由圖8b知,5個(gè)樣本真菌共有的OTU有150個(gè),b3樣本獨(dú)有的OTU有109個(gè)。而B、C、D和E樣本的細(xì)菌和真菌的總OTU數(shù)目均低于b3,原料缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁中的任何一種藥材,均會(huì)對(duì)六神曲的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。
圖8 操作分類單元水平細(xì)菌(a)、真菌(b)的Venn圖Fig.8 Venn diagram of bacteria (a) and fungi (b) based onoperational taxonomic unit level
對(duì)b3、B、C、D、E五個(gè)樣本進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析,細(xì)菌共檢測到6個(gè)門,其中3個(gè)門的相對(duì)豐度超過1%;真菌共檢測到6個(gè)門,其中3個(gè)門的相對(duì)豐度超過1%。由圖9a可知,發(fā)酵原料缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁使發(fā)酵后的厚壁菌門(Firmicutes)的豐度明顯降低,其中發(fā)酵原料缺少辣蓼的固態(tài)發(fā)酵后厚壁菌門降低最多,說明辣蓼對(duì)發(fā)酵細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響最大。由圖9b可知,各六神曲固態(tài)發(fā)酵樣品在發(fā)酵后期均以子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為優(yōu)勢菌門,但子囊菌門的豐度比擔(dān)子菌門高,四種原料均可能對(duì)子囊菌門的生長存在抑制作用,并對(duì)擔(dān)子菌門的生長存在促進(jìn)作用,其中蒼耳秧對(duì)兩種真菌門的生長影響最大。
圖9 藥材缺失條件下六神曲基于門水平細(xì)菌(a)、真菌(b)的菌群結(jié)構(gòu)Fig.9 Microflora structure of bacteria (a) and fungi (b) of LiuShenqu with medicinal materials deficiency based on phylum level
進(jìn)一步對(duì)屬水平進(jìn)行分析,由圖10a和10b可知,發(fā)酵原料缺少四種藥材任意一種,優(yōu)勢細(xì)菌均由乳桿菌屬(Lactobacillus)轉(zhuǎn)變?yōu)槠蚓鷮伲≒ediococcus),而優(yōu)勢真菌毛孢子菌屬(Trichosporon)的相對(duì)豐度也明顯降低,不再成為優(yōu)勢菌。
圖10 藥材缺失條件下六神曲基于屬水平細(xì)菌(a)、真菌(b)的菌群結(jié)構(gòu)Fig.10 Microflora structure of bacteria (a) and fungi (b) of LiuShenqu with medicinal materials deficiency based on genus level
將b3、B、C、D、E五個(gè)樣本的細(xì)菌和真菌基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中利用PICRUSt2軟件進(jìn)行菌群功能預(yù)測。對(duì)總豐度排名前50的酶進(jìn)行分析,結(jié)果見圖11。由圖11a可知,細(xì)菌群落功能預(yù)測顯示5種樣本均以DNA解旋酶(EC 3.6.4.12)、脫氧核糖核酸指導(dǎo)的脫氧核糖核酸聚合酶(EC 2.7.7.7)、蛋白質(zhì)-N(pi)-磷酸組氨酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.7.1.69)為主,其中發(fā)酵原料缺少某一種藥材的樣本發(fā)酵后的EC 3.6.4.12、EC 2.7.7.7的基因豐度降低。由圖11b可知,b3樣本中三磷酸腺苷酶(EC 3.6.1.3)和葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)的豐度高于其他4種藥材單一缺失樣本,說明青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁四種藥材均對(duì)提升六神曲中淀粉酶和糖化酶豐度具有促進(jìn)作用,有助于六神曲功效的發(fā)揮。
圖11 藥材缺失條件下六神曲細(xì)菌(a)、真菌(b)PICRUSt基因功能預(yù)測熱圖Fig.11 Heat map of PICRUSt gene function prediction of bacteria (a)and fungi (b) in LiuShenqu with medicinal materials deficiency
將b3、B、C、D、E五個(gè)樣本的細(xì)菌基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中利用PICRUSt2軟件對(duì)菌群代謝途徑進(jìn)行功能預(yù)測。對(duì)總豐度排名前50的代謝途徑(Pathway level3)進(jìn)行分析。
由圖12可知,細(xì)菌群落功能預(yù)測顯示,5種發(fā)酵樣本均以代謝途徑(Metabolic pathways)、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)和不同環(huán)境中的微生物代謝(Microbial metabolism in diverse environments)的影響為主,且五個(gè)樣本的基因豐度沒有明顯差異,但在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphotransferase system)、核糖體(Ribosome)、氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids)、氨基糖和和核苷糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ABC transporters)、糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、果糖和甘露糖代謝(Fructose and mannose metabolism)等途徑存在基因豐度差異。
采用高通量測序技術(shù)對(duì)六神曲發(fā)酵過程中群落結(jié)構(gòu)的演替變化進(jìn)行分析,并結(jié)合PICRUSt2預(yù)測發(fā)酵期間菌群的功能變化。研究發(fā)現(xiàn),在六神曲自然發(fā)酵過程中,菌群多樣性和pH隨發(fā)酵時(shí)間明顯降低,后期菌群逐漸單一,細(xì)菌中的乳桿菌屬、片球菌屬和真菌中的毛孢子菌屬成為發(fā)酵階段明顯的優(yōu)勢菌。發(fā)酵原料缺少四種藥材之一,優(yōu)勢細(xì)菌均由乳桿菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)槠蚓鷮?,?yōu)勢真菌毛孢子菌屬的相對(duì)豐度也明顯降低。其中,辣蓼對(duì)發(fā)酵細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響最大;蒼耳草對(duì)子囊菌門和擔(dān)子菌門的生長影響最大。本研究為后續(xù)六神曲的功效研究提供支撐。