奇孢根霉強(qiáng)化中溫大曲對(duì)糟醅發(fā)酵過(guò)程的影響

萬(wàn)營(yíng)東，唐秋香，黃 鈞，周榮清，2*，張宿義，秦 輝，董 異，王 超，張 程，李德林，王小軍，張 柱

（1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610056；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的歷史[1]。濃香型白酒是中國(guó)三大傳統(tǒng)白酒之一，其生產(chǎn)工藝獨(dú)樹一幟[2-3]。濃香型白酒的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)節(jié)主要包括大曲制作和糟醅發(fā)酵過(guò)程[4]。大曲的菌系、酶系與白酒的產(chǎn)量和風(fēng)格密切相關(guān)[5]。篩選功能菌株并應(yīng)用于強(qiáng)化大曲，不僅可以提高大曲的酶活力，還能改善白酒的特征風(fēng)味。研究表明，將Bacillus用于強(qiáng)化中溫大曲，顯著提高了其糖化力和液化力，并且改變了與糖化活性和液化活性相關(guān)的微生物群落組成，從乳桿菌屬和根毛霉屬變?yōu)檠挎邨U菌屬、魏斯氏菌屬和絲孢畢赤酵母屬[6]。此外，HONG L等[7]研究發(fā)現(xiàn)，使用功能性酵母強(qiáng)化大曲，代替?zhèn)鹘y(tǒng)大曲模擬特香型白酒發(fā)酵，提高了糟醅的酒精度和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量，同時(shí)并未改變優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度。

根霉（Rhizopus）是釀酒曲中的主要功能菌之一[8-9]，其主要特點(diǎn)是水解酶譜廣，如分泌α-淀粉酶、糖淀粉酶、糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等[10]，且具有產(chǎn)酒精能力。根霉的高糖化力使其在發(fā)酵工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[9]。黃艷等[11]從酒曲中篩選出根霉，應(yīng)用于米醋生產(chǎn)，成功地提升了米醋的風(fēng)味和品質(zhì)。此外，麥麩通過(guò)接種米根霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，不僅降低了不愉悅風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量，還提高了多種芳香揮發(fā)性成分的相對(duì)含量，從而改善了其感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]。黃科屹等[13]的研究表明，從中高溫大曲中分離的米根霉可以制成米曲，添加至白酒釀造中，顯著提高了出酒率，說(shuō)明出酒率與大曲體系的糖化能力呈正相關(guān)。在之前的研究中，TANG Q等[14]利用源于優(yōu)質(zhì)小曲的奇孢根霉（Rhizopus azygosporus）強(qiáng)化小曲發(fā)酵，提高了小曲的淀粉水解力和酯化活力，并改善了小曲糟醅的理化性質(zhì)和風(fēng)味特點(diǎn)。馬鵬[15]通過(guò)混合根霉、米曲霉和紅曲霉制備米曲，與傳統(tǒng)大曲混合用于白酒固態(tài)發(fā)酵，提升了白酒的酒精度，豐富了白酒的風(fēng)味物質(zhì)。

總的來(lái)說(shuō)，目前的研究主要集中在小曲和米曲中強(qiáng)化根霉的應(yīng)用，以及將米曲與傳統(tǒng)大曲混合用于糟醅發(fā)酵，重點(diǎn)關(guān)注了白酒的理化和風(fēng)味改善。然而，對(duì)于在大曲制作過(guò)程引入根霉對(duì)大曲和發(fā)酵糟醅的影響規(guī)律的相關(guān)研究還相對(duì)較少。需要注意的是，大曲真菌屬相對(duì)豐度可能受到微生物間競(jìng)爭(zhēng)的影響，在高溫大曲中，更耐熱的嗜熱真菌屬和紅曲霉屬競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)更強(qiáng)，而根霉則生長(zhǎng)緩慢[16]。因此，在中溫大曲中引入根霉可能更為合適，且中溫大曲具有較高的糖化力，與根霉的特點(diǎn)相輔相成。

本研究以根霉強(qiáng)化的中溫大曲為發(fā)酵劑，通過(guò)模擬窖池發(fā)酵，多角度地探討了根霉強(qiáng)化對(duì)糟醅微生物群落結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味成分影響的規(guī)律，旨在調(diào)控白酒釀造周期和改善風(fēng)味成分，為開發(fā)固態(tài)白酒生產(chǎn)新工藝奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奇孢根霉（Rhizopus azygosporus）CGMCC 20728：由本實(shí)驗(yàn)室篩選自中國(guó)典型小曲酒廠，菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室；Fast DNA SPIN提取試劑盒：美國(guó)MP Biomedicals公司；Q5脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）高保真聚合酶：美國(guó)New England Biolabs公司；瓊脂糖、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit：美國(guó)Invitrogen公司；VAHTSTM DNA Clean Beads：南京Vazyme公司；其他化學(xué)試劑（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Fisher Electron公司；VF-WAX-MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)Bellefonte公司；NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；GL-20G-II立式高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；S100 TM Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc TM XR凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與收集

大曲樣品取自瀘州著名釀酒企業(yè)制曲中心，參照Z(yǔ)HENG X等[17]所述的工藝過(guò)程及參數(shù)控制生產(chǎn)，根霉大曲（RQ）接種0.05%的Rhizopus azygosporusCGMCC 20728，普通大曲（NQ）作為對(duì)照不接種根霉。

模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)采用改良的堆積糖化發(fā)酵工藝，發(fā)酵時(shí)間28 d。將RQ和NQ添加到蒸熟的高粱中（比例為干質(zhì)量的15%），堆積糖化24 h，裝入模擬發(fā)酵池（6 L塑料容器，內(nèi)徑為25 cm×17 cm×14 cm），在30 ℃條件下發(fā)酵28 d，相應(yīng)的糟醅記為根霉糟醅（RZP）和普通糟醅（NZP）。兩組樣品各設(shè)置3個(gè)平行，在發(fā)酵的0 d、7 d、14 d、21 d和28 d采用五點(diǎn)法取樣，每個(gè)平行樣品在取樣后均被分為兩份，一份置于-20 ℃保藏用于理化性質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)，另一份置于-80 ℃保藏用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3.2 理化性質(zhì)測(cè)定

大曲樣品的水分含量、酸度、酯化力、糖化力、液化力和發(fā)酵力的測(cè)定：參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》所述方法；糟醅還原糖（reducing sugar，RS）含量、淀粉（starch）含量、酸度（total acidity，TA）、酒精度的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]所述方法檢測(cè)。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

揮發(fā)性物質(zhì)通過(guò)頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（headspace solid-phase microextraction gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）測(cè)定。

樣品的預(yù)處理[19]：將1.00 g樣品和10 μL內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（辛酸甲酯，0.007 3 g/100 mL）加入20 mL頂空瓶中，將頂空瓶置于恒溫磁力攪拌器中60 ℃平衡15 min，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 纖維萃取吸附揮發(fā)性組分45 min。萃取頭在250 ℃解吸5 min。

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為流速1mL/min的高純氦氣（He）（＞99.999%），不分流模式；升溫程序：初始溫度40 ℃，維持5 min，以4 ℃/min升溫至100 ℃，以6 ℃/min升溫至230 ℃，維持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度300 ℃，電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍35～400 amu。

定性定量分析：檢測(cè)所得質(zhì)譜圖與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）2017質(zhì)譜庫(kù)對(duì)比后，僅保留相似度＞80%化合物進(jìn)行進(jìn)一步分析；根據(jù)內(nèi)標(biāo)辛酸甲酯的含量與其峰面積的比值，計(jì)算出各揮發(fā)性化合物的含量。

1.3.4 微生物群落多樣性檢測(cè)

依據(jù)FastDNASPIN提取試劑盒的操作說(shuō)明從樣品中提取總DNA。同時(shí)采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量。用通用引物338F/806R和ITS5/ITS1分別擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增體系：5 μL 5×Q5高保真反應(yīng)緩沖液，5 μL 5×Q5高保真氣相色譜緩沖液，0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶（5 U/μL），2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）（2.5 mmol/L），正反向引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL DNA模板和8.75 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)熱2 min，之后25個(gè)循環(huán)（包括98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化：用VAHTSTMDNA Clean Beads純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit定量。樣品純化后，委托上海派森諾生物科技有限公司在Illumina Novaseq平臺(tái)完成DNA片段雙端（2×300 bp）測(cè)序。

原始測(cè)序數(shù)據(jù)主要通過(guò)QIIME2處理。使用demux插件對(duì)原始序列進(jìn)行多路分解，使用cutadapt去除引物，接著使用DADA2對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾、去噪、合并和嵌合體移除。進(jìn)一步篩選僅在一個(gè)樣本和單體中發(fā)現(xiàn)的擴(kuò)增子序列（amplicon sequence variants，ASV）。最后，根據(jù)Silva（v132）和UNITE（v8.0）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用OriginPro 2019b對(duì)理化性質(zhì)進(jìn)行可視化。在派森諾基因云平臺(tái)（https：//www.genescloud.cn/home）進(jìn)行以下分析：分析微生物群落的α多樣性、β多樣性，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)等，并用線性判別分析效應(yīng)大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析（LDA＞4，P＜0.05）確定微生物群落的標(biāo)志微生物?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)和Metacyc數(shù)據(jù)庫(kù)，利用PICRUSt2預(yù)測(cè)代謝功能。在SIMCA14.1中進(jìn)行偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和排列檢驗(yàn)。使用TB Tools（v1.108）生成熱圖。在圖圖云平臺(tái)（https：//www.cloudtutu.com/#/index）和OmicShare Tools（https：//www.omicshare.com/tools）分別執(zhí)行冗余分析（redundancy analysis，RDA）和趨勢(shì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)變化

水分、酸度及水解能力是衡量大曲質(zhì)量的主要參數(shù)[20]，大曲的理化性質(zhì)差異見表1。由表1可知，RQ的水分、酸度和酯化力略低于NQ，糖化力、液化力、發(fā)酵力高于NQ，除酯化力外的其余相關(guān)參數(shù)都因接種根霉得到改善。將兩種大曲用于發(fā)酵糟醅，糟醅間理化參數(shù)的變化見圖1。由圖1可知，堆積糖化階段結(jié)束時(shí)，RZP和NZP的淀粉含量分別是31.53%和34.42%，前者的水解率高于后者，發(fā)酵結(jié)束淀粉含量分別是25.07%和27.51%。發(fā)酵前中期（0～14 d）淀粉被水解，后期因代謝產(chǎn)物（總酸、乙醇）的抑制及淀粉底物含量的降低，降解幅度減弱。還原糖含量和酸度在RZP和NZP中均是逐漸增高的，且RZP的增幅大于NZP，這可能是因?yàn)镽Q具有更高的糖化力和液化力，使RZP的底物更有效地水解為糖，同時(shí)糖發(fā)酵成酸。酒精度在前期增幅較大，在發(fā)酵14 d時(shí)，RZP的酒精度（8.57%vol）顯著高于NZP（7.28%vol）（P＜0.05），發(fā)酵結(jié)束時(shí)，RZP的酒精度（7.70%vol）僅略高于NZP（7.20%vol）。以上結(jié)果表明，RZP和NZP理化參數(shù)的變化趨勢(shì)一致，但根霉強(qiáng)化降低了糟醅的淀粉含量，同時(shí)提高了糟醅的酸度、還原糖含量和酒精度。

圖1 糟醅理化性質(zhì)的變化趨勢(shì)Fig.1 Change trends in physicochemical properties of fermented grains

表1 兩種大曲的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical properties of two kinds of Daqu

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分的差異

2.2.1 揮發(fā)性成分含量差異

糟醅樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖2可知，兩種樣品中共檢出了69種揮發(fā)性組分，包括酯類（45種）、醇類（4種）、酸類（1種）、烷類（2種）、烯類（3種）、酮類（3種）、酚類（1種）、醛類（6種）和其他類（2種）組分。

圖2 糟醅揮發(fā)性風(fēng)味成分含量差異及共有揮發(fā)性成分聚類分析熱圖Fig.2 Difference of volatile flavor component content and clustering analysis heatmap of shared volatile components in fermented grains

由圖2A可知，揮發(fā)性風(fēng)味成分總量隨發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸升高，且在發(fā)酵的初始階段（0～7 d）和中后期（14～21 d）增量明顯，RZP的揮發(fā)性風(fēng)味成分總量增量分別是20.15 mg/kg和19.86 mg/kg，較同期NZP的總量增量高39.07%和37.05%。在發(fā)酵后期（21～28 d），RZP揮發(fā)性風(fēng)味成分總量趨于穩(wěn)定，NZP卻降低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，RZP揮發(fā)性風(fēng)味成分總量為59.52 mg/kg，NZP僅為28.11 mg/kg。酯類組分占總揮發(fā)性風(fēng)味成分含量的74.23%～88.68%，經(jīng)7 d發(fā)酵，酯類含量從74.23%～74.34%增至86.52%～87.81%，后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，RZP酯類化合物的含量為51.22 mg/kg，NZP僅為23.88 mg/kg。酯類中主要是賦予基酒果香、花香和甜味的乙酯類[21]，作為骨架成分的己酸乙酯和乙酸乙酯[22]含量經(jīng)發(fā)酵顯著增高（P＜0.05），且根霉強(qiáng)化也使它們的含量增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，RZP中二者的含量比NZP分別增加了71.22%和44.36%。此外，糟醅中棕櫚酸乙酯的含量也因根霉強(qiáng)化而增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其在RZP中的含量比NZP中增加了93.66%。棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香、果香和奶油香氣，能賦予酒體醇厚感、降低干澀味[23]。發(fā)酵后棕櫚酸甲酯等成分的比例減少。醇類物質(zhì)賦予酒體醇厚綿甜風(fēng)味[24-25]，在0 d時(shí)比例最高，為7.88%～19.39%，且變化趨勢(shì)與酯類相反，可能與參與酯類合成有關(guān)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，RZP醇類化合物的含量為4.75 mg/kg，NZP為2.45 mg/kg。RZP和NZP中異戊醇的比例分別從初期的10.80%和12.45%降至結(jié)束時(shí)的3.21%和3.46%。

由圖2B可知，檢出的揮發(fā)性代謝組分中有22種是共有的，包括酯類17種、醇類3種、酚類1種和醛類1種。這些成分的聚類分析的結(jié)果見圖2C。由圖2C可知，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可為兩個(gè)簇，簇Ⅰ的成分包括酯類2種和酚類1種，而簇Ⅱ則包括酯類15種、醇類3種和醛類1種。這些成分在RZP中的含量都高于NZP，在發(fā)酵過(guò)程中，簇I的呈相對(duì)穩(wěn)態(tài)，而簇II的則逐漸增高，且在21 d時(shí)增幅最大。

2.2.2 特征揮發(fā)性成分分析

通過(guò)偏最小二乘判別分析（PLS-DA）法探討RZP和NZP間的差異性，結(jié)果見圖3。

圖3 糟醅揮發(fā)性風(fēng)味成分的偏最小二乘判別分析結(jié)果及熱圖Fig.3 Partial least squares discriminant analysis results and heat map of volatile flavor components in fermented grains

由圖3A可知，RZP和NZP被明顯分離，而R2X（模型在X空間的擬合度）、R2Y（模型在Y空間的擬合度）、Q2（模型預(yù)測(cè)能力）分別為0.872、0.919、0.855，表明構(gòu)建的模型可靠性好。由圖3B可知，200次排列檢驗(yàn)證明PLS-DA模型無(wú)過(guò)擬合，適合篩選樣品間特征揮發(fā)性代謝物?；陬A(yù)測(cè)變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（VIP＞1.0）的結(jié)果，確定了12種成分，包括10種酯、1種醇和1種酚，其中9種是共有的。這些成分隨發(fā)酵的變化如圖3C所示，大部分乙酯類成分（棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、反油酸乙酯、琥珀酸二乙酯、十七酸乙酯）的含量經(jīng)發(fā)酵均有明顯的增加，且在14～21 d增幅最高，而棕櫚酸甲酯、辛酸乙酯、異戊醇和4-乙基愈創(chuàng)木酚在發(fā)酵過(guò)程中呈相對(duì)穩(wěn)態(tài)，癸酸乙酯和亞油酸甲酯在NZP中前中期含量較高而后期并未檢測(cè)到。絕大部分成分在RZP的含量高于NZP，表明根霉強(qiáng)化可以提高糟醅中特征揮發(fā)性組分的含量。

2.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分表達(dá)趨勢(shì)分析

研究風(fēng)味代謝積累表達(dá)的時(shí)間趨勢(shì)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程的揮發(fā)性成分含量進(jìn)行趨勢(shì)分析，并將相關(guān)系數(shù)＞0.7的趨勢(shì)聚為一類。在RZP和NZP中各觀察到了2種趨勢(shì)顯著聚類，結(jié)果見圖4。由圖4可知，RZP和NZP分別有79.48%和77.09%的揮發(fā)性風(fēng)味成分呈漸增趨勢(shì)。其中，聚類1代表?yè)]發(fā)性風(fēng)味成分在發(fā)酵過(guò)程中含量一直增加，聚類2代表?yè)]發(fā)性成分含量在21 d之前呈漸增趨勢(shì)，21 d之后略降。值得注意的是，RZP和NZP分別有46.15%和66.67%的揮發(fā)性成分在發(fā)酵21 d之前含量增加，而在21 d之后含量略降，揭示了21 d是糟醅揮發(fā)性成分變化的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的趨勢(shì)分析Fig.4 Trend analysis of volatile flavor components in fermentation process

2.3 微生物多樣性分析

2.3.1 微生物群落Alpha多樣性指數(shù)差異

微生物的Alpha多樣性差異通?？梢杂韶S富度（Chao1指數(shù)、觀察物種指數(shù)）和多樣性（香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)）解釋。揮發(fā)性代謝成分的差異分析的結(jié)果表明，21 d是發(fā)酵系統(tǒng)揮發(fā)性成分變化的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)，因此僅對(duì)大曲和發(fā)酵21 d糟醅的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。群落的Alpha多樣性指數(shù)的差異見表2。

表2 大曲和發(fā)酵21 d糟醅的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of Daqu and fermented grains fermented for 21 d

由表2可知，大曲和對(duì)應(yīng)的發(fā)酵糟醅群落的Alpha多樣性呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)。對(duì)于真菌群落而言，RQ的豐富度低于NQ，但多樣性高于NQ，同時(shí)RZP的豐富度也低于NZP。這可能是因?yàn)楦箯?qiáng)化提高了RQ中根霉屬（Rhizopus）的豐度，亦改變了菌群結(jié)構(gòu)，尤其降低了真菌群落的豐富度。

對(duì)于細(xì)菌群落而言，RQ的豐富度和多樣性均高于NQ，同樣地，RZP的豐富度和多樣性也高于NZP。根霉強(qiáng)化提高了水解底物的速率，導(dǎo)致在大曲制作前期和糟醅堆積糖化階段，積累了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加快了細(xì)菌定植速率[14]，從而使RQ和RZP細(xì)菌群落豐富度都高于NQ和NZP。

2.3.2 微生物群落組成差異

大曲和糟醅的微生物群落組成見圖5。由圖5A可知，大曲和糟醅真菌群落由6個(gè)門構(gòu)成，主要為毛霉門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota），相對(duì)豐度之和為88.08%～99.49%。Mucoromycota在RQ和NQ中的相對(duì)豐度分別為27.40%和4.73%，而在RZP和NZP中分別增至57.64%和39.54%。相反地，Ascomycota在RQ和NQ中的相對(duì)豐度分別為72.09%和93.31%，而在RZP和NZP中分別降至30.44%和53.26%。屬水平的優(yōu)勢(shì)真菌如圖5B所示，大曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬包括根霉屬（Rhizopus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），其中Rhizopus是常見真菌之一，分泌多種水解酶，具有糖化和發(fā)酵且產(chǎn)生乙酸乙酯等代謝成分的能力[26]。RQ中Rhizopus的相對(duì)豐度是27.35%，而NQ僅為3.86%。值得關(guān)注的是根霉強(qiáng)化還顯著提高了大曲中Thermomyces的相對(duì)豐度（48.06%），但降低了Thermoascus的相對(duì)豐度（22.92%）。這兩個(gè)真菌屬在NQ中的相對(duì)豐度分別是14.64%和69.47%。Thermoascus亦能分泌多種酶，如過(guò)氧化氫酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶等[27]，且Thermomyces和Thermoascus皆具有較強(qiáng)的耐熱性，在發(fā)酵過(guò)程中能保持穩(wěn)定的催化效率[28]。發(fā)酵21 d時(shí)，RZP的優(yōu)勢(shì)真菌屬分別是Rhizopus（57.32%）、Thermomyces（3.22%）和酵母屬（Saccharomyces）（1.17%），NZP的優(yōu)勢(shì)真菌屬則是Rhizopus（32.16%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（7.30%）、Pichia（2.26%）和Saccharomyces（1.37%）。由于根霉強(qiáng)化提高了Rhizopus的相對(duì)豐度，同時(shí)也占據(jù)了其余真菌的生存空間，導(dǎo)致真菌群落的豐富度降低。

圖5 大曲和糟醅微生物群落組成差異Fig.5 Composition difference of microbial community of Daqu and fermented grains

由圖5C可知，大曲和糟醅的細(xì)菌群落由12個(gè)門組成，主要為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其相對(duì)豐度之和為99.18%～99.88%。大曲中Firmicutes的相對(duì)豐度最高，在RQ和NQ中的相對(duì)豐度分別為93.58%和98.94%。Firmicutes在RZP和NZP中其相對(duì)豐度降至50.30%和44.89%，而Proteobacteria的相對(duì)豐度分別增至49.58%和54.96%。兩種大曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬組成僅略有差異，但相對(duì)豐度差異明顯（圖5D）。乳桿菌屬（Lactobacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和魏斯氏菌屬（Weissella）是共享的優(yōu)勢(shì)屬，Lactobacillus和Weissella在RQ中的相對(duì)豐度（29.43%和25.53%）高于NQ（10.20%和11.37%），而NQ中Kroppenstedtia（76.68%）顯著高于RQ（22.86%）。高溫放線菌屬（Thermoactionmyces）（13.02%）也是RQ的優(yōu)勢(shì)菌之一。發(fā)酵21 d時(shí)，RZP的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬包括片球菌屬（Pediococcus）（28.17%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（10.46%）、Lactobacillus（10.31%）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）（22.91%）等8個(gè)屬，NZP則僅包括Pediococcus（38.45%）、Ralstonia（37.39%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（10.21%）等6個(gè)屬。Lactobacillus、Pediococcus、Weissella等乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物包括乙酸、乳酸等多種有機(jī)酸，這些代謝產(chǎn)物不僅是白酒的呈味成分，也是乙酸乙酯、乳酸乙酯等特征代謝物的前體[29-30]。

根霉強(qiáng)化顯著改變了大曲和糟醅的群落結(jié)構(gòu)。它增加了大曲中Rhizopus、Thermomyces、Lactobacillus、Weissella和Thermoactionmyces的相對(duì)豐度，降低了Thermomyces和Kroppenstedtia的相對(duì)豐度。對(duì)糟醅而言，根霉強(qiáng)化增加了Rhizopus、Thermomyces等的相對(duì)豐度，同時(shí)降低了Lichtheimia、Pichia等的相對(duì)豐度，此外，根霉強(qiáng)化還增加了糟醅細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的數(shù)量，并提高了Enterobacter、Lactobacillus等的相對(duì)豐度。

2.3.3 特征微生物分析

通過(guò)線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe）（LDA＞4，P＜0.05）法，識(shí)別了21 d時(shí)RZP和NZP之間的特征微生物，結(jié)果見圖6。由圖6A可知，RZP在綱、目、科、屬水平上鑒定出特征真菌，NZP在門、綱、目、科、屬等五個(gè)分類水平上均鑒定出特征真菌。在屬水平上，Thermomyces是RZP的特征真菌，NZP的則是Pichia和Lichtheimia。由圖6B可知，RZP在界、目、科、屬水平上鑒定出特征細(xì)菌，且RZP的特征細(xì)菌屬是Thermoactinomyces、Lactobacillus和Enterobacter，而在各分類水平上均未識(shí)別出NZP的特征細(xì)菌。

圖6 微生物群落的線性判別分析效應(yīng)大小結(jié)果Fig.6 Linear discriminant analysis effect size analysis results of microbial communities

2.3.4 綜合代謝途徑分析

對(duì)涉及糟醅原料利用、代謝產(chǎn)物生成以及酶的表達(dá)的代謝途徑進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7。由圖7可知，在RZP中，由于根霉的強(qiáng)化，提高了Rhizopus的相對(duì)豐度，葡糖淀粉酶、糖原磷酸化酶、內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），提高了淀粉原料的代謝速率，降低了RZP的淀粉含量，所以RZP中的RS含量高于NZP。糖酵解途徑中乙醇代謝的關(guān)鍵酶顯著下調(diào)（P＜0.05），包括丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶，解釋了RZP在發(fā)酵后期逐漸降低的乙醇含量。甲酸C-乙酰轉(zhuǎn)移酶的顯著上調(diào)（P＜0.05）和乙酰輔酶A合成酶的顯著下調(diào)（P＜0.05）導(dǎo)致RZP中乙酸鹽的積累增加。

圖7 涉及原料利用、代謝物生成和酶的代謝途徑分析Fig.7 Metabolic pathway analysis involving raw material utilization,metabolite production and enzymes

2.4 微生物群落與揮發(fā)性組分的相關(guān)性

通過(guò)對(duì)應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合的冗余分析（RDA）揭示酒醅中優(yōu)勢(shì)微生物屬與重要揮發(fā)性成分的相關(guān)性，結(jié)果見圖8。由圖8可知，采用Hellinger距離方法獲得了19種揮發(fā)性組分與5個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬和5個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相關(guān)性。Rhizopus、Lactobacillus和棕櫚酸乙酯、反油酸乙酯、丁酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醇等呈正相關(guān)，這可能是因?yàn)槿樗帷⒁宜岬榷喾N有機(jī)酸是Lactobacillus等乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，而Rhizopus具有較強(qiáng)的酯化作用[31]，能促進(jìn)前體物質(zhì)形成酯類，因此RZP中高相對(duì)豐度的Rhizopus和Lactobacillus協(xié)同作用提高了棕櫚酸乙酯、反油酸乙酯、丁酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、苯乙醇等成分的含量。由此可見，根霉強(qiáng)化有助于增加糟醅中優(yōu)勢(shì)揮發(fā)性組分的含量，提升其風(fēng)味和香氣。Thermomyces、Enterobacter和9-十六碳烯酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醇、肉豆蔻酸乙酯、己酸乙酯、γ-亞麻酸甲酯、異戊醇、辛酸乙酯等呈正相關(guān)，Ralstonia、Sphingomonas、Saccharomyces和γ-亞麻酸甲酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸甲酯、乳酸乙酯、亞油酸甲酯、癸酸乙酯等正相關(guān)，Pichia、Lichtheimia、Pediococcus和苯乙酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、月桂酸乙酯、琥珀酸二乙酯、癸酸乙酯、亞油酸甲酯、反油酸乙酯、丁酸乙酯等呈正相關(guān)。根霉強(qiáng)化通過(guò)提高RZP中Rhizopus、Lactobacillus、Thermomyces、Enterobacter等的豐度，使與這些優(yōu)勢(shì)微生物屬相關(guān)的風(fēng)味代謝物含量增加，提升糟醅的風(fēng)味和香氣。

圖8 優(yōu)勢(shì)微生物與主要揮發(fā)性化合物的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis of dominant microorganisms and main volatile compounds

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS和高通量測(cè)序技術(shù)揭示了根霉強(qiáng)化對(duì)糟醅揮發(fā)性風(fēng)味成分和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律。根霉強(qiáng)化顯著改變大曲和糟醅微生物群落結(jié)構(gòu)，其顯著提高了RQ和RZP中Rhizopus、Thermomyces的相對(duì)豐度。Thermomyces、Thermoactinomyces、Lactobacillus、Enterobacter是RZP的標(biāo)志微生物，Pichia、Lichtheimia則是NZP的標(biāo)志微生物。糟醅中Rhizopus和大多數(shù)優(yōu)勢(shì)揮發(fā)性成分呈正相關(guān)，根霉強(qiáng)化提高了糟醅中優(yōu)勢(shì)揮發(fā)性成分的含量。發(fā)酵過(guò)程提高了乙酸乙酯和己酸乙酯的含量，并增大了酯類組分的比例，降低了醇類的比例。兩種糟醅間導(dǎo)致差異風(fēng)味成分共12種，且21 d是系統(tǒng)代謝變化的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。研究結(jié)果為調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)和調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)奠定了方法學(xué)和理論的基礎(chǔ)。