GOx@Fe3O4-HNTs微囊反應器的構筑及多酶級聯(lián)催化性能

黃雨晴， 劉 妍， 張宏麗， 林 森，2， 孫仕勇，2， GOLUBEV Evgeny，呂 瑞， KOTOVA Olga， KOTOVA Elena

（1. 西南科技大學環(huán)境與資源學院, 固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室, 綿陽 621010;2. 西南科技大學非金屬礦產地質及其開發(fā)利用四川省高等學校重點實驗室, 綿陽 621010;3. 俄羅斯科學院烏拉爾分院科米科學中心地質研究所, 瑟克特夫卡爾 167982, 俄羅斯;4. 圣彼得堡國立礦業(yè)大學, 圣彼得堡 199106, 俄羅斯）

酶作為一類具有高底物特異性和選擇性的納米級生物催化劑， 能夠參與生物體內多種生物催化反應［1］. 生物細胞內的代謝過程通常伴隨著多種酶的協(xié)同催化作用， 其中一種酶的催化產物可以作為另一種酶的反應底物， 形成多酶級聯(lián)催化體系， 通過減少反應產物從一個活性位點到另一個活性位點的傳遞時間， 實現催化反應效率的提高［2，3］. 與單一酶催化相比， 多酶級聯(lián)催化不僅可以減少底物的傳輸與反應時間， 而且由于細胞空間的限制， 還能夠最大限度地減少高活性中間體的擴散和分解， 使酶促反應的整體效率得以提高. 然而， 體外游離形式的多酶級聯(lián)反應存在穩(wěn)定性差、 反應活性低、 難以回收再利用以及傳質距離遠等問題， 極大限制了其在實際領域中的應用［4］. 為解決此問題， 研究人員開始聚焦于選取具有類似天然酶功能的納米酶， 結合相應載體在體外構建固定化多酶級聯(lián)催化體系. 與游離形式的酶催化體系相比， 固定化多酶級聯(lián)反應體系受酶的類型、 酶濃度、 載體的種類和形態(tài)等多種因素的影響. 因此， 通過合理的構建策略， 精確設計并構筑固定化多酶級聯(lián)反應器以實現酶的高效催化是目前的研究熱點. 近年來， 經研究發(fā)現， 通過層層自組裝［5］、 共價結合［6，7］和封裝包埋［8，9］等方式可以構筑多種類型的納米反應器， 以組建密閉空間內的酶級聯(lián)反應， 從而增強酶促反應局部的傳質作用， 提高其催化反應效率. Zhang等［10］設計了一種基于多巴胺平臺構建的三酶級聯(lián)反應體系， 通過合理組合包封包埋以及交聯(lián)技術將α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷酶固定在聚多巴胺微膠囊中， 構建得到多酶或多藥物/細胞/基因反應系統(tǒng)， 可應用于生物治療、 環(huán)境催化、 生物傳感等領域. Wang 等［11］采用共沉淀法將具有過氧化物酶類催化活性的NiPd 中空納米顆粒和葡萄糖氧化酶（GOx）同時固定在沸石咪唑酸骨架（ZIF-8）上， 通過構建串聯(lián)天然酶-人工酶的GOx/NiPd@ZIF-8催化反應體系制備得到一種可以快速檢測葡萄糖的比色傳感器， 為納米酶-天然酶之間級聯(lián)催化體系的構筑以及生物檢測應用提供了相應的啟示. 因此， 篩選具有高生物相容性、 高反應穩(wěn)定性以及成本低廉的載體材料是構筑多酶級聯(lián)反應器的關鍵.

納米管材料一般具有量子尺寸效應， 且比表面積大， 吸附性能強， 通過共價或非共價等相互作用對有機/無機納米管材料表面進行功能化， 可以改變納米管的表面性質， 作為載體材料逐漸引起人們的廣泛關注. 埃洛石納米管（HNTs）是一種具有獨特空心管狀結構的天然鋁硅酸鹽粘土礦物， 具有良好的吸附性、 分散性、 生物相容性等特性［12～14］， 因管的內、 外表面分別存在鋁氧八面體（［AlO6］9-）和硅氧四面體（［SiO4］4-）基團， 使其管腔內部和管壁表面分別帶有正電荷和負電荷［15，16］. 同時， HNTs 表面存在Si—O—Si、 Al—OH 和Si—OH 等基團， 可以對其進行表面功能化修飾改性， 包括有機硅烷改性、 聚合物改性、 納米顆粒修飾等［17～19］. 其中， 對HNTs表面進行磁性納米顆粒修飾構建的磁性納米復合材料已經在化學催化、 生物傳感、 環(huán)境治理等領域得到應用［20］. 四氧化三鐵（Fe3O4）是一類常見的磁性氧化物， 具有良好的超順磁性、 生物相容性和光熱轉換效率， 同時還表現出類過氧化物酶催化活性［21，22］.Maleki 等［23］將Fe3O4磁性納米顆粒負載在埃洛石納米管上， 探索Fe3O4/HNTs 作為非均相催化劑的反應合成性能. 結果表明， 以苯甲醛、 丙二腈和二美酮作為原料， 以乙醇作為溶劑， Fe3O4/HNTs 使用量為30 mg時， 在反應溫度為40 ℃條件下成功合成出4H-吡喃衍生物， 且催化劑表現出良好的重復利用率，表明所制備的Fe3O4/HNTs材料可作為穩(wěn)定高效的有機合成反應的納米催化劑. Zhu等［24］采用水熱法結合原位還原法制備出Ag@Fe3O4/RHNTs納米復合材料， 并構建以Ag@Fe3O4/RHNTs為酶模擬物的過氧化氫（H2O2）比色傳感平臺， 在牛奶和血清的H2O2檢測中表現出了高效的靈敏性， 當溫度和pH 值分別為55 ℃和4時， 傳感器對于H2O2的檢測范圍為10～100 μmol/L， 檢測限低至0.7 μmol/L， 比色傳感系統(tǒng)所具有的高效催化性能與所制備材料反應過程中產生的?OH、 ?O2-以及h+等活性自由基有關. Duan等［25］采用化學沉淀法制備了Fe3O4-HNTs礦物基磁性復合材料， 并將其應用于甲基紫（MV）染料的吸附實驗中. 研究結果表明， 所制備的Fe3O4-HNTs 復合材料在較寬的pH 值、 金屬離子濃度和溫度范圍內對于MV 均表現出較高的吸附性能， 其吸附動力學符合Langmuir 模型， 且經過回收的材料通過簡單煅燒處理后能夠再次利用， 可作為陽離子染料廢水處理的理想材料. 經Fe3O4磁性顆粒表面修飾的HNTs作為酶固定化載體具有如下優(yōu)點： （1） HNTs 所具有的高比表面積能夠為Fe3O4的原位合成提供平臺；（2） Fe3O4所具有的磁性使得材料能夠回收再利用， 降低反應成本. 因此， 通過以Fe3O4-HNTs作為酶固定化載體探索多酶級聯(lián)反應體系的催化性質具有重要的研究意義.

研究表明， GOx可以將葡萄糖催化氧化為葡萄糖酸和H2O2， H2O2能夠被過氧化物酶或具有類過氧化物酶活性的納米酶激活， 產生羥基自由基（?OH）， 進一步氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）發(fā)生顯色反應［26］. 基于此， 在本研究中， 首先通過以粘土礦物埃洛石納米管（HNTs）作為載體， 利用化學沉淀法在HNTs 表面原位生長Fe3O4納米顆粒， 并利用表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對其表面進行疏水改性， 制備具有磁性和類過氧化物酶活性的Fe3O4-HNTs 囊壁材料. 隨后， 利用皮克林乳液法， 將GOx 封裝于Fe3O4-HNTs 微囊內， 構建一種模擬細胞內酶促級聯(lián)反應系統(tǒng)的GOx@Fe3O4-HNTs 微囊反應器， 并用于葡萄糖的檢測（Scheme 1）. 微囊反應器對于GOx的封裝不僅可以保持GOx的酶催化活性和反應穩(wěn)定性， 其自身的磁性也提高了材料的重復使用性. 這項工作為粘土礦物基天然酶-納米酶多酶級聯(lián)催化體系的構建提供了思路， 對于拓展粘土礦物和金屬氧化物在類酶催化效應研究領域的應用具有重要意義.

Scheme 1 Schematic of construction and cascade reaction process of GOx@Fe3O4-HNTs microcapsule reactor

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

埃洛石納米管（HNTs）購自十堰市玖福礦業(yè)有限公司； 葡萄糖氧化酶（GOx）、 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和辣根過氧化物酶（HRP）購自合肥博美生物科技有限公司； 無水乙醇、 七水合硫酸亞鐵（FeSO4?7H2O， 純度≥99%）和六水合氯化鐵（FeCl3?6H2O， 純度≥99%）購自上海阿拉丁生化科技有限公司. 實驗中所用化學試劑均為分析級， 未經過進一步純化直接使用.

X′Pert PRO 型 X 射線衍射（XRD）儀， 荷蘭帕納科公司； Spectrum One 型傅里葉變換紅外光譜（FTIR）儀， 美國 PE 儀器公司； ULTRA 55 型 200 kV 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）， 德國蔡司儀器公司； UV-2800A 型紫外-可見（UV-Vis）分光光度計， 尤尼柯（上海）儀器有限公司； DM2000 型光學顯微鏡， 德國徠卡公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 Fe3O4-HNTs的合成 參考文獻［27］報道的方法制備Fe3O4-HNTs. 首先， 將1 g HNTs通過超聲分散于100 mL超純水中； 然后， 于70 ℃下將0.9723 g FeCl3?6H2O和0.5000 g FeSO4?7H2O加入到溶液中，攪拌30 min. 隨后， 用NH3?H2O（25%～28%）將溶液體系的pH值調至9～10， 于70 ℃下水浴老化5 h； 最后， 將反應結束后的樣品用超純水洗滌3次， 于60 ℃下干燥， 備用.

1.2.2 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對Fe3O4-HNTs 的疏水改性 首先， 分別將0.25， 0.50， 0.75 和1.00 g 的CTAB 溶解于50 mL 超純水中. 隨后， 向其中加入1 g Fe3O4-HNTs， 于60 ℃、 轉速300 r/min 的恒溫振蕩箱中振蕩6 h后， 過濾、 洗滌3或4次， 并置于60 ℃烘箱中烘干， 得到改性的Fe3O4-HNTs， 記為Fe3O4-HNTs（CTAB）.

1.2.3 GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊的制備 在甲苯中配制不同濃度（0.5， 1， 2 mg/mL）的改性Fe3O4-HNTs溶液， 超聲分散10 min使其分散均勻. 在超純水中配制濃度為0.04 mg/mL的GOx溶液， 分別向不同濃度的改性Fe3O4-HNTs溶液中滴加200 μL GOx溶液， 用高速勻漿機勻漿15 s， 形成油包水型皮克林乳液. 向該乳液中加入一定量的四甲氧基硅烷（TMOS）交聯(lián)劑， 靜置24 h后用乙醇清洗多余的油相， 最后將形成的GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊轉移到水相中.

1.2.4 Fe3O4-HNTs類過氧化物酶活性測定 利用H2O2-TMB顯色反應體系評估Fe3O4-HNTs的類過氧化物酶活性. 首先， 將200 μL TMB溶液（2 mg/mL）添加到4.68 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=4.0）中； 然后， 向其中加入10 μL H2O2溶液（30%）； 最后， 加入300 μL Fe3O4-HNTs 溶液（1 mg/mL）， 反應15 min后用紫外-可見分光光度計測定其在655 nm處的吸光度.

1.2.5 GOx@Fe3O4-HNTs 和天然酶的級聯(lián)活性測定 以TMB 作為反應底物測試GOx@Fe3O4-HNTs 的級聯(lián)反應活性. 將TMB 溶液（200 μL， 2 mg/mL）加入到含有一定量GOx@Fe3O4-HNTs 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=4）中， 并加入一定量葡萄糖溶液（300 μL， 0.1 mol/L）， 于37 ℃溫育45 min， 使用紫外-可見分光光度計測定655 nm處的吸光度. 以TMB 作為反應底物測試游離狀態(tài)下GOx+HRP 的級聯(lián)反應活性. 分別將一定量GOx溶液和HRP溶液加入到含有一定量TMB（200 μL， 2 mg/mL）和葡萄糖（300 μL， 0.1 mol/L）的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=4） 中， 于37 ℃溫育10 min， 使用紫外-可見分光光度計測定655 nm處的吸光度.

1.2.6 pH 和溫度穩(wěn)定性測定 將GOx@Fe3O4-HNTs 和游離酶體系（GOx+HRP）分別在不同pH 值的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH=3.5～6.0， 0.1 mol/L）中放置5 h， 測定酶活性， 考察其pH 穩(wěn)定性； 將GOx@Fe3O4-HNTs和游離酶體系（HRP+GOx）分別在不同溫度（30～90 ℃）下溫育30 min， 測定酶活性， 考察其溫度穩(wěn)定性.

1.2.7 動力學參數測定 在含有Fe3O4-HNTs空心微囊的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=4）中加入不同體積（40， 60， 80， 100， 120， 140 μL）的H2O2（2 mol/L）和200 μL TMB（2 mg/mL）， 反應15 min 后測試溶液吸光度， 獲取Fe3O4-H2O2的反應動力學曲線（Lineweaver-Burk圖）， 并利用方程（1）計算其表觀動力學參數［米氏常數（Km）和最大反應速度（Vmax）］. 在含有GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=4）中加入不同濃度（20， 40， 50， 60， 80， 100 mmol/μL）的葡萄糖溶液和200 μL TMB（2 mg/mL）， 反應30 min 后測試溶液吸光度， 根據Fe3O4-H2O2反應動力學曲線計算得到不同濃度葡萄糖條件下GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊的過氧化氫產量， 獲取其反應動力學曲線， 并利用方程（1）計算其Km和Vmax：

式中：V（mmol·mL-1·min-1）和［S］（mmol·mL-1）分別表示反應初始速度和TMB或葡萄糖的濃度.

1.2.8 葡萄糖的檢測 向4 mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=4）中加入300 μL GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊（1 mg/mL）和200 μL TMB（2 mg/mL）， 并分別加入500 μL 不同濃度（1， 10， 20， 40， 60，100， 200 μmol/L）的葡萄糖溶液， 于37 ℃溫育45 min， 利用紫外-可見分光光度計測定溶液在655 nm處的吸光度.

2 結果與討論

2.1 材料的表征

Fig.1（A）顯示了HNTs， Fe3O4和經CTAB 疏水改性后的Fe3O4-HNTs 的XRD 圖譜. 與原始HNTs 的特征峰相比， 在HNTs表面原位合成Fe3O4后， 仍然存在可歸屬于HNTs的（001）、 （100）和（002）晶面的特征衍射峰， 且在2θ=30.13°， 35.54°， 42.23°， 57.17°和62.50°處出現了歸屬于磁性Fe3O4納米顆粒的特征衍射峰， 這說明利用化學沉淀法制備的改性Fe3O4-HNTs 復合納米材料仍然保留了HNTs 和Fe3O4的結構成分.

如圖1（B）的FTIR 光譜所示， HNTs 在高頻區(qū)3696 和3619 cm-1處出現了較強的分裂峰， 這是由HNTs的Al—OH內表面羥基的O—H拉伸振動引起的， 912 cm-1處的吸收帶歸因于上述羥基的O—H彎曲振動， 出現在467和537 cm-1處的吸收峰分別屬于Si—O—Si和Al—O—Si的彎曲振動， 而在690， 754和1027 cm-1處的吸收峰為Si—O—Si 的拉伸振動峰. HNTs 和Fe3O4的紅外特征峰均出現在經CTAB 疏水改性后的Fe3O4-HNTs的FTIR光譜中， 其中HNTs的O—H鍵的拉伸振動和彎曲振動峰可能會與Fe3O4的Fe—O特征峰重疊.

Fig.1 XRD patterns(A) and FTIR spectra(B) of HNTs, Fe3O4 and Fe3O4-HNTs(CTAB), SEM images of Fe3O4-HNTs(CTAB)(C), GOx@Fe3O4-HNTs(D) and relevant energy spectrum(E) of GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules, TG curves of HNTs, Fe3O4-HNTs(CTAB) and GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules(F) and surface contact angles of Fe3O4-HNTs(G) and Fe3O4-HNTs(CTAB)(H)

樣品的SEM照片［圖1（C）和（D）］顯示， 在改性Fe3O4-HNTs復合材料中， Fe3O4納米顆粒的確已負載在HNTs表面， 水相中的GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊經過脫水、 干燥處理后， 微囊的形貌和結構仍然保持完整， 表明微囊經過交聯(lián)劑TMOS交聯(lián)后具有良好的結構穩(wěn)定性， 在后續(xù)微囊包封GOx進行酶促級聯(lián)反應的實驗中， 不會因外界環(huán)境條件（溶液溫度、 濃度、 pH等）的變化而出現破裂或形變等問題， 保證了所制備材料級聯(lián)反應實驗的穩(wěn)定性和高效性. 從復合微囊的能譜圖［圖1（E）］中可以看出， 微囊內主要含有O， Si， Al， Fe， C， N， Br 等元素， 其中O， Si和Al 元素為HNTs 中所含有的元素， O和Fe 元素來源于Fe3O4納米顆粒， C， N和Br元素來源于GOx和表面活性劑CTAB， 所制備的復合微囊內所含元素種類與原料一致， 進一步表明通過皮克林乳液法， 以Fe3O4-HNTs為囊壁， 已將GOx封裝于Fe3O4-HNTs微囊內.

Fig.1（F）為HNTs、 改性Fe3O4-HNTs 復合材料以及GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊的熱重曲線. 從圖中可以看出， 所有樣品從室溫～200 ℃時開始出現失重， 這可能是由于粘土礦物埃洛石的晶體結構中層間水的揮發(fā)所致； 在400～600 ℃的溫度區(qū)間內， HNTs和改性Fe3O4-HNTs的質量出現明顯下降， 這主要是由于隨著溫度的逐漸升高， 埃洛石的表面羥基結構被破壞所致； 與HNTs和改性Fe3O4-HNTs相比， 所制備的GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊在400～1000 ℃溫度范圍內的質量損失更小， 這表明Fe3O4-HNTs囊壁對于囊內的GOx起到了保護作用.

Fe3O4-HNTs 經表面活性劑CTAB 改性前后的接觸角如圖1（G）和（H）所示. 從圖中可以看出，Fe3O4-HNTs 的水接觸角為47.6°， 而Fe3O4-HNTs（CTAB）的水接觸角為60.7°， 表明CTAB 對于Fe3O4-HNTs的有機改性具有疏水效果.

2.2 微觀形貌分析

2.2.1 油/水比例的影響 當向以Fe3O4-HNTs 為分散劑的甲苯相（油相）中滴入含GOx 的超純水后， 在勻漿機的快速攪拌下（1000 r/min）， 以CTAB表面活性劑改性的Fe3O4-HNTs在油/水界面的張力會降低，從而形成油包水的GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊； 當向甲苯相（油相）乳液中滴入TMOS 進行交聯(lián)后，TMOS 的水解使微囊表面逐漸形成網絡狀結構的氧化硅層， 將GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊從油相轉移到水相中后， 可以保證微囊形貌與結構的完整性. 如圖2所示， 所制備的復合微囊的粒徑在30～200 μm之間， 這可能是由于在油包水乳液形成的過程中， 勻漿機的攪拌子在乳液中不同位置的剪切力不同，從而使得形成的微囊之間具有粒徑差異. 皮克林乳液中油相與水相的比例、 勻漿機的攪拌頻率和強度等均能影響微囊的粒徑. 隨后， 固定勻漿機轉速（1000 r/min）和油相中Fe3O4-HNTs 的濃度（2 mg/mL），通過改變油相與水相的體積比（10∶1， 20∶1， 40∶1）來調控微囊的大小與形態(tài). 從圖2 中可以看出， 當油/水比為10∶1 時， 大部分微囊的直徑小于30 μm 且存在團聚現象， 這將影響后續(xù)交聯(lián)劑在其表面的均勻分布； 當油/水比為40∶1時， 微囊直徑普遍大于80 μm， 會導致后續(xù)交聯(lián)反應效果下降， 使微囊在轉移到水相的過程中出現形變或破損. 因此， 選擇油/水比為20∶1形成的微囊（直徑約80 μm）開展后續(xù)實驗.

Fig.2 Optical microscopy images of GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules under the oil/water ratios of 10∶1(A), 20∶1(B) and 40∶1(C)

2.2.2 交聯(lián)劑用量的影響 從水相中Fe3O4-HNTs空心微囊的光學顯微鏡照片可以看出， TMOS交聯(lián)劑的添加量（50， 80， 100， 200 μL）可以顯著影響Fe3O4-HNTs空心微囊在水相中的形態(tài). 從圖3（A）和（D）可以看出， 當TMOS的加入量過少時， 會導致微囊向水相轉移的過程中出現大面積的破損； 而當TMOS的加入量過多時， 過度的交聯(lián)作用會導致微囊之間相互團聚. 如圖3（C）所示， 當TMOS 的加入量為100 μL時， 微囊經過交聯(lián)反應轉移到水相后形貌保持較完整， 部分微囊可能由于囊內沒有包封GOx而出現凹陷. 因此， 后續(xù)將使用經100 μL TMOS交聯(lián)后的微囊開展實驗.

Fig.3 Optical microscopy images showing the effect of TMOS cross-linking agent additions(50, 80, 100,200 μL) on the intact structure of Fe3O4-HNTs hollow microcapsules from aqueous phase

2.3 Fe3O4-HNTs的類過氧化物酶活性

首先， 對Fe3O4-HNTs 的類過氧化物酶活性進行了考察. 如圖4（A）所示， 在Fe3O4-HNTs、 H2O2和TMB同時存在的條件下， 在655 nm處檢測到最大吸收峰； 而在沒有TMB、 H2O2或Fe3O4-HNTs存在的情況下， 在655 nm處沒有出現相應的吸收峰， 這與天然辣根過氧化物酶所具有的過氧化物酶催化特性一致［28］， 表明材料中的Fe3O4具有類過氧化物酶活性， 能與H2O2反應產生?OH， 隨后?OH氧化TMB， 產生oxTMB氧化物， 使溶液發(fā)生藍色顯色反應. 為驗證反應體系中存在?OH， 以異丙醇作為?OH捕獲劑加入到上述反應體系中， 如圖4（B）所示， 反應溶液在655 nm 處的吸收峰強度減弱， 證明在反應過程中Fe3O4氧化H2O2產生了?OH.

Fig.4 UV-Vis absorption spectra of different systems(A) and the Fe3O4-HNTs+H2O2+TMB system before and after the addition of isopropanol(B)

2.4 GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊級聯(lián)反應的構筑

對所制備的GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊的級聯(lián)催化性能進行了考察. 如圖5（A）所示， 在無葡萄糖或TMB 存在的條件下， 在655 nm處沒有檢測到相應的吸收峰； 而當GOx@Fe3O4-HNTs、 葡萄糖和TMB同時存在時， 反應體系在655 nm處檢測到特征吸收峰， 表明在有葡萄糖和TMB存在的條件下， 復合微囊內的GOx首先催化氧化葡萄糖產生葡萄糖酸和H2O2， 之后微囊壁中的Fe3O4催化H2O2原位生成活性自由基?OH， 最后?OH氧化底物TMB產生相應氧化物oxTMB， 從而使溶液由無色變?yōu)樗{色.

Fig.5 UV-Vis absorption spectra of GOx@Fe3O4-HNTs+Glucose+TMB, GOx@Fe3O4-HNTs+TMB and GOx@Fe3O4-HNTs+glucose systems(A) and of glucose+GOx+Fe3O4-HNTs+TMB and glucose+GOx@Fe3O4-HNTs+TMB in 0.1 mol/L NaAc-HAc buffer(B), cascade reaction enzymatic activities of GOx+Fe3O4-HNTs and GOx@Fe3O4-HNTs(C), and absorbance-time curves of Fe3O4-HNTs+GOx and GOx@Fe3O4-HNTs in 100 mmol/L glucose(D)

隨后， 以GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊和GOx+Fe3O4-HNTs物理混合體系為考察對象， 研究了微囊固定封裝GOx 對于催化葡萄糖級聯(lián)反應的影響. 從圖5（B）～（D）可以看出， 在相同反應條件下，GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊體系在655 nm處的吸收峰強度是GOx+Fe3O4-HNTs物理混合體系的2.5倍，其酶催化的相對活性提高了2.21 倍， 且30 min 內GOx@Fe3O4-HNTs 體系的反應速度快于GOx+Fe3O4-HNTs體系， 表明以Fe3O4-HNTs為囊壁， 包封GOx構筑的GOx@Fe3O4-HNTs微囊反應器具有更優(yōu)異的酶促級聯(lián)催化性能. 其原因是微囊反應器中的GOx與Fe3O4-HNTs之間的核-殼結構形成了一個緊密的反應微室， 使得級聯(lián)催化反應被限制于此微小空間內， 極大地縮短了天然酶、 納米酶以及活性物種之間的距離， 因此經固定化后的GOx 催化葡萄糖原位產生的H2O2能立即與Fe3O4-HNTs 進行反應， 降低了H2O2的擴散和自分解， 從而提高了酶促級聯(lián)反應的催化效率.

2.5 GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊的酶學性質

2.5.1 葡萄糖加入量和反應平衡時間的影響 葡萄糖是GOx@Fe3O4-HNTs反應體系中級聯(lián)催化反應的能量來源， 考察了葡萄糖的加入量對于GOx@Fe3O4-HNTs 反應體系催化效率的影響. 如圖6（A）所示，隨著反應體系中葡萄糖加入量的逐漸增多， 級聯(lián)催化反應活性呈現先增大后減小的趨勢， 當葡萄糖溶液（0.1 mol/L）的添加量為300 μL 時， 反應體系具有最佳反應活性. 隨后， 在最佳葡萄糖添加量條件下， 考察了級聯(lián)催化反應達到平衡狀態(tài)的時間. 從圖6（B）可以看出， 經過80 min后反應達到平衡. 因此， 以300 μL的葡萄糖添加量和80 min反應時間作為后續(xù)實驗條件.

Fig.6 Relative activity with different addition amounts of glucose solution(0.1 mol/L)(A) and at different reaction time(B) for cascade reactions in GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules

2.5.2 溫度和酸堿耐受性 對所制備的微囊反應器GOx@Fe3O4-HNTs 和天然酶體系GOx+HRP 在不同pH 值和溫度條件下的酶促級聯(lián)催化反應的穩(wěn)定性進行考察. 如圖7（A）所示， 當反應溫度高于60 ℃時， GOx+HRP天然酶體系的催化活性顯著降低， 相較于GOx+HRP體系， GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊在30～90 ℃溫度條件下表現出了更優(yōu)異的催化穩(wěn)定性. 從圖7（B）可以看出， 當反應體系的pH值為3.5～6.0時， GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊的催化活性始終保持在80%以上， 而GOx+HRP 天然酶體系的催化活性在pH值達到4以后急劇下降. 研究結果表明， 所制備的GOx@Fe3O4-HNTs微囊反應器比天然游離酶具有更高的溫度和酸堿耐受性.

Fig.7 Temperature stability(A) and pH stability(B) of GOx@Fe3O4-HNTs and GOx+HRP, recyclability of GOx@Fe3O4-HNTs(C) and storage stability of GOx@Fe3O4-HNTs and GOx+HRP(D)

2.5.3 儲存穩(wěn)定性和重復使用性 對所制備的GOx@Fe3O4-HNTs微囊反應器的儲存穩(wěn)定性和重復使用性進行了考察. 如圖7（C）和（D）所示， 當GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊經過7次催化反應后， 其酶催化活性仍可保留50%以上， 且GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊在4 ℃下儲存30 d后的相對酶活性仍能保持90%以上. 由于天然酶具有較強的親水性， 使用后無法回收利用， 本研究所構筑的納米酶-天然酶微囊反應器表現出的優(yōu)異反應穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性可極大地降低酶促催化反應的成本， 有利于其工業(yè)化實際應用.

2.5.4 級聯(lián)反應的催化動力學 為了進一步研究GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊的級聯(lián)催化性能， 考察了兩步酶促反應的穩(wěn)態(tài)動力學參數. 取Michaelis-Menten方程曲線的雙倒數形式， 以底物濃度倒數為橫坐標， 反應初速度倒數（v-1）為縱坐標， 分別繪制微囊內GOx 催化氧化葡萄糖和囊壁中Fe3O4催化H2O2的Lineweaver-Burk圖， 以獲取其穩(wěn)態(tài)動力學參數. 由圖8和表1可知， 在葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖產生H2O2反應中， 其米氏常數（Km）值為831.6 mmol/L， 大于Fe3O4催化H2O2反應的Km值（159.4 mmol/L），表明H2O2與Fe3O4之間的親和力高于GOx 與葡萄糖之間的親和力， 證明在此酶促級聯(lián)反應體系中， 葡萄糖會首先與體系中的GOx 結合生成H2O2， 之后H2O2再與Fe3O4反應產生?OH 并催化底物TMB 顯色.此外， GOx催化葡萄糖產生H2O2反應的最大反應速率為1.5 mmol?mL-1?min-1， 大于Fe3O4催化H2O2生成?OH的速率（0.3 mmol?mL-1?min-1）， 說明Fe3O4催化H2O2反應是此酶促級聯(lián)反應的限速步驟.

Table 1 Michaelis constant(Km) and maximum velocity(vmax) of GOx-glucose and Fe3O4-H2O2 in GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules

Fig.8 Step-by-step Lineweaver-Burk diagrams of the cascade reactions of GOx-glucose(A) and Fe3O4-H2O2(B) for GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules

在上述實驗基礎上， 進一步考察了在不同葡萄糖和TMB 濃度條件下， GOx@Fe3O4-HNTs 微囊反應器級聯(lián)反應體系的穩(wěn)態(tài)動力學， 并與GOx+HRP天然酶體系進行對比. 由圖9和表2可知， GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊對葡萄糖和TMB 兩種底物的親和力（Km=99.94， 1.95 mmol/L）均低于GOx+HRP 天然酶體系（Km=2.13， 0.47 mmol/L）， 而對葡萄糖和TMB 底物的最大反應速率vmax（0.38， 0.35 mmol?mL-1?min-1）大于GOx+HRP天然酶體系（Vmax=0.17， 0.19 mmol?mL-1?min-1）. 這表明以具有類過氧化物酶活性的Fe3O4-HNTs作為微囊壁材， 不但可以為酶促級聯(lián)反應提供后續(xù)催化動力， 而且還能夠為反應提供微反應空間， GOx的酶固定化處理縮短了GOx與Fe3O4-HNTs之間的傳質距離， 使得反應生成的H2O2直接與壁材中的Fe3O4接觸而發(fā)生催化反應， 可以最大限度地減少H2O2的擴散和自分解， 消除中間產物的積累， 從而提高酶促級聯(lián)反應的催化性能.

Table 2 Michaelis constant(Km) and maximum velocity(vmax) of GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules and GOx+HRP system

Fig.9 Lineweaver-Burk plots of GOx@Fe3O4-HNTs microcapsules and GOx+HRP system at different concentrations of glucose(A) and TMB(B)

2.6 GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊的葡萄糖檢測

為了進一步證明GOx@Fe3O4-HNTs復合微囊反應體系優(yōu)異的酶促級聯(lián)反應性能， 在優(yōu)化條件下研究了其葡萄糖檢測功能. 在反應體系溫度為37 ℃， pH=4 的條件下， 將不同濃度的葡萄糖添加到GOx@Fe3O4-HNTs 級聯(lián)反應體系中. 從圖10（A）可以看出， 隨著葡萄糖添加濃度的增大， 反應體系在655 nm處的吸光度逐漸增大， 且溶液的顏色也逐漸加深. 由圖10（B）可知， 反應體系的吸光度與葡萄糖的濃度呈線性關系：y=0.00417x+0.1125（R2=0.9817）， 相應的葡萄糖檢出限（LOD）為0.65 μmol/L，表現出較高的檢測靈敏度， 表明以Fe3O4-HNTs為囊壁材料封裝GOx所構建的復合微囊反應器在葡萄糖的比色檢測應用中具有可行性.

Fig.10 UV-Vis absorption spectra and corresponding digital photo(inset) of cascade reactions of GOx@Fe3O4-HNTs with the glucose concentrations from 1 μmol/L to 200 μmol/L(A) and the linear calibration curve of glucose detection at 655 nm(B)

3 結論

以GOx 和Fe3O4分別作為天然酶和納米酶， 將GOx 封裝于經粘土礦物HNTs 負載的Fe3O4-HNTs 內部， 構筑GOx@Fe3O4-HNTs 仿生微囊反應器. 當加入葡萄糖時， 包封于囊內的GOx 首先催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2， 然后H2O2被囊壁中Fe3O4催化氧化生成活性自由基·OH， ·OH 進而氧化底物TMB得到藍色氧化物oxTMB， 從而構建得到天然酶-納米酶酶促級聯(lián)催化反應體系. 與游離酶反應體系相比， GOx@Fe3O4-HNTs 復合微囊級聯(lián)反應體系表現出更優(yōu)異的催化效率、 反應穩(wěn)定性以及儲存穩(wěn)定性， 這歸因于由微囊所提供的內部空腔可以將GOx封裝于其中， 使得酶中間體的擴散被最小化， 從而有利于酶促級聯(lián)反應效率的提高. 這項工作為構建仿生型礦物基天然酶-納米酶級聯(lián)反應體系提供了新的啟示， 也可為后續(xù)生物分析與仿生催化領域的進一步研究提供參考.