無金屬黑色素納米酶用于肝纖維化治療

李婷婷， 岳彩鳳， 霍媛青， 紀慧芳， 張瑞平

（1. 山西醫(yī)科大學藥學院, 太原 030001;2. 山西醫(yī)科大學第三醫(yī)院, 山西白求恩醫(yī)院, 山西醫(yī)學科學院, 同濟山西醫(yī)院, 太原 030032;3. 山西省人民醫(yī)院放射科, 山西醫(yī)科大學第五醫(yī)院, 太原 030012）

肝纖維化是慢性肝病進展過程中出現(xiàn)的細胞外基質過度沉積的現(xiàn)象， 是多種慢性肝病的共同病理基礎. 如不加干預， 肝纖維化可進展為肝硬化， 甚至引起門靜脈高壓或肝癌［1］. 目前尚無臨床獲批的肝纖維化治療藥物或生物制劑， 主要通過肝細胞保護、 抗炎及抗氧化應激緩解肝損傷來逆轉肝纖維化［2］.因此， 開發(fā)一種安全且高效的干預措施對于治愈肝纖維化以及降低重癥肝病發(fā)病率具有重要意義.

酶是一類由活細胞產生的， 對底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質或RNA. 盡管天然酶具有催化效率高和底物專一等特點， 但因其本身存在制備純化成本高、 穩(wěn)定性差、 對反應環(huán)境敏感以及難以回收和再利用［3］等缺點， 人工仿生材料尤其是納米酶技術應運而生. 納米酶因其出色的酶催化性能和生物特性而成為生物醫(yī)學領域的研究熱點［4］. 迄今， 已有數(shù)百種納米材料被報道具有類酶催化特征. 其中， 金屬基納米酶因其明確、 穩(wěn)定和可調控的物化結構， 且經常表現(xiàn)多類酶活性的特點， 已成為納米酶家族的重要成員. 在過去的10年里發(fā)現(xiàn)了大量具有過氧化物酶（POD）、 氧化酶（OXD）、 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的多功能納米酶， 包括金屬氧化物、 金屬有機框架和單原子催化劑等［5］. 然而， 金屬基納米酶在高溫和極端pH條件下極易失活［6］. 更重要的是， 在生物醫(yī)學領域的應用中， 這些金屬基納米酶因難以代謝而長期滯留在人體中， 或在代謝過程中不可避免地會釋放金屬離子被人體吸收， 已引起人們對金屬基納米酶安全性的擔憂［7］.

黑色素是廣泛存在于動物、 植物、 細菌及真菌等自然生物中的一類黑色聚合色素［8～13］， 屬于內源性色素， 不僅具有優(yōu)良的生物相容性和生物代謝降解性， 而且具有輻射防護、 熱調節(jié)、 色素沉著及自由基清除等多種優(yōu)異的理化和生物學功能［14～18］. 黑色素有強大的類超氧化物歧化酶（SOD）樣和類過氧化氫酶（CAT）樣模擬活性， 可以通過清除過多的活性氧（ROS）來維持人和動物體內的氧化平衡［19～21］， 可進一步應用于各種氧化應激誘導疾病的炎癥治療中. 在自然界中， 黑色素的生物合成通常涉及黑色素細胞中酪氨酸或1，3，4-二羥基苯基丙氨酸（LDOPA）衍生的5，6-二羥基吲哚（DHI）單體的自由基氧化聚合［21］. 本文通過自氧化自由基聚合過程中DHI的酚基與醛之間的縮合反應構建了無金屬黑色素納米酶（MeNPs）［22］， 并探討了其類超氧化物歧化酶（SOD）樣和類過氧化氫酶（CAT）樣活性在肝纖維化中的抗炎和抗氧化作用； 進一步對該納米酶的肝纖維化治療效果和生物安全性進行了評估（Scheme 1）. 本文不僅為新型納米酶的制備提供了有價值的指導， 也為其在肝纖維化的治療領域開拓了新視角.

Scheme 1 Schematic diagram of the synthesis and mechanism of action of metal-free melaninnanoenzymes

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

5，6-二羥基吲哚（DHI）和苯甲醛（C7H6O）， 分析純， 上海泰坦科技有限公司； 無水乙醇， 分析純， 成都科隆化學試劑有限公司； IL-6 ELISA試劑盒和TNF-αELISA試劑盒， 武漢博士德生物工程有限公司；DCFH-DA 活性氧熒光探針、 細胞汁數(shù)試劑盒（CCK-8）、 PBS 緩沖液和DMEM 培養(yǎng)基， 北京索萊寶科技有限公司； WST-8超氧化物歧化酶檢測試劑盒和CAT檢測試劑盒， 上?？瓢┥锕?； 實驗用水均為去離子水， 利用ULUPURE 凈水系統(tǒng)獲得； 其余材料和試劑均來自不同的商業(yè)來源， 無需進一步純化.

LIBRA 200型透射電子顯微鏡（TEM）， 德國蔡司儀器公司； UV-6100型紫外-可見（UV-Vis）分光光度計， 上海美譜達儀器有限公司； ZS90型納米顆粒度電位儀（DLS）， 英國馬爾文公司； FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）， 天津港東公司； 石蠟包埋機、 SAKURA型自動組織脫水機和IX73型熒光顯微鏡， 日本OLYMPUS公司； JPSJ-605F型溶解氧計， 上海INESA科學儀器公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 MeNPs的合成 將98 mg DHI溶解于20 mL去離子水和20 mL乙醇中， 室溫下攪拌10 min； 隨后將97 mg苯甲醛溶解于20 mL乙醇并加入反應體系中， 劇烈攪拌下加入2.5 μL氨水溶液（氨的質量分數(shù)為28%～30%）， 然后置于65 ℃水浴中加熱. 反應溶液逐漸變成淡紫色， 隨后變?yōu)樯钭厣? 反應8 h后以16000 r/min的轉速離心5 min， 然后用去離子水洗滌3次， 得到MeNPs， 產率91.2%.

1.2.2 MeNPs 的結構表征 采用TEM 對MeNPs 的形貌尺寸進行了表征. 通過動態(tài)光散射光譜儀測量了MeNPs 的水合粒徑及電位. 利用紫外-可見分光光度計測量了MeNPs 的吸光度值， 用紅外光譜儀表征了MeNPs 的特征峰譜， 以驗證MeNPs 的制備. 將一定濃度MeNPs 分別置于水、 PBS和DMEM 3種不同的介質中， 并記錄粒徑隨時間的變化直至120 h， 觀察MeNPs的生理穩(wěn)定性.

1.2.3 MeNPs 催化活性氧的清除 選擇H2O2，， ABTS· 3種不同類型的反應物， 記錄MeNPs 納米酶（6.25～100 μg/mL）與各反應物清除量之間的關系. 將1.5 mg/mL 的MeNPs 加入到20 mL 玻璃瓶中， 于37 ℃攪拌， 然后加入2.5 mL液體石蠟， 用橡膠塞密封， 用兩根針管吹氣. 將N2氣（體積分數(shù)99.9%）吹入瓶中， 形成低氧環(huán)境. 用N2氣鼓泡后， 向混合物中分別注入0.5～100 mmol/L的H2O2. 使用溶解氧計測定生成氧濃度， 監(jiān)測15 min測定氧溶解度， 評價MeNPs分解H2O2的活性. H2O2分解反應遵循典型的Michaelis-Menten動力學：

式中：V［mol/（L·s）］為酶促反應速度；Vmax［mol/（L·s）］為最大酶促反應速度；S（mmol/L）為底物濃度；Km（mmol/L）為米氏常數(shù).

1.2.4 MeNPs抗氧化應激的體外細胞保護作用 使用標準的細胞計數(shù)試劑盒CCK-8檢測了LO2人正常肝細胞和AML12小鼠正常肝細胞的細胞活力. 觀察LO2和AML12細胞的生物活性與MeNPs濃度的關系； 將不同濃度的氧化應激誘導劑H2O2與LO2 和AML12 細胞共孵育4 h， 記錄細胞活性變化； 記錄MeNPs濃度變化（0～200 μg/mL）與LO2和AML12細胞活性恢復之間的關系. 用DCFH-DA對不同處理組的細胞進行標記后， 通過488 nm激發(fā)下的熒光成像檢測細胞內ROS水平.

1.2.5 MeNPs 的體內治療效果及抗炎作用 以40 只清潔級C57BL/6 野生型小鼠［3～4 周齡， 體重（18±2） g， 雄性）為主要研究對象， 將小鼠隨機分為4組： 正常對照組、 肝纖維化模型組（LF）、 肝纖維化模型PBS 治療組和肝纖維化模型MeNPs 治療組， 每組10只. 通過腹腔注射濃度為10 mg/mL 的硫代乙酰胺（TAA）溶液（0.1 mL/10 g）， 每周3 次， 持續(xù)4 周， 建立了肝纖維化的小鼠模型. 將PBS 溶液或MeNPs納米酶（MeNPs的劑量為5 mg/kg）分別經尾靜脈注入到肝纖維化小鼠體內， 每周2次， 治療過程持續(xù)4周. 檢測不同組小鼠血清中肝臟損傷指標ALT和AST的變化， 同時對不同處理組的小鼠肝組織進行H＆E 染色， 分析MeNPs 治療肝纖維化的療效. 此外， 通過IL-6 ELISA 試劑盒、 TNF-αELISA 試劑盒、 IL-1βELISA 試劑盒和CXCL1 ELISA 試劑盒檢測不同處理組小鼠血清中炎癥因子IL-6， TNF-α，IL-1β和趨化因子CXCL1的含量變化.

1.2.6 MeNPs 的生物安全性 將MeNPs 與金屬元素Mn 進行偶聯(lián)， 通過ICP-MS 測定金屬元素Mn 的含量， 并測定MeNPs在小鼠主要器官24 h的分布以及36～168 h在糞便與尿液中的代謝情況； 經靜脈注射MeNPs后， 觀察納米顆粒對正常小鼠的體重影響. 將小鼠分為未注射MeNPs的對照組和注射MeNPs的實驗組， 分別測定小鼠血清中血紅蛋白（HGB）、 平均紅細胞體積（MCV）、 平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、 平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、 紅細胞比容（HCT）、 白細胞（WBC）、 紅細胞（RBC）和血小板（PLT）的含量， 同時收集小鼠主要臟器（心、 肝、 脾、 肺和腎）， 經脫水、 浸蠟、 包埋及切片進行H＆E染色觀察， 評估MeNPs的生物安全性.

1.2.7 統(tǒng)計學分析 所有結果均以均數(shù)±標準差（S.D.）表示. 采用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計學意義分析，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001.

2 結果與討論

2.1 MeNPs的結構表征

以DHI為反應物， 通過自由基聚合反應合成了無金屬黑色素納米酶MeNPs. 由TEM照片［圖1（A）］可見， MeNPs 具有單分散球形結構， 分布均勻. 根據(jù)DLS 測得MeNPs 的水動力直徑為（91.3±2.6） nm［圖1（B）］， 與TEM表征結果一致； 而MeNPs在水、 PBS和DMEM中的Zeta電位分別為-17.6， -10.8和-13.5 mV， 帶負電的納米粒子可被動靶向肝臟［23］， 有利于MeNPs進入肝臟治療肝纖維化［圖1（C）］. 所制備的黑色素納米酶MeNPs 呈棕黑色， 紫外-可見光譜分析顯示， MeNPs 可吸收400～800 nm范圍的光［圖1（D）］. 隨著濃度的增加， MeNPs 的吸光度增強. 此外， 在FTIR 譜圖［圖1（E）］中， 與DHI 單體相比， MeNPs 在約2900 cm-1處出現(xiàn)一個新的特征峰， 這與縮合反應產生的—CH2拉伸振動有關， 苯環(huán)振動和取代峰分別位于1550和795 cm-1， 進一步證實了MeNPs的成功制備. 納米顆粒的穩(wěn)定性是其在體內應用的前提條件， 將MeNPs分散于水、 PBS和DMEM 3種不同介質中， 120 h內納米酶的粒徑基本保持不變， 證明了MeNPs在溶液中具有很高的生理穩(wěn)定性［圖1（F）］.

Fig.1 Characterization of MeNps（A） TEM image； （B） dynamic light scattering（DLS） result of MeNPs in water； （C） Zeta potentials of MeNPs in different solvents；（D） UV-Vis spectra of samples at varied concentrations， the inset figure is a digital photograph of samples at varied concentrations；（E） FTIR spectra of DHI and MeNPs； （F） size of MeNPs in different solvents.

2.2 MeNPs催化活性氧消除性能

MeNPs的酚羥基結構使其具備清除活性氧（ROS）的性能， 這對于緩解氧化應激所形成的肝纖維化十分有利. 通過類過氧化氫酶H2O2分解反應及類超氧化物歧化酶歧化反應等對MeNPs的活性氧清除性能進行了評價. 當MeNPs濃度為100 μg/mL時， 該納米顆粒可清除（78.8±0.4）%的H2O2［圖2（A）］和（61.6±0.9）%的［圖2（B）］. 同時， 利用2，2′-氮基-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）方法評估了MeNPs 的抗氧化性能， 以確定其生物催化活性. 結果表明， 當MeNPs 濃度為50 μg/mL 時， ABTS·的清除率已接近90%［圖2（C）］. H2O2是一種重要的活性氧， 具有很強的氧化能力， 也是突變的下游產物. 通過監(jiān)測MeNPs 在不同濃度H2O2溶液中溶解的O2濃度， 評價了MeNPs 分解H2O2的活性［圖2（D）］. 結果證實MeNPs納米酶具有CAT樣活性， 其不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的H2O2清除能力， 且具有濃度依賴性， 隨著H2O2濃度的增加， O2生成速率也隨之增加. 此外， H2O2分解反應遵循典型的Michaelis-Menten 動力學［24］， Michaelis-Menten 常數(shù)（Km）和最大反應速度（Vmax）分別為1.01 mmol/L 和8.49×10-6mol/（L·s）［圖2（E）和2（F）］. 以上結果均證實MeNPs具有廣譜的活性氧清除能力.

Fig.2 MeNPs catalyze the elimination of reactive oxygen species

2.3 MeNPs抗氧化應激的體外細胞保護作用

為了驗證MeNPs 對LO2 人正常肝細胞和AML12 小鼠正常肝細胞的細胞毒性， 采用CCK-8 測定了LO2 和AML12 細胞的細胞活力. 結果表明， 隨著MeNPs 濃度的增加（0～200 μg/mL）， LO2 和AML12 細胞的生物活性仍維持在90%～100%之間［圖3（A， A′）］， 可見MeNPs在細胞水平上的生物安全性良好.由圖3（B， B′）可見， 當不同濃度的氧化應激誘導劑H2O2（0～800 μmol/L）與細胞共孵育4 h 時， LO2 和AML12細胞的細胞活力均呈明顯下降， 其下降程度與H2O2的濃度呈正相關. 由圖3（C， C′）可見， 隨著無金屬黑色素納米酶MeNPs濃度的增加， LO2和AML12細胞的細胞活性逐漸恢復， 且當MeNPs濃度為200 μg/mL時， LO2和AML12細胞的活性均接近正常對照組. 隨后， 利用熒光探針2，7-二氯二氫熒光素二醋酸酯（DCFH-DA）檢測了細胞內ROS水平. 由圖3（D）可見， MeNPs本身不會增加細胞內ROS水平，并且可以顯著抑制H2O2產生的ROS. 綜上所述， MeNPs對H2O2誘導的氧化應激具有細胞保護作用.

2.4 MeNPs的體內治療效果

鑒于無金屬黑色素納米酶MeNPs具有優(yōu)良的清除ROS性能， 進一步采用C57BL/6野生型小鼠肝纖維化模型驗證了MeNPs減慢肝纖維化進程的效果. 首先， 通過腹腔注射濃度為10 mg/mL的硫代乙酰胺（TAA）溶液（0.1 mL/10 g）， 每周3 次， 持續(xù)4 周， 建立了肝纖維化的小鼠模型. 將PBS 溶液或MeNPs納米酶（MeNPs 的劑量為5 mg/kg）分別經尾靜脈注入到肝纖維化小鼠體內， 每周2 次， 治療過程持續(xù)4周. ALT和AST是檢測肝損傷的代表性指標. 與正常小鼠相比， 肝纖維化小鼠的ALT和AST水平要高得多. 經PBS治療后無明顯緩解， 而鼠尾靜脈注射MeNPs納米酶后， 肝纖維化小鼠的ALT和AST水平顯著降低， 說明肝功能得到恢復（圖4）， 驗證了MeNPs對肝纖維化的顯著治療效果. 同時， 對不同處理組的肝組織進行H＆E染色， 為MeNPs的治療效果提供了更直接的證據(jù). 在經PBS處理的肝纖維化小鼠的肝組織中， 可以觀察到炎癥細胞浸潤和肝實質細胞壞死區(qū)域無明顯變化. 相反， MeNPs可有效減輕肝纖維化， 炎癥細胞浸潤和肝實質細胞壞死區(qū)域減少圖5. 以上結果表明， MeNPs納米酶治療肝纖維化的療效顯著.

Fig.4 Serum levels of AST(A) and ALT(B) under different conditions

Fig.5 H＆E staining of liver tissues

2.5 MeNPs的體內抗炎作用

當肝臟受到各種致病因子刺激時， 相關炎癥細胞可分泌促炎細胞因子如IL-6， TNF-α， IL-1β和趨化因子CXCL1等， 這些因子在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用. 因此， 為了研究MeNPs的體內抗炎作用， 檢測了肝纖維化小鼠血清中炎癥因子的水平. ELISA分析表明， 與正常小鼠相比， 肝纖維化小鼠血清中IL-6， TNF-α， IL-1β和CXCL1的水平顯著升高［圖6（A）～（D）］， 經靜脈注射PBS溶液后， 炎癥因子水平無明顯變化. 相比之下， 炎癥因子被MeNPs顯著抑制. 以上結果表明， MeNPs可有效減輕炎癥反應.

Fig.6 Anti-inflammatory effect of MeNPs in vitroLevels of IL-6（A）， TNF-α（B）， IL-1β（C） and CXCL1（D） secreted by mice with liver fibrosis after treatment with PBS and MeNPs； data are represented as mean±SD； *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001.

2.6 MeNPs的生物安全性

MeNPs納米酶的安全性對其在生物體內的應用評估非常重要. MeNPs注射后2， 4和24 h在小鼠主要器官內的生物分布分析如圖7（A）所示. MeNPs主要分布在肝臟， 這為MeNPs進入肝臟充分發(fā)揮抗炎抗氧化效果， 抑制肝纖維的進展提供了前提條件. 進一步收集小鼠的糞便和尿液， 對其中MeNPs的含量進行了量化分析. 研究結果表明， 小鼠注射MeNPs后的30～168 h內， 小鼠糞便中MeNPs的排泄量由11.5%逐漸增加到41.5%， 小鼠尿液中MeNPs 的排泄量由3.8%逐漸增加到14.5%［圖7（B）］， 說明MeNPs 在7 d 內主要通過肝臟與腎臟進行代謝. 同時， 對小鼠進行了20 d 的行為和體重監(jiān)測， 結果表明， 注射MeNPs 納米顆粒的小鼠， 飲食及精神狀態(tài)良好， 未觀察到明顯的行為異常， 體重穩(wěn)定增長［圖7（C）］. 血液生化檢查結果表明， 與對照組相比， 體內給藥MeNPs對小鼠血紅蛋白（HGB）、 平均紅細胞體積（MCV）、 平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、 平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、 紅細胞比容（HCT）、 白細胞（WBC）、 紅細胞（RBC）和血小板（PLT）均無顯著影響［圖7（D）］. 對主要臟器進行H＆E染色所得結果顯示， MeNPs未對小鼠的心、 肝、 脾、 肺和腎造成明顯的組織病理改變， 且主要組織中未見炎性細胞［圖7（E）］.

Fig.7 Biosafety of MeNPs（A） Biodistribution of MeNPs in mice（n=3） at 2， 4， and 24 h after injection； （B） the accumulative MeNPs levels in feces and urine（n=3）； the feces and urine were collected from 30 to 168 h post MeNPs injection； （C） body weight changes of mice（n=3）20 d after tail vein injection of MeNPs； （D） blood routine examination results of mice treated with saline（control） and MeNPs；compared with the control group， all the parameters in the MeNPs treated groups did not show any significant differences，indicating that the MeNPs do not cause obvious infection and inflammation in the treated mice； （E） H＆E stained images of major organs of mice.

以上結果表明， MeNPs具有低毒性、 良好的安全性和生物相容性， 為其后續(xù)臨床應用轉化奠定了理論基礎.

3 結論

以DHI為單體構建了無金屬黑色素納米酶MeNPs， 驗證其具有類超氧化物歧化酶（SOD）和類過氧化氫酶（CAT）活性， 并表現(xiàn)出極強的抗氧化能力和極高的催化活性. 體外細胞實驗證實MeNPs具有良好的生物相容性及清除活性氧的能力. MeNPs在肝纖維化小鼠模型中也表現(xiàn)出顯著的抗炎和抗氧化作用， 通過肝臟損傷指標表明MeNPs可逆轉肝纖維化的病理進展. 此外， 血液生化檢查及主要臟器H＆E染色均證實了MeNPs優(yōu)良的生物安全性. 綜上所述， MeNPs具有出色的抗氧化能力， 可在細胞抗氧化防護以及肝纖維化的體內治療方面發(fā)揮重要作用. 該新型納米酶材料的構建不僅為設計多功能黑色素納米材料開拓了新視野， 同時也為臨床干預肝纖維化提供了一種安全、 有效的治療策略.