基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的比率型發(fā)光傳感器定量檢測(cè)生物樣本中的多巴胺

朱潤(rùn)芝， 王 怡， 納佳雪， 曹樂(lè)樂(lè)， 張 輝， 王迎輝， 孟 哲

（寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 省部共建煤炭高效利用與綠色化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750021）

多巴胺（DA）是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)， 可調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能［1，2］. 多巴胺水平異常導(dǎo)致不同的神經(jīng)性系統(tǒng)疾?。?］， 如帕金森癥［4］、 精神分裂癥［5］和抑郁癥［6］等. 因此， 建立一種靈敏度高、 選擇性好、 可快速檢測(cè)多巴胺的方法對(duì)神經(jīng)生理學(xué)及臨床疾病診斷具有重要意義.

傳統(tǒng)的多巴胺檢測(cè)方法主要包括電化學(xué)分析法［7，8］、 毛細(xì)管電泳法［9］、 熒光生物傳感法［10］和高效液相色譜法［11］等. 其中， 應(yīng)用熒光量子點(diǎn)檢測(cè)DA 已有諸多報(bào)道， 如Wang 等［12］報(bào)道了氮摻雜碳量子點(diǎn)（N-CQDs）熒光探針用于DA的檢測(cè)； Chen等［13］設(shè)計(jì)了一種基于適體功能化的MoS2納米片和MoS2量子點(diǎn)作為熒光探針， 用于DA的檢測(cè). 然而， 單一熒光信號(hào)易受儀器效率、 探針濃度等環(huán)境因素的干擾，甚至?xí)a(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果［14］. 比率型熒光分析法是通過(guò)測(cè)定兩個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度之比實(shí)現(xiàn)的， 可以有效減少甚至消除環(huán)境變化帶來(lái)的影響. An等［15］設(shè)計(jì)了碳點(diǎn)（CD）和7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的雙發(fā)射比率熒光傳感系統(tǒng)， 以快速檢測(cè)DA. 然而， 熒光檢測(cè)不可避免生物樣品基質(zhì)的自發(fā)熒光和散射光的干擾， 從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度［16，17］. 因此， 開(kāi)發(fā)一種無(wú)自發(fā)熒光和外部干擾的比率型發(fā)光傳感器具有重要意義.

長(zhǎng)余輝材料通過(guò)陷阱儲(chǔ)存能量， 在停止激發(fā)后， 可在紫外、 可見(jiàn)及近紅外區(qū)持續(xù)發(fā)光數(shù)分鐘、 數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天［18］； 因其無(wú)需原位激發(fā)， 可有效避免生物基質(zhì)中的自發(fā)熒光和散射光干擾［19～21］， 在生物傳感和生物成像方面顯示出巨大的優(yōu)勢(shì). Guo 等［22］報(bào)道了一種基于綠色發(fā)射Zn2GeO4∶Mn2+和紅色發(fā)射ZnGaGeO4∶Cr3+的比率型傳感器， 用于檢測(cè)谷物中的赭曲霉毒素A； Yan等［23］報(bào)道了一種基于ZnGa2O4∶Cr0.0001雙發(fā)射長(zhǎng)余輝納米粒子的比率型發(fā)光適配體傳感器， 用于食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定. 然而，基于長(zhǎng)余輝的比率型發(fā)光傳感器定量檢測(cè)生物樣本中的多巴胺目前鮮見(jiàn)報(bào)道.

本文制備了一種以Sr2.992Mg0.9Si2O8為發(fā)光基質(zhì)， Eu2+和Mn2+為發(fā)光中心， 具有發(fā)光性能優(yōu)異的雙發(fā)射長(zhǎng)余輝納米粒子Sr2.992Mg0.9Si2O8∶0.008Eu2+，0.10Mn2+（SEM）. SEM和酪氨酸酶（Tyrosinase， TYR）共價(jià)偶聯(lián)， 構(gòu)建了具有雙發(fā)射的比率型發(fā)光傳感器（SEM-TYR）. 該發(fā)光傳感器在波長(zhǎng)為360 nm紫外光的激發(fā)下， 有460和680 nm兩個(gè)發(fā)射峰， Eu2+摻雜的460 nm藍(lán)色發(fā)射峰對(duì)DA濃度無(wú)顯著變化， 而Mn2+摻雜的680 nm的紅色發(fā)射峰被DA猝滅. 當(dāng)DA存在時(shí)， SEM-TYR中的TYR將目標(biāo)物DA氧化生成多巴醌，依據(jù)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electron transfer， PET）原理， 能量供體長(zhǎng)余輝的電子轉(zhuǎn)移至能量受體多巴醌， 致使紅色余輝（680 nm）猝滅. 因此， SEM-TYR 在460 和680 nm 處的雙發(fā)射余輝猝滅比值Δ（I680/I460）與DA 濃度呈良好的線性關(guān)系. 比率型余輝檢測(cè)方法可以有效避免自發(fā)熒光干擾和外部干擾， 從而提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度， 實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜生物樣品中多巴胺的定量檢測(cè). 本研究為多巴胺檢測(cè)方法提供了新思路， 同時(shí)也拓寬了長(zhǎng)余輝材料在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

MgO， Mn（CH3COO）2·4H2O， NaOH， NaCl， C8H17N3（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（純度>98%，上海麥克林生化科技有限公司）； SrCO3， SiO2和Eu2O3（純度>99%， 上海麥克林生化科技有限公司）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、 二乙醇酸酐、 硅酸四乙酯（TEOS）、N，N′-二甲基甲酰胺（DMF）和H3BO3［純度>99%， 阿拉丁試劑（上海）有限公司］； 多巴胺（DA）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自麥克林生化科技有限公司；酪氨酸酶（Tyrosinase， TYR）（1120 U/mg DW）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司. 實(shí)驗(yàn)室用水為超純水［電阻率>18.2 MΩ·cm， 頗爾富迪生物分析儀器（上海）有限公司］.

JEM-2100F型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）； SU8020型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）； D8 ADVANCE A25 型X 射線衍射儀（德國(guó)布魯克AXS 有限公司）； F-7100 型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）； Nicolet iS50型紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）； UV-3600型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）； 1600 ℃高溫管式爐（鄭州科佳電爐有限公司）.

1.2 比率型生物傳感器的制備

1.2.1 長(zhǎng)余輝納米粒子的制備 采用高溫固相法合成Sr2.992Mg0.9Si2O8∶0.008Eu2+，0.10Mn2+（SEM）長(zhǎng)余輝納米粒子. 按照化學(xué)計(jì)量比稱取SrCO3， SiO2， MgO， Eu2O3和Mn（CH3COO）2·4H2O粉末作為起始反應(yīng)物， 并添加反應(yīng)物總摩爾量10%的H3BO3作為助熔劑. 在瑪瑙研缽中將粉末充分研磨后轉(zhuǎn)移至瓷舟中， 置于高溫管式爐內(nèi)于氮?dú)夥諊拢?以2 ℃/min 程序升溫至1250 ℃， 煅燒3 h. 分別對(duì)Eu2+和Mn2+的摻雜量進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)， 制備得到系列Sr3-xMg0.85Si2O8∶xEu2+，0.15Mn2+（x=0.002， 0.005， 0.008，0.010， 0.150）和Sr2.992Mg1-ySi2O8∶0.008Eu2+，yMn2+（y=0.10， 0.15， 0.20）長(zhǎng)余輝納米粒子.

1.2.2 長(zhǎng)余輝納米粒子SEM的表面功能化 將300 mg SEM超聲分散在20 mL超純水中， 劇烈攪拌下依次加入50 μL 1.5 mol/L NaOH， 100 μL APTES 和250 μL TEOS， 攪拌反應(yīng)12 h. 將所得產(chǎn)物離心分離，用超純水洗滌3次， 經(jīng)真空干燥得到氨基功能化的長(zhǎng)余輝納米粒子（SEM-NH2）. 再將200 mg SEM-NH2分散在DMF中， 加入42.7 mg二乙醇酸酐， 室溫下攪拌反應(yīng)12 h. 將所得產(chǎn)物離心分離， 用超純水洗滌3次， 經(jīng)真空干燥得到羧基功能化的長(zhǎng)余輝納米粒子（SEM-COOH）.

1.2.3 比率型SEM-TYR 傳感器的制備 將10 mg SEM-COOH， 20 mg EDC 和10 mg NHS 分散于3 mL PBS 緩沖溶液（0.1 mol/L， pH=6.0）中， 攪拌30 min， 用2 mol/L NaOH 將pH 調(diào)至7.4， 再加入10 mg TYR， 于室溫孵育2 h. 將所得產(chǎn)物離心分離， 用PBS 緩沖溶液洗滌3 次， 收集沉淀， 得到SEM-TYR 的傳感器， 最后分散在2 mL超純水中， 得到濃度為5 mg/mL的SEM-TYR溶液， 于4 ℃下保存， 備用.

1.2.4 比率型余輝猝滅檢測(cè)多巴胺 配制10 mmol/L的DA儲(chǔ)備液， 用PBS緩沖溶液稀釋DA儲(chǔ)備液至不同濃度， 將200 μL PBS 緩沖溶液（pH=6.8， 10 mmol/L）、 100 μL 1.5 mg/mL 的SEM-TYR 溶液和不同濃度的DA 在37 ℃下孵育2 h. 使用熒光分光光度計(jì)記錄余輝信號(hào)的變化， 狹縫寬度均為10 nm， 電壓為500 V， 延遲時(shí)間為100 μs， 激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm， 雙發(fā)射波長(zhǎng)為460和680 nm， 平行測(cè)定5次.

1.2.5 選擇性考察 分別配制10 mmol/L的金屬離子（Na+， Ca2+， K+）溶液和20 mmol/L的生物活性物質(zhì)尿酸（UA）、 抗壞血酸（AA）及葡萄糖（Glu）， 參照1.2.4節(jié)方法考察傳感器的選擇性.

1.2.6 生物樣本中多巴胺的檢測(cè) 血液、 尿液樣本均取自寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院. 本研究已得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 參與者知情同意. 在室溫下令血液自然凝固10～20 min， 以10000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min， 收集上層清液得到血清. 用無(wú)菌管收集尿液， 以10000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min， 取上層清樣； 用無(wú)菌管收集汗液， 以10000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min， 取上層清樣. 血清、 汗液及尿液樣品均用PBS 磷酸鹽緩沖溶液（10.0 mmol/L， pH=6.8）稀釋100倍. 人血液、 尿液和汗液中多巴胺含量檢測(cè)按照1.2.4節(jié)方法進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)及形貌表征

采用高溫固相法在Sr3MgSi2O8基質(zhì)中共摻雜發(fā)光中心Eu2+和Mn2+. 依據(jù)Sr3-xMg0.85Si2O8∶xEu2+，0.15Mn2+（x=0.002， 0.005， 0.008， 0.010， 0.015）和Sr2.992Mg1-ySi2O8∶0.008Eu2+，yMn2+（y=0.10， 0.15，0.20）對(duì)Eu2+和Mn2+的摻雜量進(jìn)行優(yōu)化. 如圖1（A）所示， 當(dāng)x=0.008時(shí)， 460 nm處的余輝發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大； 如圖1（B）所示，y=0.10 時(shí)， 460 和680 nm 處的熒光強(qiáng)度均達(dá)到最大. 即Sr2.992Mg0.9Si2O8∶0.008Eu2+，0.10Mn2+為最佳制備化學(xué)計(jì)量比的長(zhǎng)余輝納米粒子.

Fig.1 Emission spectra of SEM with different doping contents of Eu2+(A) and Mn2+(B)

根據(jù)文獻(xiàn)［24～26］報(bào)道， 在Sr3MgSi2O8中Sr2+存在3 種不同格位， 分別為十配位的Sr（I）、 八配位的Sr（II）和九配位的Sr（III）. Mg2+和Si4+的配位數(shù)分別為6 和4. 其中Sr2+， Mg2+和Si4+的離子半徑分別為0.101， 0.072 和0.040 nm， 而摻雜元素Eu2+和Mn2+的離子半徑分別為0.112 和0.066 nm. 由于Eu2+與Sr2+， Mn2+與Mg2+半徑相似， 當(dāng)Eu2+， Mn2+離子摻入Sr3MgSi2O8基質(zhì)時(shí)， 將分別取代Sr2+和Mg2+的格位. 如圖2（A）所示， 所制備SEM 的X 射線衍射譜圖的所有衍射峰與Sr3MgSi2O8標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#10-0075）基本一致， 表明其具有較好的結(jié)晶度， 屬四方晶系. 圖2（B）中透射電子顯微鏡照片（TEM）顯示， SEM為海膽狀結(jié)構(gòu)， 其海膽核的分布小于500 nm. 由圖2（C）中X射線能譜（EDS）元素分布圖結(jié)果可見(jiàn)， SEM長(zhǎng)余輝納米粒子骨架中元素Sr， Mg， Si， O， Mn 和Eu 呈均勻分布， 表明Eu2+和Mn2+已摻雜到基質(zhì)Sr2.992Mg0.9Si2O8的晶格中.

Fig.2 XRD pattern(A), TEM image(B) and EDS element mapping analysis(C) of SEM

2.2 長(zhǎng)余輝粒子的余輝發(fā)光光譜性能

如圖3（A）所示， SEM 在290 和360 nm 處有2 個(gè)激發(fā)峰， 由于DA 在280 nm 處有紫外吸收， 與長(zhǎng)余輝材料290 nm激發(fā)有較大重疊， 產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)而猝滅長(zhǎng)余輝材料， 因此選擇360 nm作為激發(fā)條件. 在360 nm 的激發(fā)下， SEM 出現(xiàn)2 個(gè)發(fā)射峰， 分別位于460 和680 nm. 460 nm 處的發(fā)射峰是由Eu2+的4f65d1→ 4f7（S7/2）躍遷所致［27］， 680 nm處的發(fā)射峰是由Mn2+的4T1（4G） →6A1（6S）躍遷所致［28］. 由圖3（B）所示余輝衰減曲線可以看出， 在用365 nm紫外燈照射10 min后， 所制備的SEM在2個(gè)波長(zhǎng)處的余輝發(fā)光均可持續(xù)600 s以上， 證明SEM具有良好的余輝發(fā)光性能.

Fig.3 Excitation spectrum(a), emission spectrum(b) of SEM and UV absorption(c) of DA(A),persistent-luminescence decay curves of SEM nanoparticles monitored at 680 and 460 nm after 365 nm UV light illumination for 5 min(B)

2.3 SEM-TYR生物傳感器的表征

SEM與TYR的偶聯(lián)通過(guò)SEM-COOH的羧基與TYR的伯胺之間的酰胺縮合來(lái)實(shí)現(xiàn). 采用傅里葉變換紅外光譜對(duì)SEM 的氨基化和羧基化進(jìn)行了分析. 如圖4（A）所示， 3369 cm-1處的特征紅外吸收峰歸屬于N—H 的伸縮振動(dòng)峰， 1660 cm-1處的吸收峰歸屬于C=O 伸縮振動(dòng)峰， 以上結(jié)果表明SEM-COOH確已制備. 如圖4（B）所示， 利用紫外吸收光譜觀察了SEM 與TYR 的偶聯(lián)， 偶聯(lián)物（即SEM-TYR）在270 nm 處出現(xiàn)了一個(gè)典型的TYR 吸收峰， 證明TYR 已偶聯(lián). 此外， 通過(guò)SEM-TYR 洗脫前后紫外吸收峰強(qiáng)度變化得出偶聯(lián)效率為76.28%. 同時(shí)觀察到在198 nm處發(fā)生藍(lán)移， 可能歸因于SEM—COOH和—OH之間的氫鍵作用.

為了驗(yàn)證酶偶聯(lián)后催化活性的變化， 進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn). 首先， 將SEM 與TYR 簡(jiǎn)單混合（SEM+TYR）， 并將SEM+TYR與傳感器SEM-TYR分別加入DA（10 μmol/L）后在相同條件下進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果如圖4（C）所示. SEM+TYR 在680 nm 處的磷光強(qiáng)度僅下降12%， 下降值明顯低于傳感器SEM-TYR. 因此， 磷光猝滅的顯著差異主要原因是TYR與SEM偶聯(lián)后催化活性的增加.

2.4 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移增強(qiáng)余輝猝滅機(jī)制

酶具有專一催化特性， 多巴胺在酪氨酸酶催化下生成多巴醌［29］， 為了探討SEM/多巴醌體系導(dǎo)致余輝猝滅的機(jī)理進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn). 如圖5（A）所示， 多巴胺和多巴醌在300～800 nm范圍內(nèi)均無(wú)吸收， 因此排除內(nèi)濾效應(yīng)和能量共振轉(zhuǎn)移. 當(dāng)SEM-TYR 受到360 nm 紫外光激發(fā)時(shí)， Eu2+摻雜的460 nm 的藍(lán)色發(fā)射峰的強(qiáng)度對(duì)DA 濃度的變化無(wú)顯著改變， 而Mn2+摻雜的680 nm 的紅色發(fā)射峰的強(qiáng)度被DA 猝滅. 從圖5（B）可以觀察到， 隨著DA的濃度從0.1， 0.5 μmol/L增加到10 μmol/L， 680 nm處信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生不同程度地猝滅， 而460 nm 處的信號(hào)強(qiáng)度基本保持不變， 即SEM-TYR 在460 和680 nm 處雙發(fā)射余輝猝滅比值Δ（I680/I460）與DA濃度呈良好的線性關(guān)系， 從而建立比率型發(fā)光傳感器.

Fig.5 UV-Vis spectra of DA and the TYR catalyzed DA oxidization product(A), emission spectra of SEM-TYR, SEM-TYR+ 0.1 μmol/L DA, SEM-TYR+ 0.5 μmol/L DA, SEM-TYR+10 μmol/L DA(B), and PET system for the detection of DA(C)

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移增強(qiáng)余輝猝滅機(jī)制如圖5（C）所示， 發(fā)光傳感器SEM-TYR 的構(gòu)建是通過(guò)功能化SEM 與TYR 的共價(jià)偶聯(lián)， 其中460 和680 nm 處的余輝強(qiáng)度均無(wú)顯著變化. 當(dāng)目標(biāo)物DA 存在時(shí)， TYR氧化DA為多巴醌， 多巴醌作為電子受體可猝滅熒光［30］. 當(dāng)SEM-TYR傳感器在360 nm激發(fā)停止后， 發(fā)光中心Eu2+的激發(fā)態(tài)電子從4f7（S7/2）回落至軌道4f65d1過(guò)程產(chǎn)生480 nm的藍(lán)色余輝， 而Mn2+的激發(fā)態(tài)電子從6A1（6S）軌道回落至4T1（4G）軌道過(guò)程中， 部分電子轉(zhuǎn)移至電子受體多巴醌， 導(dǎo)致680 nm發(fā)光強(qiáng)度減弱， 最終實(shí)現(xiàn)SEM-TYR余輝猝滅比值Δ（I680/I460）與DA濃度呈良好的相關(guān)性. 基于上述推測(cè)， SEM-TYR向多巴醌的能量轉(zhuǎn)移是通過(guò)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)的.

2.5 SEM-TYR在不同干擾條件下的發(fā)光性能

為了消除單發(fā)射峰強(qiáng)度受實(shí)驗(yàn)參數(shù)的干擾， 分別考察了SEM-TYR 的濃度與測(cè)試電壓對(duì)460 和680 nm處的發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光強(qiáng)度比值（I680/I460）的影響. 如圖6所示， 隨著SEM-TYR濃度和測(cè)試電壓的增加， 460和680 nm處的發(fā)光強(qiáng)度均逐漸增大， 而發(fā)光強(qiáng)度比值（I680/I460）仍然保持恒定， 表明比率型發(fā)光傳感器SEM-TYR可有效消除外部干擾.

Fig.6 Emission(excitation at 360 nm) spectra of SEM with different concentrations(A), effect of the concentrations of SEM on the luminescence intensity of 460 nm and 680 nm and the luminescence ratio I680/I460(B), emission(excitation at 360 nm) spectra of SEM at different test voltage(2 mg/mL)(C), and effect of the test voltage on the luminescence intensity of 460 nm and 680 nm and the luminescence ratio(I680/I460)(D)

2.6 DA檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了提高檢測(cè)多巴胺的靈敏度， 對(duì)pH值和孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化. 將SEM-TYR在不同pH值的緩沖溶液中對(duì)2 μmol/L DA 進(jìn)行測(cè)定. 如圖7（A）所示， 隨著PBS 緩沖溶液pH 值的增大， DA 引起的余輝猝滅比值Δ（I680/I460）在pH=6.8時(shí)達(dá)到最大， 此結(jié)果與人體正常的生理pH值相接近， 然后逐漸減小. 如果pH>7.5， 多巴胺在堿性溶液中處于酚酮形態(tài)和胺形態(tài)， 這兩個(gè)形態(tài)中的O—H 和N—H 鍵可以與其它帶有親電性的官能團(tuán)反應(yīng)， 極易發(fā)生聚合反應(yīng)生成聚多巴胺而不利于DA的準(zhǔn)確檢測(cè)［31］， 因此選擇檢測(cè)DA 最佳pH 值為6.8. 如圖7（B）所示， SEM-TYR 在pH=6.8 的緩沖溶液中對(duì)1.5 μmol/L DA 進(jìn)行測(cè)定， 隨著孵育時(shí)間的增加， 2 h時(shí)余輝猝滅比值Δ（I680/I460）趨于穩(wěn)定， 因此選擇2 h為最佳孵育時(shí)間. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， DA測(cè)定的最佳實(shí)驗(yàn)條件為pH=6.8， 孵育時(shí)間為2 h.

2.7 SEM-TYR比率型發(fā)光傳感器定量檢測(cè)多巴胺

在最佳檢測(cè)條件下， 采用SEM-TYR比率型發(fā)光傳感器檢測(cè)了不同濃度的DA. 如圖8（A）所示， 隨著DA濃度的增加， 680 nm處的余輝強(qiáng)度逐漸減弱， 而460 nm處的余輝強(qiáng)度基本保持不變. 在0.2～10 μmol/L 的范圍內(nèi)， Δ（I680/I460）與DA 濃度呈良好的線性關(guān)系［圖8（B）］， 線性方程為Δ（I680/I460）=0.02912cDA+0.1478， ΔR2=0.9965， 檢出限為40 nmol/L.

Fig.8 Phosphorescence spectra(A) and corresponding linear calibration curve(B) of SEM-TYR with various concentrations of DA

由表1可見(jiàn)， 與文獻(xiàn)［32～36］報(bào)道的DA檢測(cè)方法相比， 本文方法線性范圍較寬、 檢測(cè)限較低， 在無(wú)背景干擾下不但能檢測(cè)人體血液和尿液中的多巴胺， 還能檢測(cè)無(wú)損樣品汗液中的多巴胺.

Table 1 Comparative analysis of methodologies for quantitative determination of dopamine

2.8 生物樣本中多巴胺的定量檢測(cè)

為了驗(yàn)證該方法在實(shí)際生物樣本檢測(cè)中是否具有可行性和準(zhǔn)確性， 將其應(yīng)用于不同生物樣本（血清、 尿液和汗液）， 通過(guò)在生物樣品中添加DA標(biāo)準(zhǔn)溶液（1， 10， 20 μmol/L）評(píng)價(jià)了該發(fā)光傳感器的適用性. 如表2所示， 實(shí)際血清樣本中DA的加標(biāo)回收率在94.8%～104.0%之間， 尿液樣本中DA的加標(biāo)回收率在91.3%～101.6%之間， 汗液樣本中DA的加標(biāo)回收率在97.4%～105.2%之間， RSD＜6.8%（n=10）， 表明該方法準(zhǔn)確可靠， 可用于實(shí)際樣品中DA的高靈敏檢測(cè).

Table 2 Recoveries(%) and precisions(RSD %, n=10) of dopamine in three real samples

2.9 重復(fù)性、 穩(wěn)定性及選擇性分析

在相同條件下制備7 個(gè)批次SEM-TYR 傳感器用于檢測(cè)相同濃度的DA， 記錄460 和680 nm 處的磷光光譜， 計(jì)算Δ（I680/I460）值. 如圖9（A）所示， 7個(gè)批次傳感器Δ（I680/I460）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～2.3%之間， 表明該傳感器具有良好的重復(fù)性. 為了考察SEM-TYR 傳感器的穩(wěn)定性， 用同一批次SEM-TYR傳感器每日檢測(cè)同濃度的DA， 并記錄460 和680 nm 處的磷光強(qiáng)度. 如圖9（B）所示， 連續(xù)7 日測(cè)定Δ（I680/I460）下降約0.5%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～2.5%之間， 表明該生物傳感器具有優(yōu)異的穩(wěn)定性.

Fig.9 Reproducibility(A), stability(B) and selectivity(C) experiments of SEM-TYR

為了確定該發(fā)光傳感器SEM-TYR 對(duì)DA 的選擇性， 對(duì)多種干擾金屬離子和其它生物活性物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè). 在相同實(shí)驗(yàn)條件下， 分別加入10 μmol/L DA、 10 mmol/L 金屬離子（Na+， K+， Ca2+）以及20 mmol/L生物活性物質(zhì)尿酸（UA）、 抗壞血酸（AA）和葡萄糖（Glu）. 如圖9（C）所示， 只有DA存在的情況下觀察到Δ（I680/I460）的明顯變化， 而其它干擾物均未引起Δ（I680/I460）發(fā)生明顯變化， 說(shuō)明該生物傳感器對(duì)DA具有高靈敏度和高選擇性.

3 結(jié)論

構(gòu)建了一種基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的比率型發(fā)光傳感器SEM-TYR， 用于復(fù)雜生物樣品中多巴胺的定量檢測(cè). SEM-TYR傳感器對(duì)DA的檢出限為40 nmol/L， 線性范圍為0.2～10 μmol/L. 對(duì)實(shí)際生物樣品人血清、 尿液及汗液中DA的定量檢測(cè)具有較好的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性. 該SEM-TYR發(fā)光傳感器有望為開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)便、 靈敏度高、 避免背景干擾和外部干擾的多巴胺檢測(cè)提供新思路.