連續(xù)配施有機(jī)肥對茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能類群的影響

關(guān)鍵詞：茶園土壤；有機(jī)肥配施化肥；細(xì)菌多樣性；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；細(xì)菌功能類群

中圖分類號：S154.3；S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2959-15 doi：10.11654/jaes.2023-1067

茶樹是典型葉用經(jīng)濟(jì)作物，一年中新梢的多輪次采摘會帶走大量養(yǎng)分，因而比其他農(nóng)作物對養(yǎng)分的需求量更大。茶農(nóng)為了提高茶葉產(chǎn)量，大量化肥被施入茶園土壤，為茶樹生長補(bǔ)充大量速效養(yǎng)分，迅速提升茶葉產(chǎn)量[1-2]。據(jù)國家茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[3]，全國茶園化肥養(yǎng)分平均用量為678 kg·hm^-2（高施肥茶園化肥用量可達(dá)1 041 kg·hm^-2），提供茶樹全年90%的氮、78%的磷和75%的鉀，茶園化肥過量施用比例超過30%，且施肥主要以復(fù)合肥、尿素等速效化肥為主。長期過量施用化肥導(dǎo)致茶園土壤出現(xiàn)酸化程度加劇、板結(jié)和透氣性差、養(yǎng)分不均衡退化、微生物多樣性及功能下降等一系列問題[4-5]，過量化肥還會以淋洗、地表徑流、氨揮發(fā)及N₂O排放等形式進(jìn)入環(huán)境[6-7]，造成肥料浪費(fèi)和環(huán)境污染。有機(jī)肥配施化肥是茶園化肥減施的重要途徑，可有效緩解茶園單施化肥引起的土壤質(zhì)量下降問題[8]，且能夠明顯提高茶葉品質(zhì)。有研究表明，有機(jī)肥替代部分化肥可顯著提高茶園土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量，提高土壤酶活性，降低養(yǎng)分徑流損失，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)降低茶園土壤溫室氣體排放量[9-11]。但連續(xù)施用有機(jī)肥對土壤微生物群落的影響仍有待明確。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，幾乎參與了所有生態(tài)系統(tǒng)中土壤、碳、氮、磷、硫、鐵等養(yǎng)分的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[12]，是表征生態(tài)系統(tǒng)健康和恢復(fù)水平的敏感性指標(biāo)[13]。有研究表明，在地球的各個(gè)生物群落中，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性與一系列的生態(tài)系統(tǒng)功能，如營養(yǎng)循環(huán)、分解和植物生產(chǎn)力有正相關(guān)[14]，且能夠迅速響應(yīng)土壤環(huán)境的變化。施肥作為一項(xiàng)重要的農(nóng)業(yè)措施，會加速土壤退化進(jìn)程，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成產(chǎn)生影響。近年來的研究表明，長期單施化肥會引起土壤酸化，導(dǎo)致微生物多樣性降低[15-16]，與單施化肥相比，合理配施有機(jī)肥可以提高土壤微生物多樣性和多功能性[17-18]，從而減少集約施肥的負(fù)面效應(yīng)。然而一些研究者發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥后土壤微生物多樣性并未發(fā)生明顯改變，甚至?xí)档屯寥牢⑸锶郝涞亩鄻有?，這些不一致的結(jié)果可能是由有機(jī)肥類型和施肥持續(xù)年限不同造成的[19-21]，且土壤類型和土地利用方式也可能影響有機(jī)肥對土壤微生物多樣性和群落組成的影響[22]。在茶園生態(tài)系統(tǒng)中，茶園施肥管理措施通過改變土壤理化性質(zhì)直接影響土壤微生物數(shù)量和群落，或影響茶樹根系分泌物（分泌物種類和數(shù)量）間接對土壤微生物數(shù)量和群落產(chǎn)生影響[23]。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，長期施用氮肥改變了茶園土壤細(xì)菌群落特征，群落多樣性和穩(wěn)定性下降導(dǎo)致有益菌群減少[24-25]。相反，茶園施用有機(jī)肥能提高土壤細(xì)菌的多樣性，還能有效調(diào)節(jié)茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，改善潛在的生態(tài)系統(tǒng)功能[26-27]，但是過高的有機(jī)肥替代比例會降低茶葉產(chǎn)量[28]。相比而言，微生物各物種間的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系及功能多樣性對于預(yù)測土壤生態(tài)功能更有意義，但有關(guān)施肥對茶園土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)及功能影響的研究尚少見報(bào)道。因此，本研究基于6 a 的茶園長期定位試驗(yàn)，采用IlluminaMiSeq高通量測序技術(shù)和共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析，探討不同施肥措施下茶園土壤細(xì)菌群落多樣性、群落組成和共線性網(wǎng)絡(luò)的變化趨勢，并利用FAPROTAX方法對土壤細(xì)菌生態(tài)功能進(jìn)行預(yù)測，以期為茶園合理施肥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于福建省壽寧縣南陽鎮(zhèn)龜嶺村的茶園長期定位試驗(yàn)基地（27°43′N，119°40′E），該區(qū)域處于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，海拔高度657 m，全年平均氣溫為15.1 ℃，低溫出現(xiàn)在1月，平均為3.7 ℃，高溫出現(xiàn)在7月，平均為22.6 ℃，年平均降雨量為1831mm。試驗(yàn)地土壤的成土母質(zhì)為火山巖，土壤類型為紅壤。試驗(yàn)地植茶前土壤（0～20 cm）基礎(chǔ)理化性質(zhì)如下：pH5.57，有機(jī)質(zhì)4.49 g·kg^-1，全氮0.20 g·kg^-1，堿解氮25.1mg·kg^-1，全磷0.11 g·kg^-1，有效磷0.80 mg·kg^-1，全鉀7.65 g·kg^-1，速效鉀31.9 mg·kg^-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

長期定位試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：2016 年選擇未種植過茶樹的自然土壤布置長期定位試驗(yàn)，用單片磚水泥全粉刷的方式進(jìn)行小區(qū)的分割，分割處深入地下30 cm，并涂防水材料處理，地面上高出20 cm。采用隨機(jī)區(qū)組方法進(jìn)行排列，每個(gè)區(qū)組之間距離30 cm，中間有水泥排水溝，每個(gè)小區(qū)留有統(tǒng)一方向的出水口通向排水溝（圖1）。2016年冬季將試驗(yàn)小區(qū)進(jìn)行土地平整，于2016年11月24日種植1年生扦插苗，茶樹品種為金牡丹（C. sinensis cv. jinmudan）。具體施肥處理如下：①對照（CK），植茶不施肥；②單施化肥（CF），施用量以純氮計(jì)算，第1年為75 kg·hm^-2，第2年為150 kg·hm^-2，第3年為300 kg·hm^-2，第4年為450 kg·hm^-2，此后每年均為600 kg·hm^-2；③單施化肥+清園處理（CFC），茶園管理以清耕除草為主，茶樹修剪時(shí)移除修剪枝條；④有機(jī)肥配施化肥（OF），第1年和第2年有機(jī)肥的施用量為化肥等氮量的50%，第3年起有機(jī)肥的施用量改為化肥等氮量的25%；⑤有機(jī)肥配施化肥+種植綠肥（OFM），日常種植綠肥，綠肥品種為白三葉。每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積為30 m²。尿素（含氮量46%）、過磷酸鈣（含磷量12%）和硫酸鉀（含鉀量52%）作為化肥養(yǎng)分來源，肥料養(yǎng)分配比N∶P₂O₅∶K₂O=1∶0.33∶0.48，施肥方式為撒施。氮肥和鉀肥分批次施用，冬季基肥40%（11月下旬）、春季催芽肥30%（3中下旬—4月上旬），秋茶追肥30%（8月中下旬），有機(jī)肥和磷肥作為基肥一次性施入。有機(jī)肥來源為商品有機(jī)肥（N 4.3%、P₂O₅ 1.1%、K₂O 3.2%），茶行中間開15～20cm 的施肥溝，溝施覆土。采摘按照制作大宗紅茶標(biāo)準(zhǔn)（一芽二葉或一芽三葉）進(jìn)行，春茶和秋茶各采摘一次。修剪按照傳統(tǒng)方式進(jìn)行，各處理保持一致。

1.3 土壤樣品采集與處理

各試驗(yàn)小區(qū)土壤樣品采集于2022 年6 月，去除地表的凋落物后，按照隨機(jī)多點(diǎn)混合取樣，采集耕層0～30 cm土壤樣品，采集5點(diǎn)子樣點(diǎn)混合成1個(gè)樣品，共獲得20份樣品，樣品用冰盒運(yùn)輸帶回實(shí)驗(yàn)室。剔除植物殘?bào)w、石塊等雜物，樣品分成兩份：一份保存于-80 ℃冰箱用于土壤微生物測定；另一份置于室內(nèi)通風(fēng)場地晾干，用木棍碾碎分別過10、20 目和100 目的標(biāo)準(zhǔn)篩后裝袋，標(biāo)記好用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.5 土壤微生物DNA提取與高通量測序

采用FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒（MP Bio?medicals，美國）提取土壤微生物DNA，提取過程參照說明書進(jìn)行。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品質(zhì)量，用NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA 的濃度和純度，稀釋合格后的樣品保存于-80 ℃冰箱用于PCR擴(kuò)增。細(xì)菌選用16S通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min直至反應(yīng)完成。擴(kuò)增體系為20 μL 反應(yīng)體系，其中包括4 μL 的5×FastPfuBuffer緩沖液、2 μL 的2.5 mmol·L^-1 dNTPs、0.8 μL 的正反引物（5 μmol·L^-1）、0.4 μL的5×FastPfu DNA聚合酶、0.2 μL 的BSA 和10 ng 的模板DNA，補(bǔ)dd H₂O 至20 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序工作，測序平臺為Illumina MiSeq（PE300，San Diego，CA，美國）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

測序獲得的原始序列經(jīng)過Qiime 平臺篩選和序列優(yōu)化后，依據(jù)97%的相似度聚類成操作分類單元，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97% 相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)信息注釋。細(xì)菌16S rRNA比對數(shù)據(jù)庫為Silva（Release138 http：//www.arb-silva.de），默認(rèn)置信度閾值為0.7。20 個(gè)土壤樣品獲得1 756 713條高質(zhì)量的序列，平均長度為414.14 bp，可劃分為40個(gè)門，134個(gè)綱，327個(gè)目，515個(gè)科，991個(gè)屬，2144 個(gè)種。采用Mothur（1.30.2）計(jì)算樣品的Alpha多樣性指數(shù)來反映微生物群落的豐富度（Sobs、Chao1、Ace）和多樣性（Shannon、Simpson）。采用Qiime（2020.2.0）計(jì)算beta 多樣性Bray-Curtis 距離矩陣。R語言（version 3.3.1）vegan軟件包進(jìn)行非度量多維尺度分析（NMDS分析）和制圖，可視化呈現(xiàn)不同環(huán)境樣本中群落組成的相似或差異程度。土壤細(xì)菌功能預(yù)測采用FAPROTAX 軟件[30]，具體分析步驟基于美吉在線云平臺（https：//cloud.majorbio.com/）?；跇颖綩TU 之間的Spearman 系數(shù)進(jìn)行共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析，保留穩(wěn)健相關(guān)（相關(guān)系數(shù)絕對值gt;0.7，Plt;0.05）的OTU進(jìn)行構(gòu)建，將單施化肥（CF、CFC）和有機(jī)肥配施化肥（OF、OFM）的處理進(jìn)行合并，從而提高網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)健性和可信度。利用Networkx復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析工具包（Python語言），通過計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度分布、網(wǎng)絡(luò)的直徑、網(wǎng)絡(luò)的平均最短路徑，以及節(jié)點(diǎn)聯(lián)通性、緊密系數(shù)、介數(shù)中心性等屬性，來獲得物種和樣本的組內(nèi)或組間的相關(guān)信息，更加全面高效地挖掘出復(fù)雜數(shù)據(jù)中包含的信息。利用Cytoscape 3.8.2 軟件對微生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，為方便構(gòu)圖挑選豐度前50位的物種進(jìn)行展示。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性采用冗余分析（RDA 分析），采用R語言vegan 包進(jìn)行分析和制圖。RDA 分析前對環(huán)境因子進(jìn)行篩選，采用方差膨脹因子分析保留多重共線性較小的環(huán)境因子（VIFlt;10）進(jìn)行后續(xù)研究。采用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行環(huán)境因子與物種之間的相關(guān)性熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥措施對茶園土壤理化性質(zhì)的影響

不同施肥處理下，茶園土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了明顯的變化（表1）。由于持續(xù)的養(yǎng)分投入，相比CK處理，各施肥處理的土壤養(yǎng)分含量均有所增加（土壤全鉀除外）。統(tǒng)計(jì)分析表明，與CK處理相比，CF處理使土壤堿解氮和全磷含量（Plt;0.05）分別顯著增加了27.47%和32.70%，其他指標(biāo)差異不顯著（Pgt;0.05）；與CK處理相比，OF 和OFM 處理土壤pH 分別顯著增加0.85 個(gè)和0.32個(gè)單位（Plt;0.05），土壤全氮、堿解氮、全磷及速效磷含量顯著增加（Plt;0.05）；與CF 處理相比，OF 處理顯著增加了土壤pH、全磷、速效磷和速效鉀（Plt;0.05），OFM處理顯著增加了土壤pH（Plt;0.05）；CF和CFC 處理之間土壤理化性質(zhì)差異不顯著（Pgt;0.05）。由此可見，連續(xù)6a配施有機(jī)肥提高了茶園土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效養(yǎng)分含量和pH，改善了茶園土壤肥力水平。

2.2 不同施肥措施對土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性的影響

不同施肥處理茶園土壤樣品中一共分析出26 973個(gè)OTUs數(shù)目，其中各施肥處理土壤共有OTUs數(shù)為2733個(gè)，占OTUs總數(shù)的10.13%（圖2）。CK、CF、CFC、OF 和OFM 土壤細(xì)菌OTUs 總數(shù)分別為5 282、4935、5068、5 611個(gè)和6077個(gè)，單施化肥處理OTUs數(shù)目低于CK，而有機(jī)肥配施處理OTUs數(shù)目明顯高于單施化肥處理。

通過分析土壤樣品，計(jì)算得到各樣品土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)（表2）。由表2可知，覆蓋度指數(shù)值在所有的處理中均大于97.7%，表明在該測序深度下，大多數(shù)的細(xì)菌群落已經(jīng)被覆蓋。不同施肥處理下Sobs指數(shù)為2 897.81～3 602.81、Ace指數(shù)為3 882.40～4 676.10，Chao1指數(shù)為3 890.30～4 653.30，Shannon指數(shù)為6.37～6.73，Simpson 指數(shù)為0.003 6～0.005 5。與CK處理相比，CF和CFC處理降低土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)，但差異不顯著（Pgt;0.05），OFM處理顯著增加了土壤細(xì)菌Sobs、Ace、Chao1和Shannon指數(shù)（Plt;0.05），顯著降低了Simpson 指數(shù)（Plt;0.05）；OFM 處理的Sobs、Ace、Chao1 和Shannon 指數(shù)顯著高于CF 和CFC處理（Plt;0.05），OF和OFM處理之間各指數(shù)差異不顯著（Pgt;0.05）。整體上，單施化肥處理一定程度降低土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)，而配施有機(jī)肥則提高土壤細(xì)菌群落的多樣性。

2.3 不同施肥措施對土壤細(xì)菌群落特征和Beta多樣性的影響

各處理土壤細(xì)菌門水平相對豐度如圖3a所示，豐度相對較高（gt;1%）的有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacterita）、酸桿菌門（Acidobacteria）綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、黏球菌門（Myxococcota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、浮霉菌門（Planctomycetota）和WPS-2候選分支，其中綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是絕對優(yōu)勢菌門，約占到所有細(xì)菌總數(shù)的72.67%～77.31%。與CK處理相比，OF處理顯著增加了厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度（Plt;0.05）；與CF和CFC處理相比，OF處理顯著增加了黏球菌門的相對豐度（Plt;0.05），但也顯著降低了浮霉菌門的相對豐度（Plt;0.05）。

在屬分類水平上（圖3b），相對豐度大于1%的屬共有26 個(gè)，其中norank_f__norank_o__norank_c__AD3、norank_f__Xanthobacteraceae、norank_f__norank_o__Subgroup_2、norank_f__norank_o__Acidobacteriales 和norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 的相對豐度大于5%。與CK處理相比，OF和OFM處理顯著降低了norank_f__norank_o__norank_c__AD3 和熱酸菌屬（Acidothermus）的相對豐度（Plt;0.05），OF處理顯著增加了芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度（Plt;0.05）；與CF 處理相比，OFM 處理顯著增加了norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 的相對豐度，OF 和OFM處理顯著降低了熱酸菌屬、羅河桿菌屬（Rhodano?bacter）和Burkholderia - Caballeronia-Paraburkholderia的相對豐度（Plt;0.05），OF處理顯著增加了芽孢桿菌屬的相對豐度（Plt;0.05）。

對不同施肥措施的茶園土壤細(xì)菌群落進(jìn)行NMDS分析，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，單施化肥的CF和CFC兩個(gè)處理的土壤樣品較為緊密地聚集在一起，CK和CFC處理之間也有一定程度的重合，而施用有機(jī)肥（OF和OFM）處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與施用化肥（CF和CFC）均有明顯差異。進(jìn)一步通過ANOSIM分析表明，不同施肥措施顯著改變茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（R²=0.442 1，P=0.001）。OF 與CK、CF 和CFC 處理之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（Plt;0.05），OFM 與CFC 處理之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（Plt;0.05），其他處理之間差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 不同施肥措施對茶園土壤細(xì)菌功能菌群的影響

采用FAPROTAX工具對土壤細(xì)菌群落功能注釋后共獲得45種功能分組，相對豐度較高的功能類群如圖5 所示。各處理中化能異養(yǎng)（chemoheterotro?phy）、有氧化能異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy）、固氮作用（nitrogen fixation）、纖維素分解（cellulolysis）、硝酸鹽還原作用（nitrate reduction）、發(fā)酵作用（fer?mentation）、鐵呼吸（iron respiration）、尿素水解（ureol?ysis）和光養(yǎng)作用（phototrophy）的相對豐度在1% 以上，其中化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、固氮作用、纖維素分解和硝酸鹽還原作用功能類群占總豐度的65.63%～76.28%。方差分析結(jié)果表明，與CK 處理相比，CF處理中捕食性或外寄生作用（predatory or exo?parasitic）功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），而錳氧化作用（manganese oxidation）功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05），OF和OFM處理中固氮作用和纖維素分解功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），芳香族化合物降解（aromatic compound degradation）功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05）。與CF處理相比，OF處理中纖維素分解和錳氧化作用功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），捕食性或外寄生作用、光異養(yǎng)作用（photoheterotrophy）、光養(yǎng)作用（pho?totrophy）、氮呼吸（nitrogen respiration）、硝酸鹽呼吸（nitrate respiration）、亞硝酸鹽呼吸（nitrite respira?tion）、硝酸鹽反硝化（nitrate denitrification）、亞硝酸反硝化（nitrite denitrification）、一氧化二氮反硝化（nitrous-oxide-denitrification）、反硝化作用（denitrifi?cation）、光合自養(yǎng)硫氧化（anoxygenic photoautotrophy Soxidizing）和光能自養(yǎng)（anoxygenic photoautotrophy）功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05）。

2.5 不同施肥措施對茶園土壤細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)特征的影響

基于CK、單施化肥（CF、CFC）、有機(jī)肥配施化肥（OF、OFM）測序結(jié)果構(gòu)建細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)（圖6、表3）。如圖6和表3所示，3個(gè)處理的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)具有明顯的不同，CK處理網(wǎng)絡(luò)由48個(gè)節(jié)點(diǎn)和234條邊組成，菌群主要分布在變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門和GLA15；單施化肥網(wǎng)絡(luò)有48個(gè)節(jié)點(diǎn)和292條邊組成，菌群主要分布在變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門；有機(jī)肥配施網(wǎng)絡(luò)由48個(gè)節(jié)點(diǎn)和258條邊組成，菌群主要分布在藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、芽單胞菌門、變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門。與CK 處理相比，單施化肥土壤細(xì)菌分子網(wǎng)絡(luò)平均連通度明顯增加，表明施肥后其網(wǎng)絡(luò)規(guī)模、復(fù)雜性均得到了提升，其中單施化肥處理的邊數(shù)、連通度大于有機(jī)肥配施處理。各處理細(xì)菌作用均以正相關(guān)為主（正相關(guān)比例為58.03%～77.78%），說明各處理細(xì)菌均以合作關(guān)系為主，其中正相關(guān)比例排序?yàn)镃Kgt;單施化肥gt;有機(jī)肥配施，施肥加劇了茶園土壤細(xì)菌間的競爭程度。相比CK處理，單施化肥和有機(jī)肥配施處理下的網(wǎng)絡(luò)平均聚類系數(shù)較低，而網(wǎng)絡(luò)平均路徑長度距離較長。

2.6 土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

土壤理化性質(zhì)和土壤細(xì)菌多樣性的相關(guān)性分析見圖7，土壤pH、全磷和速效磷與土壤細(xì)菌Sobs、Shannon、Ace和Chao1指數(shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；其余指標(biāo)與土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)之間的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平?？傮w而言，土壤pH、全磷和速效磷對土壤細(xì)菌群落多樣性影響較為顯著。

土壤理化性質(zhì)與相對豐度最高的12個(gè)門和50個(gè)屬的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果見圖8。門水平上（圖8a），土壤pH與放線菌門、厚壁菌門、黏球菌門和芽單胞菌門的相對豐度之間呈顯著或極顯著正相關(guān)，與浮霉菌門的相對豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)；土壤全磷和速效磷與放線菌門、厚壁菌門、黏球菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度呈顯著或極顯著正相關(guān)，與綠彎菌門、浮霉菌門和WPS-2的相對豐度呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；土壤速效鉀與擬桿菌門的相對豐度呈顯著正相關(guān)。在屬水平上（圖8b），土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀和CEC與大多數(shù)土壤細(xì)菌屬的相對豐度相關(guān)性不顯著，土壤pH、全磷和速效磷與大多數(shù)細(xì)菌屬的相對豐度存在顯著或極顯著相關(guān)性。

進(jìn)一步通過RDA分析來解析土壤理化性質(zhì)對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果（圖9a）顯示，門水平上土壤理化性質(zhì)解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的58.47%，其中第一排序軸解釋量為46.88%，第二排序軸解釋量為11.59%，其中速效磷（R²=0.841 9，P=0.001）和pH（R²=0.6309，P=0.001）對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著。在屬水平上（圖9b），前兩個(gè)排序軸分別解釋了細(xì)菌群落變化的46.91% 和11.21%，兩者共解釋58.12%，速效磷（R²=0.676 7，P=0.001）和pH（R²=0.4938，P=0.004）對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。由Mantel test（表4）分析可知，有效磷和pH對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（門水平）具有最顯著的影響（R=0.4346，P=0.002 和R=0.3087，P=0.003），有效磷對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（屬水平）具有最顯著的影響（R=0.2339，P=0.026）。因此，土壤有效磷和土壤pH可能是影響施肥后茶園土壤細(xì)菌群落變化的重要環(huán)境因素。

3 討論

3.1 不同施肥措施對茶園土壤細(xì)菌多樣性和群落組成的影響

適宜的有機(jī)肥替代比例不僅提高茶葉產(chǎn)量[31]，增加茶葉水浸出物、氨基酸和香氣成分物質(zhì)的含量，還可以改善茶園土壤理化性狀，并引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的差異[32-33]。土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)是表征土壤細(xì)菌功能和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要指標(biāo)，一般而言長期施用化肥導(dǎo)致土壤酸化和養(yǎng)分不均衡，降低土壤細(xì)菌多樣性[15]，而施用有機(jī)肥則會刺激土壤細(xì)菌生長并提高土壤細(xì)菌多樣性[17-18]。Feng等[34]分析了我國10個(gè)20 a田間施肥（有機(jī)肥和無機(jī)肥）試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在高降水和高土壤肥力地區(qū)的酸性土壤中，施用化肥可導(dǎo)致土壤進(jìn)一步酸化，進(jìn)而對土壤細(xì)菌多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響，而有機(jī)肥能提高大多數(shù)酸性土壤細(xì)菌豐富度。本研究中，與CK處理相比，6 a CF處理降低茶園土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)，而OF處理和OFM處理均提高了細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)，其中OFM處理細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)顯著增加（表2）。Ma等[24]對龍井茶園研究的結(jié)果也與本研究一致。這可能是由于有機(jī)肥配施化肥提高土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、土壤養(yǎng)分含量以及生物活性，整體形成有利于細(xì)菌生長繁殖的良好環(huán)境[35]。本研究中，土壤pH、全磷和速效磷是影響土壤細(xì)菌多樣性的重要土壤因子，這與已有的研究結(jié)果基本一致[26-28]。RDA 分析結(jié)果也表明，全磷、速效磷和pH對土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，這說明不同的施肥措施會通過改變土壤養(yǎng)分和pH來影響茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。有研究表明[36]，土壤pH已經(jīng)被認(rèn)為是影響全球土壤細(xì)菌群落變化的關(guān)鍵因子。本研究中，與CF處理相比，OF和OFM處理土壤pH分別顯著提高了0.85個(gè)和0.32個(gè)單位，因而部分與pH呈顯著正相關(guān)的放線菌門、厚壁菌門、黏球菌門和芽單胞菌門的相對豐度明顯增加（圖8），從而導(dǎo)致了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。Wu等[37]的研究認(rèn)為，隨著全球氮輸入的增加，磷對土壤微生物生長過程的限制可能更大，適宜的土壤有效磷含量對土壤微生物在全球尺度具有積極影響，而土壤中大量的有效磷可能導(dǎo)致植物有益微生物的消耗，同時(shí)增加致病微生物豐度并影響植物健康[38-39]。本課題組前期研究結(jié)果顯示速效磷含量過高的茶園土壤致病菌含量顯著增加，而土壤有益菌含量顯著降低[40]。本試驗(yàn)地茶園土壤有效磷含量較低（7.57 mg·kg^-1），施肥后土壤有效磷含量明顯增加，其中OF處理有效磷含量達(dá)到了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)茶園標(biāo)準(zhǔn)（gt;25 mg·kg^-1），適宜的土壤有效磷含量會改變生物群落結(jié)構(gòu)和組成并會促進(jìn)某些特定微生物的生長[41]。

不同施肥處理所引起的土壤環(huán)境變化會顯著影響微生物群落的組成[42]。本研究結(jié)果表明，不同施肥處理中細(xì)菌優(yōu)勢菌群相似，但不同處理門和屬水平上的優(yōu)勢類群的相對豐度差異顯著（圖3）。與CK處理相比，OF處理中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著增加了65.55% 和176.12%（Plt;0.05）；與CF 和CFC處理相比，OF處理黏球菌門的相對豐度顯著增加86.60% 和72.60%（Plt;0.05），但浮霉菌門的相對豐度也顯著降低了73.59%和63.58%（Plt;0.05）。盡管不同施肥處理土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群基本相似，但是各施肥處理中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的整體組成存在顯著差異（R²=0.442 1，P=0.001）。NMDS分析表明（圖4），CK 和CFC處理樣品存在明顯重疊區(qū)域，而OF和OFM處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與CF和CFC處理均有明顯差異，這表明連續(xù)6a 施肥已顯著改變茶園土壤細(xì)菌群落組成，其中OF處理影響更為顯著。OF處理土壤富集了更多的細(xì)菌分類群（33個(gè)進(jìn)化枝，2個(gè)門，8個(gè)綱，8個(gè)目，8個(gè)科和7個(gè)屬），而這類菌群能夠起到溶解病原菌、防治植物土傳病害和分泌抗菌抑制劑等多種作用[43-45]。另外，變形菌門中的生絲微菌科（Hyphomi?crobiaceae）同樣在OF 處理中廣泛富集，這類富營養(yǎng)型細(xì)菌均具有較強(qiáng)的固氮功能，OF處理中黏球菌門中的多囊菌綱和多囊菌目相對豐度顯著增加，這說明有機(jī)肥配施化肥可能有利于驅(qū)動(dòng)土壤中作物有益微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而降低土傳病害發(fā)生，緩解長期植茶帶來的連作障礙。

3.2 不同施肥措施對茶園土壤細(xì)菌功能類群和共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)的影響

茶園土壤細(xì)菌生態(tài)功能類群以化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、固氮作用、纖維素分解和硝酸鹽還原作用功能類群為主（圖5），比例為65.63%～76.28%。與CF處理相比，OF處理中纖維素分解和錳氧化作用功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），而捕食性或外寄生作用、光異養(yǎng)作用、光養(yǎng)作用、光合自養(yǎng)硫氧化和光能自養(yǎng)功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05），表明OF處理中有更高比例的細(xì)菌參與土壤碳氮循環(huán)，這與Gu等[26]的研究結(jié)果一致。同時(shí)OF處理中參與氮循環(huán)功能細(xì)菌種群豐度的提高，意味著降低氮肥施入量有利于土壤有機(jī)氮被微生物礦化[46]，從而釋放出更多無機(jī)氮供作物吸收利用，這可能也是適宜有機(jī)肥替代比例條件下茶葉提質(zhì)增產(chǎn)的原因之一。

土壤微生物網(wǎng)絡(luò)分析為探索土壤微生物群落之間復(fù)雜的相互關(guān)系提供了新的途徑，可以識別影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和潛在功能最大的關(guān)鍵物種[47]，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)和邊數(shù)可以表示分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模和復(fù)雜性[48]。本研究中，施肥后茶園土壤細(xì)菌分子網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)特征如連接數(shù)、平均連通度、度中心性及緊密中心性明顯提高，表明施肥增強(qiáng)了對環(huán)境擾動(dòng)的抵抗性[49]，且中短期內(nèi)（6a）茶園細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)規(guī)模的擴(kuò)大更加依賴于單施化肥。CF處理顯著增加了土壤堿解氮和全磷含量，有機(jī)肥配施化肥處理則通過增加土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和速效養(yǎng)分的含量顯著改善土壤肥力水平，土壤養(yǎng)分的提升能夠?yàn)榧?xì)菌群落提供更多的資源生態(tài)位，從而能夠塑造和形成更加復(fù)雜的互作關(guān)系和共存網(wǎng)絡(luò)。由微生物菌群之間正負(fù)相關(guān)比例可見（表3），茶園土壤細(xì)菌菌群之間以正相關(guān)為主（正相關(guān)比例為58.03%～77.78%），表明在本研究的茶園土壤中細(xì)菌群落之間有更為緊密的協(xié)作關(guān)系；CK處理的細(xì)菌菌群正相關(guān)比例最高，有機(jī)肥配施化肥處理的正相關(guān)比例較低，表明施肥（尤其是有機(jī)肥配施化肥）加劇了茶園土壤細(xì)菌間競爭程度，這可能與有機(jī)肥中富含更易被細(xì)菌群落分解利用的半纖維素和蛋白質(zhì)等簡單有機(jī)物有關(guān)[50]。此外，有機(jī)肥配施化肥處理的共現(xiàn)細(xì)菌類群多于CK和單施化肥處理（圖6），新增關(guān)鍵類群藍(lán)藻門和芽單胞菌門則與土壤養(yǎng)分循環(huán)和病原菌防控有關(guān)[51]，這在一定程度上說明有機(jī)肥配施化肥處理有利于促進(jìn)土壤細(xì)菌群落生態(tài)位競爭。另外，微生物網(wǎng)絡(luò)平均路徑長度代表物種間傳遞物質(zhì)、能量及信息的效率[52]，平均聚類系數(shù)表明微生物對外界環(huán)境因子擾動(dòng)的敏感程度。相比于CK處理，各施肥處理的土壤微生物網(wǎng)絡(luò)平均路徑距離增加，平均聚類系數(shù)均有所下降，且有機(jī)肥配施化肥的變化程度要高于單施化肥，這意味有機(jī)肥配施化肥后土壤細(xì)菌響應(yīng)速度變慢，外界環(huán)境變化不會在較短時(shí)間內(nèi)影響整個(gè)細(xì)菌生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，有利于提高細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[53]。

4 結(jié)論

（1）6a田間試驗(yàn)結(jié)果表明，施肥明顯提高了茶園土壤速效養(yǎng)分含量，與單施化肥相比，有機(jī)肥配施化肥顯著增加了土壤全磷、速效磷和速效鉀含量，提高土壤pH有效緩解了土壤酸化。

（2）施肥改變茶園土壤細(xì)菌多樣性，與不施肥處理相比，單施化肥降低了土壤細(xì)菌群落的Alpha多樣性，有機(jī)肥配施化肥則提高了土壤細(xì)菌的Alpha多樣性，而這主要與施肥后速效磷和pH的變化有關(guān)。

（3）茶園土壤細(xì)菌生態(tài)功能類群以化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、固氮作用、纖維素分解和硝酸鹽還原作用功能類群為主，有機(jī)肥配施化肥處理提高了細(xì)菌參與碳氮循環(huán)功能種群的相對豐度。

（4）施肥有助于茶園土壤細(xì)菌群落形成復(fù)雜的共生網(wǎng)絡(luò)，有機(jī)肥配施化肥可改變茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤細(xì)菌碳氮循環(huán)功能，提高細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)規(guī)模和群落互作。