縫隙增強(qiáng)拉曼探針:制備、光學(xué)屬性和應(yīng)用

鄧斌格,林俐,葉堅(jiān)

(上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,上海 200030)

1 表面增強(qiáng)拉曼光譜和縫隙增強(qiáng)拉曼探針的介紹

1.1 表面增強(qiáng)拉曼光譜基本原理

拉曼光譜(又稱為拉曼散射)是光與分子發(fā)生作用時(shí)產(chǎn)生的非彈性散射效應(yīng),其與分子的轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)模式緊密相關(guān),具有高特異性,被稱為分子的指紋光譜,可用于分子結(jié)構(gòu)的分析和鑒定。然而,一般的拉曼散射信號(hào)很微弱,為了獲得足夠的信號(hào),增強(qiáng)成了必不可少的手段。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)是指由于表面等離激元的激發(fā)以及表面化學(xué)效應(yīng)使得吸附在貴金屬納米結(jié)構(gòu)表面的分子的拉曼散射產(chǎn)生極大的增強(qiáng)效應(yīng),其最大增強(qiáng)因子可達(dá)1010-1011[1-4]。此外,拉曼光譜特有的指紋光譜使其具有超高的特異性,超窄的半寬峰有利于多指標(biāo)檢測(cè)和成像[1,2,5-7]。

1.2 傳統(tǒng)表面增強(qiáng)拉曼探針與縫隙增強(qiáng)拉曼探針的結(jié)構(gòu)

目前SERS技術(shù)的應(yīng)用主要通過標(biāo)記和非標(biāo)記的方法來實(shí)現(xiàn)。非標(biāo)記的方法是指利用貴金屬納米結(jié)構(gòu)直接對(duì)目標(biāo)分子的拉曼光譜實(shí)現(xiàn)增強(qiáng),而標(biāo)記的方法是指通過SERS探針來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子信號(hào)的放大。SERS探針通常包括貴金屬納米顆粒、拉曼報(bào)告分子、保護(hù)層、修飾層等四個(gè)部分(見圖1)[1]。貴金屬納米顆粒主要作為增強(qiáng)基底,通過電磁場(chǎng)增強(qiáng)機(jī)制或(和)化學(xué)增強(qiáng)對(duì)拉曼報(bào)告分子進(jìn)行增強(qiáng)。拉曼報(bào)告分子是產(chǎn)生拉曼信號(hào)的來源,通常具有較大的拉曼截面,并通過自組裝或靜電作用吸附到納米顆粒表面。保護(hù)層可以提高納米探針的穩(wěn)定性和生物相容性,常常由聚合物或二氧化硅等組成。修飾層主要通過修飾靶向分子(如核酸、抗體和適配體)使納米探針能夠以高特異性和親和力與目標(biāo)物(例如腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的標(biāo)志物)結(jié)合。

圖1 SERS探針的制備過程[1]Fig.1 Illustration of SERS nanotag fabrication[1]

傳統(tǒng)SERS探針主要是在貴金屬基底的表面吸附報(bào)告分子,但可能會(huì)有增強(qiáng)因子不足、分子易解吸附、分子受溶液環(huán)境影響等缺陷。與傳統(tǒng)SERS探針的結(jié)構(gòu)不同,縫隙增強(qiáng)拉曼探針(Gap-enhanced Raman tags, GERTs)是一種具有內(nèi)部納米縫隙結(jié)構(gòu)的核殼SERS探針(如圖2所示)[8, 9],將拉曼報(bào)告分子包埋在金屬核殼之間的縫隙中。GERTs在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與調(diào)控、拉曼報(bào)告子、表面修改和功能化等多個(gè)方面表現(xiàn)出極大的靈活性,并展現(xiàn)出了多種獨(dú)特的光學(xué)屬性,包括極大的電磁場(chǎng)和拉曼增強(qiáng)、超高的光穩(wěn)定性和材料穩(wěn)定性。近年來GERTs作為一種性能優(yōu)異的納米探針,在信息安全[10-13]、體外檢測(cè)[11,14-19]、活體檢測(cè)和成像[6,8,20-26]、多功能診療[27-31]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文主要介紹近年來本課題組針對(duì)GERTs的制備[19, 20]、光學(xué)屬性[32, 33]以及在多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展。

圖2 縫隙增強(qiáng)拉曼探針的示意圖及對(duì)應(yīng)的透射電鏡圖。紅色表示包埋在內(nèi)部納米間隙中的拉曼報(bào)告分子[8,9]Fig.2 Schematic structures and the corresponding representative TEM images of GERTs; Red part indicates Raman reporters in the internal nanogaps[8,9]

2 縫隙增強(qiáng)拉曼探針的制備

2.1 探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和調(diào)控

GERTs顆粒內(nèi)部的嵌入式“熱點(diǎn)”和拉曼信號(hào)分子極大提高了顆粒的SERS強(qiáng)度、重復(fù)性和穩(wěn)定性,使其成為性能可靠的SERS探針。為了制備具有高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性的GERTs,需要精心設(shè)計(jì)其內(nèi)部縫隙結(jié)構(gòu)、選擇合適的拉曼報(bào)告分子、基底材料及調(diào)控其顆粒形貌[1, 2]。

2.1.1縫隙大小及調(diào)控

GERTs內(nèi)部“縫隙”的尺寸大小決定了金屬核殼之間等離激元耦合的程度以及縫隙結(jié)構(gòu)內(nèi)的近場(chǎng)增強(qiáng)。文獻(xiàn)已報(bào)道過多種制備內(nèi)部超小縫隙結(jié)構(gòu)的不同方法,可以分成兩大類:一類是借助金銀之間的置換反應(yīng)獲得中空的縫隙結(jié)構(gòu),即在生長(zhǎng)金殼的同時(shí)刻蝕銀內(nèi)核而形成縫隙,但反應(yīng)可控性較差,縫隙結(jié)構(gòu)的均一性往往不高、很難穩(wěn)定縮小到近亞納米[34]。第二類方法,也是目前應(yīng)用更廣泛的方法,是首先制備金屬內(nèi)核,將特定的具有拉曼活性的分隔層包裹在金屬內(nèi)核上,形成薄的中間層,再進(jìn)一步生長(zhǎng)金外殼,在核殼之間形成縫隙結(jié)構(gòu)。已報(bào)道的拉曼活性分隔層包括:表面修飾拉曼報(bào)告分子的薄二氧化硅層、修飾有熒光分子的特制核酸鏈、芳香環(huán)聚合物鏈、有機(jī)芳香族小分子等[35]。這些中間層同時(shí)具有拉曼信號(hào),是整個(gè)顆粒的拉曼信號(hào)來源。

但是,采用薄二氧化硅層作為中間層材料,需額外修飾拉曼信號(hào)分子、制備工藝繁瑣,硅層厚度不易控制、且很難縮小至亞納米級(jí)別;而修飾有熒光分子的特制核酸鏈、芳香環(huán)聚合物鏈等中間層材料受限于成本或易得性,不容易開展大批量制備。與前三種材料相比,有機(jī)芳香族分子來源廣泛、材料成本低,同時(shí),具有巰基、氨基或羧基的有機(jī)小分子具有較好的金屬親和力,可以直接修飾在金屬結(jié)構(gòu)表面,合成簡(jiǎn)便。因此,我們課題組廣泛研究了基于第三類拉曼報(bào)告分子(有機(jī)芳香族分子)的GERTs結(jié)構(gòu)。

在此,我們以內(nèi)嵌1,4-苯二硫醇(1,4-Benzenedithiol, 1,4-BDT)的GERTs為例,采用高分辨掃描電鏡表征了其內(nèi)部縫隙結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)嵌的拉曼報(bào)告分子層是縫隙結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因素,分子層的厚度直接決定了縫隙的寬度。這為調(diào)控并制備不同尺寸的縫隙結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)[32]。由于化學(xué)合成手段的限制,精確調(diào)控縫隙的尺寸是一個(gè)挑戰(zhàn)。我們利用1,4-BDT具有兩個(gè)巰基的特點(diǎn),即1,4-BDT分子之間能夠形成二硫鍵,當(dāng)1,4-BDT與納米金核的混合時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí),分子可以在金核表面形成自組裝多層結(jié)構(gòu)。因此我們可以通過控制1,4-BDT分子和金核混合時(shí)長(zhǎng),從而獲得不同厚度的表面分子層;再生長(zhǎng)金殼后,即可獲得具有不同縫隙尺寸的GERTs(如圖3所示)。簡(jiǎn)言之,通過優(yōu)化合成的縫隙尺寸參數(shù),為制備具有更優(yōu)拉曼性能的GERTs提供了策略[36]。

圖3 GERTs縫隙大小的調(diào)控。(a)納米金核表面修飾不同厚度 1,4-BDT 分子層的示意圖。(b)納米金核與50 μM 1,4-BDT分子混合不同時(shí)間制備的GERTs的電鏡圖片。圖像標(biāo)尺為20 nm[36]Fig.3 Research on the gap size of GERTs and its regulation method. (a) Schematic molecular packing structure on Au core surface with different packing densities and numbers of molecular layers. (b) TEM images of GERTs with different gap sizes prepared by incubation time from 0.5 to 96 h for Au cores and 50 μM 1,4-BDT. All scale bars are 20 nm[36]

2.1.2GERTs內(nèi)嵌的拉曼報(bào)告分子

拉曼報(bào)告分子吸附于金屬核殼結(jié)構(gòu)之間,是GERTs探針信號(hào)的來源。拉曼報(bào)告分子通常具有足夠大的散射截面,以保證強(qiáng)的拉曼信號(hào);同時(shí)其特征峰簡(jiǎn)單可歸屬,從而最大程度避免與其他拉曼報(bào)告分子譜帶的重疊。根據(jù)拉曼報(bào)告分子與金屬的吸附方式可以分為共價(jià)吸附和靜電吸附兩種。通過共價(jià)吸附的分子通常具有巰基[13, 26],比如與金形成金-硫鍵牢固吸附在金屬表面,而通過靜電吸附的報(bào)告分子(如氨基、羧基等基團(tuán))通常是與金屬核或者金屬核的穩(wěn)定劑具有異種電荷[25]。當(dāng)拉曼報(bào)告分子的吸收波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)接近時(shí),報(bào)告分子的信號(hào)能得到更大的增強(qiáng),即表面增強(qiáng)共振拉曼效應(yīng),而這一類能與激光共振的拉曼報(bào)告分子稱為共振拉曼報(bào)告分子[25]。盡管共振拉曼報(bào)告分子的引入能進(jìn)一步提高GERTs的靈敏度,但是共振拉曼報(bào)告分子在與激光共振時(shí)通常會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光背景,從而影響生物檢測(cè)和成像。為解決該問題,我們最近報(bào)道了一種新型的近紅外二區(qū)無熒光共振拉曼報(bào)告分子,在最大化提升共振拉曼信號(hào)的同時(shí),還可以避免熒光背景的干擾,從而更好地滿足生物醫(yī)學(xué)成像的應(yīng)用[37]。

生物分子的拉曼信號(hào)錯(cuò)綜復(fù)雜,且主要分布在指紋區(qū)(即200-1800 cm-1)內(nèi)。如果使用信號(hào)位于指紋區(qū)的拉曼探針,其拉曼峰容易與生物分子拉曼峰重疊,從而會(huì)影響其精準(zhǔn)定量檢測(cè)與成像,因此指紋區(qū)的報(bào)告分子選擇就受到了限制。與之相對(duì)的,1800-2800 cm-1波數(shù)段內(nèi),生物組織通常沒有特征拉曼光譜信號(hào),故該波數(shù)段被稱為“生物靜默區(qū)”。為了解決以上問題,如圖4a所示,我們引入了生物靜默區(qū)的拉曼報(bào)告分子構(gòu)建了正交縫隙增強(qiáng)拉曼探針(Orthogonal GERTs, O-GERTs),與傳統(tǒng)的SERS(Conventional SERS, C-SERS)探針相比,O-GERTs的報(bào)告分子通常具有炔基、氰基、疊氮基等基團(tuán)的振動(dòng)模式,在1800-2800 cm-1波數(shù)段具有特征拉曼峰。在腫瘤成像的過程中根據(jù)靜默區(qū)分子的特征拉曼信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的檢測(cè),不受組織背景信號(hào)的干擾[22](圖4b-d)。

圖4 正交縫隙增強(qiáng)拉曼探針及其在腫瘤成像中的應(yīng)用。(a)正交GERTs,傳統(tǒng)GERTs以及腫瘤組織的拉曼光譜。(b)O-GERTs用于腫瘤成像的示意圖。(c)基于O-GERTs生物靜默區(qū)特征峰(2196 cm-1)的拉曼成像結(jié)果。(d)對(duì)應(yīng)位置的代表拉曼光譜Fig.4 Orthogonal GERTs and its application in tumor imaging. (a) Schematic diagram of Raman spectra of O-GERTs, conventional SERS (C-SERS) tags and tumor tissue. (b) Schematic illustration of O-GERTs for tumor imaging. (c) Raman imaging based on the characteristic peak (2196 cm-1) in the silent region of O-GERTs. (d) Representative Raman spectra of the corresponding positions in panel c

2.1.3GERTs基底材料

SERS增強(qiáng)效應(yīng)依賴于SERS活性基底為報(bào)告分子提供電磁場(chǎng)的“熱點(diǎn)”,使吸附在表面的分子信號(hào)得到數(shù)量級(jí)的增強(qiáng),而基底的材質(zhì)和光學(xué)性能決定了其增強(qiáng)能力。常見的SERS活性基底通常包括貴金屬、半導(dǎo)體納米材料以及兩者的結(jié)合。由于貴金屬在可見光-近紅外區(qū)域內(nèi)強(qiáng)烈的等離激元共振效應(yīng)以及該波段內(nèi)激光器的高適配性,使得其成為基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用中最為常見的增強(qiáng)基底材料。比如,金具有突出的化學(xué)穩(wěn)定性、生物安全性以及可調(diào)控的等離激元共振光學(xué)性質(zhì),因此是生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)和成像的首選SERS活性基底。銀具有更好的SERS增強(qiáng)能力和更低的成本,也使得其成為SERS領(lǐng)域優(yōu)異的候選材料。

隨著對(duì)等離激元金屬材料研究的深入,越來越多的課題組致力于調(diào)控多金屬納米微觀構(gòu)型的組分和結(jié)構(gòu),從而最大程度上發(fā)揮不同金屬間的協(xié)同耦合,實(shí)現(xiàn)SERS增強(qiáng)性能的最大化。由金和銀組成的復(fù)合納米增強(qiáng)基底是最為常見的活性基底,其結(jié)合了金突出的穩(wěn)定性和銀優(yōu)越的SERS活性。我們?cè)鴪?bào)道了新型的金銀復(fù)合GERTs(Au-Ag GERTs),將花瓣?duì)罱鸺{米顆粒作為內(nèi)核,為拉曼報(bào)告分子提供更多的“熱點(diǎn)”,包裹銀外殼,進(jìn)一步提高探針的靈敏度。該Au-Ag GERTs比Au-Au GERTs的亮度提高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)以上,溶膠的檢測(cè)限低至10 fM,甚至可達(dá)到單顆粒檢測(cè)水平[21, 25]。

(3)有一部分副詞具有關(guān)聯(lián)性作用，有的可以獨(dú)用，有可以合用，有的二者都可以，有的還可以和連詞配合使用。

2.1.4GERTs探針形貌的調(diào)控

由于不同形貌的貴金屬納米結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出不同的SERS增強(qiáng)能力,因此合理設(shè)計(jì)貴金屬的形貌可以有效優(yōu)化其SERS性能。除了常見的納米球和納米棒外[38],越來越多的研究者致力于開發(fā)不同形貌的SERS基底,以最優(yōu)化SERS增強(qiáng)性能,如納米星、納米籠、納米花、納米線等[39, 40]。通過在納米顆粒表面穩(wěn)定構(gòu)建尖銳的點(diǎn)、峰亦或者內(nèi)部縫隙,能夠產(chǎn)生更多的“熱點(diǎn)”,從而實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)數(shù)量級(jí)的增加。因此,調(diào)控設(shè)計(jì)等離激元貴金屬的形貌對(duì)于獲得高活性的SERS 基底具有十分重要的意義。如圖5(a-c)所示,我們課題組常年來致力于開發(fā)不同內(nèi)核形貌的超高增強(qiáng)性能GERTs,包括基于納米籠、納米棒以及納米三角片的GERTs等。相較于傳統(tǒng)形貌的GERTs探針而言,得益于花瓣?duì)畹亩嘀Y(jié)構(gòu)(圖5 d和e),為拉曼報(bào)告分子提供了更多的“熱點(diǎn)”?；ò曛g的縫隙結(jié)構(gòu)(圖5 f),為報(bào)告分子帶來了更大更穩(wěn)定的電磁場(chǎng)增強(qiáng)效果,無論是模擬計(jì)算還是拉曼光譜檢測(cè),都證明了花瓣?duì)頖ERTs具有更高的靈敏度[8]。

圖5 不同內(nèi)核形狀的GERTs[8]:(a)納米籠。比例尺為 50 nm。(b)納米棒。比例尺為50 nm。(c)納米三角片。比例尺為20 nm。(d)花瓣?duì)钔鈿ERTs的示意圖。(e)花瓣?duì)頖ERTs的低分辨率TEM圖像。比例尺為50 nm。(f)花瓣?duì)頖ERTs的高分辨率TEM圖像。比例尺為10 nm。圖c中的紅色和黃色箭頭分別表示花瓣?duì)頖ERTs內(nèi)核與外殼之間的內(nèi)部縫隙以及外殼上花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)之間的外部納米間隙Fig.5 GERTs from metallic cores with different shapes[8]:(a) nanocage (scale bar is 50 nm), (b) nanorods (scale bar is 50 nm), and (c) nanotriangular sheets (scale bar is 20 nm). (d) Schematic diagrams of GERTs with a petal-like shell (P-GERTs). (e) Representative low-resolution TEM image of Petal-GERTs. (f) The high-resolution TEM images of Petal-GERTs. The red and yellow arrows in panel c indicate the internal gap between the core and shell of Petal-GERTs and the external nanogap between the petal-like structures on the shell, respectively

2.2 探針的修飾及功能化

為了提高SERS探針的穩(wěn)定性和生物相容性,通常會(huì)對(duì)其進(jìn)行表面修飾。同時(shí),表面涂層也可以緩解存在大量蛋白質(zhì)的生物環(huán)境中SERS探針被蛋白質(zhì)包覆而形成蛋白冠的問題。當(dāng)前,常見SERS探針的保護(hù)層有二氧化硅和聚合物等。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中,為了實(shí)現(xiàn)SERS探針與待測(cè)目標(biāo)物的特異性識(shí)別,通常根據(jù)表面受體或蛋白的表達(dá)水平選擇對(duì)應(yīng)的特異性抗體、短肽等對(duì)SERS探針進(jìn)行功能化,從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向。如圖6所示,我們首先在GERTs外修飾了介孔二氧化硅層,來提高探針的穩(wěn)定性和生物安全性。在進(jìn)行氨基化以及釓(Gd)負(fù)載后,進(jìn)一步連接葉酸(FA)小分子和依魯替尼(Ibrutinib)分別來實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向和治療。最終基于功能化的GERTs實(shí)現(xiàn)了腫瘤的CT/MR/SERS多模態(tài)成像和診療一體化。此外,體內(nèi)生物分布和長(zhǎng)期毒性研究表明,Gd-GERT具有良好的生物相容性和生物安全性。因此,Gd-GERT作為一種多功能納米平臺(tái),在術(shù)前精確的CT/MRI診斷和術(shù)中拉曼成像指導(dǎo)癌癥切除方面具有巨大的潛力[27]。

圖6 FA-Gd-GERTs@Ibrutinib的合成過程和多模態(tài)成像[27]?；诨瘜W(xué)/光熱療法的腫瘤物理屏障破壞和微環(huán)境重建,以實(shí)現(xiàn)腫瘤中CAR-T浸潤(rùn)增強(qiáng)Fig.6 The synthesis process of FA-Gd-GERTs@Ibrutinib and schematic illustrations of multi-modal imaging and the chemo/photothermal-therapy-based destruction of physical tumor barriers and the reconstruction of the microenvironment to achieve enhanced CAR-T infiltration in tumors[27]

3 縫隙增強(qiáng)拉曼探針的光學(xué)屬性

3.1 遠(yuǎn)場(chǎng)和近場(chǎng)光學(xué)屬性

根據(jù)經(jīng)典電磁理論,極窄的金屬縫隙結(jié)構(gòu)可以使金屬核與金屬外殼產(chǎn)生強(qiáng)的等離激元耦合作用,因此在縫隙中產(chǎn)生很高的電磁場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)。然而,金屬間的縫隙不能無限變窄,已有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)縫隙結(jié)構(gòu)寬度減至亞納米級(jí)別時(shí),一些量子效應(yīng)(比如電子隧穿效應(yīng))可能產(chǎn)生顯著影響,它會(huì)以與經(jīng)典理論完全不同的方式改變金屬納米縫隙結(jié)構(gòu)的光學(xué)特性,影響該結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)場(chǎng)和近場(chǎng)光學(xué)響應(yīng),導(dǎo)致電場(chǎng)增強(qiáng)被削弱,但又可能帶來額外的化學(xué)增強(qiáng)效應(yīng)。含時(shí)密度泛函理論(Time-dependent density functional theory, TDDFT)證明,對(duì)于核殼縫隙寬度低于0.4 nm的核殼金屬顆粒,納米間隙結(jié)構(gòu)內(nèi)會(huì)發(fā)生明顯的隧穿效應(yīng),并顯著改變核殼顆粒的吸收截面和局部電場(chǎng)增強(qiáng)[36]。

因此我們專門探究了GERTs內(nèi)部縫隙結(jié)構(gòu)尺寸與其光學(xué)特性之間的關(guān)系。通過量子校正模型(quantum-corrected model,QCM)模擬計(jì)算的消光光譜與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的吸收光譜非常吻合,而傳統(tǒng)電磁理論模型計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合,可能意味著GERTs內(nèi)部同樣存在電子隧穿效應(yīng)的影響。我們通過控制報(bào)告分子1,4-BDT在納米金核上的吸附行為,精確調(diào)控了GERTs的縫隙結(jié)構(gòu)寬度,以進(jìn)一步研究GERT的遠(yuǎn)場(chǎng)和近場(chǎng)光學(xué)性質(zhì)。遠(yuǎn)場(chǎng)光譜中共振峰的變寬和SERS光譜都證明了GERTs縫隙結(jié)構(gòu)中存在電子傳輸現(xiàn)象,并影響了顆粒的近場(chǎng)光學(xué)響應(yīng),表現(xiàn)為SERS信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生變化。我們研究表明SERS最強(qiáng)時(shí)的縫隙寬度值為約1.4 nm(785 nm激發(fā)時(shí))或1.8 nm(633 nm激發(fā)時(shí))。該研究結(jié)果在一定程度上顛覆了傳統(tǒng)認(rèn)知——即認(rèn)為在金屬顆粒表面吸附盡可能多的拉曼分子、或縮小等離激元結(jié)構(gòu)中的間隙一定可提高SERS性能。同時(shí),該研究還證實(shí)GERT可以用來研究納米分子層間隙引起的電荷傳輸、及其對(duì)增強(qiáng)拉曼信號(hào)的影響,使得研究者能夠以SERS測(cè)試為手段,研究金核-納米縫隙(1,4-BDT分子層)-金殼GERTs的近場(chǎng)光學(xué)特性的變化,證實(shí)顆粒的拉曼增強(qiáng)信號(hào)的最高值受限于縫隙結(jié)構(gòu)內(nèi)的電子傳輸效應(yīng)。

3.2 單顆粒檢測(cè)靈敏度

GERTs探針在高精度檢測(cè)和超靈敏生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域具有很大的前景?；谇捌趯?duì)GERTs內(nèi)部縫隙大小、拉曼報(bào)告分子、基底材料、探針形貌等參數(shù)的調(diào)控和優(yōu)化,可實(shí)現(xiàn)SERS性能的最大化,目前已能達(dá)到單顆粒的檢測(cè)靈敏度。我們前期使用顯微拉曼結(jié)合原子力顯微鏡或掃描電子顯微鏡進(jìn)一步研究了GERTs在固態(tài)下的單顆粒SERS特性。如圖7所示,在通過原子力顯微鏡(圖7 a-b)或者掃描電子顯微鏡(圖7 d-e)確定單個(gè)GERT顆粒后,進(jìn)行拉曼光譜采集,均能檢測(cè)到信噪比極好的特征拉曼光譜(圖7 c和f),證明了GERTs的單顆粒檢測(cè)能力[8, 25]。

圖7 GERTs單顆粒檢測(cè)[8, 25] (a)原子力顯微鏡結(jié)合拉曼光譜儀進(jìn)行GERTs的單顆粒檢測(cè)示意圖。(b)硅片上GERTs的原子力顯微成像。標(biāo)尺為5 μm。插圖顯示了單個(gè)GERT的橫截面輪廓。(c)圖b中三個(gè)GERT(顆粒1、2和3)在接觸和非接觸模式下的SERS光譜。所有光譜測(cè)量采用633 nm激光,110 μW功率,10 s采集時(shí)間,×100物鏡。(d)拉曼成像和掃描電鏡進(jìn)行GERTs的單顆粒檢測(cè)示意圖。(e)硅片上GERTs的明場(chǎng)圖像和三個(gè)GERT相應(yīng)的掃描電鏡圖(SEM,如箭頭表示)。BF圖像比例尺為20 μm,SEM圖像比例尺為1 μm。(f)圖e中三個(gè)GERT(顆粒1、2和3)的SERS光譜。拉曼光譜測(cè)量采用785 nm激光,1 mW功率,20 s采集時(shí)間,×100物鏡Fig.7 Single-nanoparticle Raman analysis of GERTs. (a) Schematic illustration of AFM-correlated Raman spectroscopy[8, 25]. (b) A representative AFM image of GERTs on silicon wafer. The scale bar is 5 μm. The inset shows a typical cross-section profile of a single GERT. (c) SERS spectra of three single GERT (particle 1, 2, and 3) indicated in panel b measured in contact and non-contact modes. All measurements were performed with a 633 nm laser, 110 μW power, 10 s acquisition time, and ×100 objective lens. (d) Schematic illustration of the Raman imaging and scanning electron microscopy (RISE) system. (e) A representative bright-field (BF) image of GERTs on a silicon wafer and the corresponding scanning electron microscopy (SEM) images of three selected single GERT (indicated by arrows). Scale bars are 20 μm for the BF image and 1 μm for SEM images. (f) SERS spectra of three single GERT (particle 1, 2 and 3) indicated in panel (e). Raman measurements were performed using a 785 nm laser, 1 mW power, 20 s acquisition time, and ×100 objective lens

3.3 穩(wěn)定性

SERS探針的穩(wěn)定性包括其在各種環(huán)境中的材料穩(wěn)定性以及在光連續(xù)激發(fā)的情況下仍保持較好拉曼信號(hào)的光學(xué)穩(wěn)定性。GERTs的拉曼報(bào)告子由于位于金屬顆粒內(nèi)部,金屬外殼有效地將拉曼報(bào)告分子與外界的水分、空氣和環(huán)境隔絕,避免了可能發(fā)生的光化學(xué)反應(yīng),這將極大地提升探針的材料穩(wěn)定性,所以GERTs特別適合應(yīng)用于各種生物環(huán)境中的檢測(cè)和成像[9]。

圖8 GERTs的光穩(wěn)定性測(cè)試[9]。(a)硅片上固態(tài)GERTs以4.71×105 W/cm2激光連續(xù)照射30 min的時(shí)間分辨光譜。(b)不同時(shí)間點(diǎn)的代表性SERS光譜Fig.8 Photostability of GERTs[9]. (a) Photostability measurement of time-resolved SERS spectra of solid GERTs on a silicon wafer during continuous irradiation for 30 min at a power density of 4.71×105 W/cm2. (b) Three representative SERS spectra at selected irradiation times in panel a

4 縫隙增強(qiáng)拉曼探針的應(yīng)用

4.1 光學(xué)信息安全

防偽標(biāo)簽是目前解決假冒商品最經(jīng)濟(jì)和有效的方案之一,其安全性取決于目前制備工藝的技術(shù)壁壘和控制獲取加工材料的有限途徑,缺乏嚴(yán)格意義上的安全性?；谖锢聿豢煽寺『瘮?shù)(physical unclonable functions, PUF)的防偽標(biāo)簽由于其固有的隨機(jī)性、易于生成卻難以復(fù)制等優(yōu)點(diǎn),是目前防偽領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。GERTs由于具有超強(qiáng)的拉曼信號(hào)、較窄拉曼半峰寬帶來的超大編碼能力以及探針的超穩(wěn)定性,特別適用于PUF標(biāo)簽。最近我們課題組制備了一種基于GERTs的PUF標(biāo)簽(如圖9a),該標(biāo)簽通過簡(jiǎn)單地直接滴加GERTs溶液到基底上來制備,由于納米顆粒在基底上的隨機(jī)分布及產(chǎn)生的隨機(jī)圖案使得無法通過任何手段偽造。使用共焦拉曼系統(tǒng)進(jìn)行高速讀取,將每個(gè)像素上的拉曼信號(hào)進(jìn)行數(shù)字化,實(shí)現(xiàn)了基于探針空間位置、探針種類、探針拉曼強(qiáng)度的超高編碼容量。由10種不同類型的GERTs組成的PUF標(biāo)簽,采用2500像素的掃描分辨率,每個(gè)像素的拉曼強(qiáng)度水平為四進(jìn)制編碼,可以實(shí)現(xiàn)超過3 × 1015051的三維編碼容量(圖9b)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)保證了PUF系統(tǒng)的魯棒性和安全性,并證明了其實(shí)用可行性[13]。通過引入在1800-2800 cm-1波段具有特征拉曼信號(hào)的正交報(bào)告分子構(gòu)建正交拉曼探針(orthogonal GERTs,O-GERT),將O-GERT隨機(jī)分布到聚合物中,可形成基于探針頻率、強(qiáng)度和三維空間等共五維信息的超大編碼容量(～105852)和超高信息密度(～105844Tbit cm-3)的PUF編碼。聚合物基體可以為標(biāo)簽提供很好的機(jī)械保護(hù),同時(shí)又不會(huì)干擾其靜默區(qū)的拉曼信號(hào)編碼。我們進(jìn)一步結(jié)合微流控滑動(dòng)芯片技術(shù)可以快速(約10分鐘)和高通量(每次可生產(chǎn)數(shù)萬個(gè))地大規(guī)模生產(chǎn)這些標(biāo)簽,并結(jié)合微圖案化與二維QR碼進(jìn)行集成,提供多層信息防偽[10, 11]。

圖9 基于GERTs的物理不可克隆(physical unclonable functions, PUF)防偽標(biāo)簽[13]。(a)基于拉曼信號(hào)的物理不可克隆函數(shù)標(biāo)簽制備過程包括:制備含有不同報(bào)告分子的GERTs探針,不同種GERTs隨機(jī)形成二維(2D)圖案,以及PUF標(biāo)簽的讀出。(b)基于GERTs探針的PUF標(biāo)簽編碼容量。10種GERTs探針可以實(shí)現(xiàn)410×2500 (3.2×1015051)的編碼容量Fig.9 Physical unclonable functions (PUF) anti-counterfeiting labels based on GERTs[13]. (a) The preparation process of PUF labels based on Raman signals includes: synthesis of GERTs probes containing different Raman reporters, random formation of two-dimensional (2D) patterns by different kinds of GERTs, and readout of PUF tags. (b) Calculation of the encoding capacity of a Raman PUF label. The encoding capacity of 10 different GERTs will be 410×2500 (3.2×1015051)

隱寫術(shù)是另一種提供信息傳輸安全的方法。它是指將要傳輸?shù)男畔㈦[藏在另一媒介(視頻、音頻、圖像、文本等)中。隱寫術(shù)隱藏了信息的存在,故不會(huì)引起別人的懷疑,保證了信息的安全。我們?cè)鴪?bào)道開發(fā)了一種基于GERTs的拉曼墨水用于隱寫術(shù)。通過將兩種不同的GERTs摻入普通墨水,得到兩種具有不同拉曼信號(hào)的拉曼墨水用于多色隱寫[6]。在785 nm非共振激發(fā)下,GERTs墨水能夠產(chǎn)生顯著的特征拉曼信號(hào),同時(shí)墨水的背景干擾很低,證明其用于信息編碼的優(yōu)越性。不同的拉曼墨水能夠同時(shí)用一種波長(zhǎng)激發(fā),有效縮短了成像時(shí)間。同時(shí),GERTs墨水具有好的光穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性,保證了書寫文本的長(zhǎng)效性。實(shí)驗(yàn)中用兩種制得的GERTs墨水和普通墨水進(jìn)行多色隱寫,總共能提取出七種不同的信息組合。拉曼墨水出色的多指標(biāo)編碼能力保證了隱寫系統(tǒng)的安全性和可靠性,因而在信息安全領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.2 體外檢測(cè)

膽固醇是人體許多過程的重要分子,通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平,可以在早期發(fā)現(xiàn)許多疾病,如高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝功能障礙。如圖10a所示,我們?cè)O(shè)計(jì)了內(nèi)嵌有標(biāo)準(zhǔn)拉曼內(nèi)標(biāo)分子1,4-BDT的金銀核殼GERTs,用于H2O2和膽固醇的無損檢測(cè)。經(jīng)典的最小二乘(Classic Least Square, CLS)光譜擬合方法使我們能夠從復(fù)用的光譜中準(zhǔn)確地提取內(nèi)標(biāo)物(1,4-BDT)和目標(biāo)分子4-巰基苯硼酸(4-MPBA)和4-羥基苯硫酚(4-HBT)的拉曼信號(hào)。嵌入的內(nèi)標(biāo)分子可用于校準(zhǔn)獲得的拉曼信號(hào),消除由不同的測(cè)量條件和納米顆粒的局部狀態(tài)(如聚集)引起的波動(dòng)。因此,SERS信號(hào)的再現(xiàn)性得到了極大地改善,并且在檢測(cè)的工作曲線中得到了更好的線性關(guān)系。進(jìn)一步使用這些GERTs,我們?cè)趩渭?xì)胞水平上對(duì)溶液和活細(xì)胞內(nèi)的H2O2和膽固醇實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)[14]。

圖10 基于GERTs納米探針的體外檢測(cè)。(a)膽固醇的定量檢測(cè)[14]。(b)與側(cè)流免疫分析結(jié)合實(shí)現(xiàn)人絨毛膜促性腺激素的定量檢測(cè)[41]Fig.10 In vitro detection based on GERTs. (a) Schematic illustration of SERS nanoprobes with the embedded internal standard for quantitative detection of cholesterol via the Raman spectral fitting method[14]. (b) Quantitative detection of human chorionic gonadotropin combined with lateral flow immunoassay[41]

得益于GERTs核殼結(jié)構(gòu)的特質(zhì),內(nèi)部拉曼報(bào)告分子具有良好的光穩(wěn)定性和信號(hào)重復(fù)性,即使在團(tuán)聚狀態(tài)下也可以保持線性的信號(hào)響應(yīng),非常適合定量和高靈敏的體外檢測(cè)。因此,我們將GERTs進(jìn)行抗原抗體修飾后,用于側(cè)流免疫分析(Lateral Flow Immunoassay, LFIA)(見圖10b),測(cè)定人絨毛膜促性腺激素實(shí)驗(yàn)室樣本的檢測(cè)極限低至0.7 mIU/mL(0.077 ng/mL)[41],遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)肉眼檢測(cè)、非定量試紙的檢測(cè)限(通常為10 mIU/mL以上)。

4.3 體內(nèi)檢測(cè)和成像

前哨淋巴結(jié)活檢作為研究惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的方法,在臨床應(yīng)用廣泛。術(shù)中準(zhǔn)確定位前哨淋巴結(jié)(SLN)是前哨淋巴結(jié)活檢的重要前提,因此,合適的SLN示蹤劑尤為重要。目前臨床常用的SLN示蹤劑是藍(lán)色染料(如亞甲藍(lán))、放射性同位素、近紅外熒光染料(如吲哚菁綠)。但是,藍(lán)染法和熒光染料法所使用的小分子染料的主要問題是,由于小分子染料示蹤劑在淋巴管中擴(kuò)散速度快,很快從SLN遷移到二站淋巴結(jié)(2ndLN),手術(shù)窗口很短,且容易引起誤判和過多切除。

我們?cè)鴪?bào)道將GERTs作為新型示蹤劑用于SLN的術(shù)中定位和成像。得益于GERTs合適的粒徑,它在SLN內(nèi)能夠停留較長(zhǎng)時(shí)間(數(shù)小時(shí)),為醫(yī)生提供足夠的手術(shù)時(shí)間窗口。利用小鼠及新西蘭兔模型對(duì)GERTs作為SLN示蹤劑的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。在小鼠模型前哨淋巴結(jié)的結(jié)果表明GERTs能夠在SLN停留24小時(shí)以上[26]。在新西蘭兔模型上我們開展了更詳細(xì)的研究(如圖11所示),表明GERTs能夠在10分鐘內(nèi)到達(dá)SLN,4小時(shí)內(nèi)在2ndLN以多種方式(拉曼成像法以及原子吸收光譜法)均沒有探針信號(hào)的檢出,這為外科醫(yī)生提供長(zhǎng)時(shí)間窗口來區(qū)分SLN和二站淋巴結(jié)。此外,超高靈敏度的GERTs(檢測(cè)極限為0.5 pM)使得在術(shù)前能夠檢測(cè)到標(biāo)記的SLN,從而為微創(chuàng)手術(shù)提供位置信息。我們已根據(jù)食品和藥物管理局(CFDA)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO)對(duì)于納米材料的生物安全性要求,對(duì)GERTs進(jìn)行了詳盡的生物安全性評(píng)估。評(píng)估結(jié)果表明,各項(xiàng)指標(biāo)均顯示GERTs無顯著毒性。這為GERTs的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了有利的機(jī)遇,使其可用于準(zhǔn)確識(shí)別乳腺癌患者腋窩部位的SLN[23, 26]。

圖11 基于GERTs的術(shù)中SLN準(zhǔn)確定位和微創(chuàng)手術(shù)[23]。GERTs在術(shù)前乳頭皮下注射,按摩后遷移到SLN。通過手持式拉曼探針,可以在10分鐘內(nèi)可以根據(jù)GERTs的獨(dú)特拉曼信號(hào)定位SLN,同時(shí)4 h內(nèi)未在二站淋巴結(jié)檢測(cè)到信號(hào),從而為手術(shù)提供了合適的時(shí)間窗口,避免了不必要的淋巴結(jié)清掃Fig.11 Schematic illustration of SLNs detection using Raman nanotags of GERTs[23]. GERTs are injected subcutaneously before the surgery and migrate to SLNs after a gentle massage. SLNs can be in vivo identified from the unique Raman signal of GERTs within 10 min by a hand-held Raman probe. GERTs only reach the 2nd LNs after 4 h, which provides a suitable time window for surgery and avoids excessive resection of the LNs

基于對(duì)SLN定位的精確性,我們進(jìn)一步提出了“雙探針比值法”。該方法運(yùn)用了兩種GERTs:即具有葉酸功能的靶向和非靶向GERTs。當(dāng)兩種探針到達(dá)前哨淋巴結(jié)后,前者可以特異性靶向淋巴結(jié)中的腫瘤細(xì)胞,而后者只是被動(dòng)停留在淋巴結(jié)內(nèi)或被該處的巨噬細(xì)胞吞噬,因此兩者在淋巴結(jié)中的含量可能不同。我們將兩種探針注射到動(dòng)物模型,對(duì)SLN進(jìn)行拉曼成像掃描,結(jié)合經(jīng)典最小二乘數(shù)據(jù)處理方法,實(shí)現(xiàn)了在手術(shù)中判斷SLN是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的診斷。這一方法在SLN轉(zhuǎn)移的診斷方面可能優(yōu)于目前的組織病理學(xué)評(píng)估方法,并且有望在未來指導(dǎo)外科手術(shù)的決策[28]。

4.4 多功能成像和治療

晚期卵巢癌患者通常會(huì)出現(xiàn)腹部粟粒性播散和轉(zhuǎn)移。目前,細(xì)胞減滅術(shù)(CRS)結(jié)合溫?zé)岣骨换?HIPEC)是治療晚期卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而,由于手術(shù)難以完全切除微小腫瘤,大多數(shù)患者的CRS效果并不理想。雖然HIPEC可以改善預(yù)后,但其治療效果缺乏針對(duì)性,可能導(dǎo)致健康器官損傷和并發(fā)癥。因此,亟需新的多功能(multi-functional)策略來精確檢測(cè)和無副作用地根除播散性微腫瘤。我們?cè)鴪?bào)道開發(fā)了順鉑負(fù)載的GERTs,專門用于術(shù)中檢測(cè)和根除難以切除的播散性晚期卵巢腫瘤(圖12)[31]。GERTs具有獨(dú)特且高靈敏度的拉曼信號(hào)、良好的生物相容性、優(yōu)越的等離子體光熱轉(zhuǎn)換性能以及藥物負(fù)載能力。這使得它們可以高效檢測(cè)到直徑為1毫米的微腫瘤進(jìn)而通過化學(xué)光熱協(xié)同的方式特異性殺滅腫瘤細(xì)胞,以達(dá)到最小副作用,并顯著延長(zhǎng)小鼠的生存期。結(jié)果表明,GERTs引導(dǎo)的化學(xué)光熱協(xié)同治療可以有效控制小鼠播散性腫瘤的擴(kuò)散,有望成為治療晚期卵巢癌的安全有效方法,提升患者的生存率和生活質(zhì)量[31]。此外,基于相同策略,GERTs探針同樣實(shí)現(xiàn)了前列腺癌殘余微腫瘤的檢測(cè)和根除[30]。因此,GERTs引導(dǎo)的手術(shù)不僅有效預(yù)防了癌癥的局部復(fù)發(fā),而且實(shí)現(xiàn)了殘余微腫瘤的精確檢測(cè)和去除,擴(kuò)展了GERTs探針在治療性精確醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

圖12 基于負(fù)載順鉑的GERTs對(duì)腹部播散性微腫瘤進(jìn)行拉曼檢測(cè)和化療-光熱協(xié)同治療。腸道上的腫瘤代表晚期播散性卵巢微小腫瘤[31]Fig.12 Raman-guided detection and chemo-photothermal synergistic therapy of abdominal disseminated microtumors with cisplatin-loaded gap-enhanced Raman tags (C-GERTs). The tumors on the intestine represent advanced disseminated ovarian microtumors[31]

5 總結(jié)與展望

本文綜述了近年來我們課題組有關(guān)GERTs探針的制備方法以及其在信息安全和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展。GERTs作為一種具備高靈敏度和廣泛應(yīng)用前景的納米材料,在近年來引起了廣泛的研究興趣。其出色的性能不僅得益于高性能的拉曼增強(qiáng)效應(yīng),還源于其優(yōu)越的物理化學(xué)穩(wěn)定性,這為GERTs在多個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在GERTs制備方面,我們已經(jīng)開發(fā)出多種方法來合成高質(zhì)量的GERTs,這些方法不僅能夠有效地控制GERTs的形貌和結(jié)構(gòu),還能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。這為實(shí)際應(yīng)用提供了可行性,同時(shí)也為進(jìn)一步的研究和優(yōu)化提供了平臺(tái)。

盡管GERTs在眾多領(lǐng)域中取得了顯著的應(yīng)用,然而仍然存在一些亟待解決的問題。這些問題主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面,需要進(jìn)一步的深入研究和探索:(1)GERTs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的潛力,但其在實(shí)際應(yīng)用中還需要考慮其生物相容性和毒性等問題。我們需要收集更多的數(shù)據(jù)和進(jìn)行系統(tǒng)性的研究,以評(píng)估GERTs在生物體內(nèi)的長(zhǎng)期影響和安全性,從而確保其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的可靠應(yīng)用。此外,針對(duì)探針與生物體相互作用的機(jī)制,還需要進(jìn)行更深入的在分子水平的研究,以揭示其在生物環(huán)境中的行為和效應(yīng)。(2)作為一種光譜技術(shù),生物組織的穿透能力是制約其真正臨床應(yīng)用的另一個(gè)關(guān)鍵問題。光在生物組織中的吸收和散射會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度,從而限制了成像深度和分辨率。因此,研究者們需要探索新的成像方法和技術(shù),以克服這一限制,如將GERTs與深穿透拉曼技術(shù)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)更深層次的檢測(cè)和成像。(3)組織對(duì)于近紅外二區(qū)的光子的吸收和散射效應(yīng)進(jìn)一步減弱,這為將GERTs應(yīng)用推向近紅外二區(qū)提供了契機(jī)。這不僅能提高成像的安全性,降低對(duì)生物體的損傷,同時(shí)還有望提高成像的分辨率和信號(hào)強(qiáng)度,從而更好地滿足臨床和研究的需求。隨著不斷的深入研究和技術(shù)發(fā)展,新型、穩(wěn)定、高亮度的GERTs有望成為一種重要的納米材料,為實(shí)際應(yīng)用和科學(xué)研究提供更為廣闊的可能性。通過不斷的創(chuàng)新和合作,我們相信GERTs將來可以克服以上的挑戰(zhàn),進(jìn)一步推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展和進(jìn)步。