馥芳艾納香組培快繁體系的初步研究

黃若干 周淑瑤 藍(lán)曉東 江紫薇 吳祿祥

1.廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司，廣西 南寧 530002；2.廣東漢潮中藥科技有限公司，廣東 廣州 510145

0 引言

馥芳艾納香（Blumea aromaticaDC.）為菊科艾納香屬的粗壯草本或亞灌木狀的植物，全草可入藥，味辛、微苦，性溫，具有祛風(fēng)消腫、活血止癢的功效，主治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、濕疹、皮膚瘙癢及外傷出血等［1］。馥芳艾納香主要分布于我國云南省、四川省、貴州省、廣西壯族自治區(qū)（以下簡稱廣西）等地，多生長于低山林緣、荒坡或山谷路旁［2］。馥芳艾納香在廣西有著悠久的用藥歷史，民間常用于風(fēng)濕骨痛、皮膚瘙癢等癥的治療，廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司以馥芳艾納香為主藥開發(fā)了風(fēng)濕骨痛純壯藥制劑——華佗風(fēng)痛寶片（膠囊）、祛風(fēng)濕藥酒等品種。近年來，隨著市場和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，馥芳艾納香市場需求量逐年增加，加劇了人們對馥芳艾納香野生資源的過度開采。在自然條件下馥芳艾納香種子發(fā)芽率極低，種子壽命較短，不利于馥芳艾納香的推廣種植。因此，資源緊缺現(xiàn)已成為制約馥芳艾納香藥材及制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一［3］。

目前，國內(nèi)尚未大面積開展馥芳艾納香人工栽培，關(guān)于馥芳艾納香人工栽培的研究報(bào)道也較少。因此，筆者以馥芳艾納香種子為外植體，探索外植體消毒最佳時(shí)間，繼代增殖、生根培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基，初步建立馥芳艾納香組培快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)馥芳艾納香大面積人工栽培生產(chǎn)、提高藥材產(chǎn)量和品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2023年1月，于廣西河池市采集馥芳艾納香種子，要求采種母株生長健壯、無病蟲害。種子采收后，晾曬干燥，篩除雜質(zhì)，于陰涼處貯藏備用。

試驗(yàn)試劑有無水乙醇（分析純），由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；氯化汞溶液（分析純），由天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；α-萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA），由阿拉丁化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；6-芐氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA），由阿拉丁化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；蔗糖，由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；瓊脂，由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

以MS 為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30.0 g/L、pH 值調(diào)為6.0～6.2，配制分裝后，于116 ℃、0.1 MPa的條件下滅菌30 min。

1.2.2 初代培養(yǎng)

將馥芳艾納香種子用自來水沖洗5 min，濾紙吸干水分。于超凈工作臺(tái)中，將種子用75%乙醇浸泡30 s，再用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒8 min，消毒時(shí)不斷搖動(dòng)燒杯。消毒后，用無菌水清洗3 次，每次清洗1 min，期間不斷搖晃燒杯。將消毒后的種子接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)［4］。

1.2.3 繼代培養(yǎng)

挑選健壯、長勢較好的叢生芽，以MS 為基本培養(yǎng)基，探索6-BA（1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2 mg/L）不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合（共8個(gè)處理）對馥芳艾納香繼代培養(yǎng)的影響。每瓶接種1 個(gè)叢生芽，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次。

1.2.4 生根培養(yǎng)

挑選生長至1.5 cm 的健壯不定芽，將其接種于不同的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，研究不同質(zhì)量濃度的NAA（0.1、0.3、0.8、1.5、2.0 mg/L）對馥芳艾納香生根培養(yǎng)的影響。每瓶接種1個(gè)不定芽，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 繼代培養(yǎng)階段

接種20 d后，統(tǒng)計(jì)馥芳艾納香的增殖系數(shù)、玻璃化率，觀察不定芽的生長狀況，篩選出馥芳艾納香適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。

1.3.2 生根培養(yǎng)階段

接種20 d后，統(tǒng)計(jì)馥芳艾納香的生根率、平均主根數(shù)、平均主根長、平均株高，觀察組培苗的生長情況，篩選出馥芳艾納香適宜的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 28.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對馥芳艾納香繼代培養(yǎng)的影響

由表1 可知，不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合下，馥芳艾納香的繼代增殖效果存在較大差異。各處理不定芽生長情況如圖1 所示。以增殖系數(shù)為主要指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)H2處理馥芳艾納香的增殖系數(shù)最高（9.4），且不定芽生長健壯，呈嫩綠色。其次為H3處理，增值系數(shù)為2.3。綜合考慮馥芳艾納香的增值系數(shù)及生長情況，最終選擇添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。

表1 馥芳艾納香的繼代培養(yǎng)效果

圖1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合下馥芳艾納香生長情況

2.2 不同質(zhì)量濃度NAA 對馥芳艾納香生根培養(yǎng)的影響

由表2 可知，隨著NAA 質(zhì)量濃度的升高，馥芳艾納香的生根率呈先下降后升高的趨勢。F1、F2組培苗生長狀況如圖2 所示。其中，NAA 質(zhì)量濃度為0.1、1.5、2.0 mg/L時(shí)，馥芳艾納香的生根率均為100%，生根效果較好。以生根率為主要指標(biāo)，綜合考慮馥芳艾納香組培苗的平均主根長和根的生長情況，最終選擇添加0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香適宜的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表2 馥芳艾納香的生根培養(yǎng)效果

圖2 不同質(zhì)量濃度NAA處理下馥芳艾納香生根情況

3 討論與結(jié)論

近年來，馥芳艾納香市場需求量不斷增加，但馥芳艾納香種子在自然條件下自我繁殖困難，且新優(yōu)品種難以采用扦插、嫁接、播種等方式進(jìn)行繁殖。一般通過組培繁殖技術(shù)實(shí)現(xiàn)具有優(yōu)良特性的馥芳艾納香種苗的培育。應(yīng)用組培快繁技術(shù)可以短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出無菌、無毒、健康、性狀一致的優(yōu)質(zhì)種苗，是解決馥芳艾納香種苗短缺、實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的有效方法之一［5］。

植物生長調(diào)節(jié)劑是促進(jìn)植物組織分化的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，不同組合及質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑可能會(huì)刺激植物不同控制基因的酶類，從而影響植物內(nèi)源激素的水平，進(jìn)而影響植物不定芽的增殖效果和植株的生長狀態(tài)［6-7］。因此，篩選適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑組合及質(zhì)量濃度是建立植物組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵。此次研究發(fā)現(xiàn)，在馥芳艾納香外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，6-BA的質(zhì)量濃度對外植體的增殖系數(shù)起著關(guān)鍵作用。外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d 后，其增殖系數(shù)隨著6-BA 質(zhì)量濃度的增加而下降，說明高質(zhì)量濃度的6-BA 不利于馥芳艾納香的繼代增殖。此次試驗(yàn)中，以增殖系數(shù)為主要指標(biāo)，結(jié)合不定芽的生長情況，篩選出添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。

植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度也是影響植物組培苗生根的關(guān)鍵因素。此次研究發(fā)現(xiàn)，隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，馥芳艾納香的生根率和平均主根長均呈先下降后升高的趨勢，最終篩選出添加0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香不定芽適宜的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，組培苗的平均主根長達(dá)5.9 cm，且主根粗壯，有利于組培苗后期順利經(jīng)過煉苗階段。

綜上所述，馥芳艾納香種子以75%乙醇和0.1%氯化汞溶液消毒后，于無菌條件下接種在添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)可得到叢生芽。切下誘導(dǎo)出的叢生芽，將其接種于添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成不定芽。將不定芽接種于添加0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)其生根。此次試驗(yàn)可為構(gòu)建馥芳艾納香組培快繁體系奠定基礎(chǔ)。