一個(gè)基于當(dāng)?shù)靥厣木C合化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)*

易冰陽，陳子川，譚巧巧，王 麗，徐建軍

(湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 孝感 432000)

湖北省孝感安陸市擁有我國目前現(xiàn)存的兩大自然狀態(tài)古銀杏群落之一，是著名的“銀杏之鄉(xiāng)”。當(dāng)?shù)卣劳秀y杏種植進(jìn)行了旅游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但對(duì)于銀杏自身價(jià)值挖掘不多。銀杏不僅果實(shí)具有很好的藥用價(jià)值，銀杏葉也具有通脈舒絡(luò)、益心斂肺的功效。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)銀杏葉提取物的化學(xué)成分、藥理功效進(jìn)行了廣泛研究[1-2]。銀杏葉提取物中含有黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、聚異戊烯醇等多種復(fù)雜成分[3]?？傸S酮是黃酮類化合物的總稱，其不僅在銀杏葉中含量高，還具有很強(qiáng)的藥理活性[4-5]，可以止咳平喘、抗自由基和抗腫瘤的作用，還可以防治心腦缺血損傷、肝損傷及心律失常，同時(shí)還具有皮膚保健功能[6-7]。目前黃酮類化合物主要用于心腦血管類藥物及部分營養(yǎng)品和化妝品的成分[8]。優(yōu)化銀杏葉中黃酮類化合物的提取工藝可以降低企業(yè)成本，有利于相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

筆者所在高校作為孝感市地方本科院校，目前正處在由傳統(tǒng)的理論型人才培養(yǎng)模式向應(yīng)用型人才培養(yǎng)模式進(jìn)行改革的關(guān)鍵時(shí)期。應(yīng)用型人才的培養(yǎng)模式改革中就包括了教學(xué)內(nèi)容的改革，教學(xué)內(nèi)容改革的關(guān)鍵之一就是要滿足地方區(qū)域化經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，要盡可能與地方經(jīng)濟(jì)特色相結(jié)合[9-11]。綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門將基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)和儀器分析實(shí)驗(yàn)有機(jī)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)課程，一般在高年級(jí)開設(shè)，其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容不僅要鍛煉學(xué)生對(duì)所學(xué)專業(yè)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能的綜合應(yīng)用能力，同時(shí)要與地方特色結(jié)合，培養(yǎng)學(xué)生解決地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展中科學(xué)問題的能力?；谝陨峡紤]，在我校開設(shè)銀杏葉中黃酮的提取和結(jié)構(gòu)鑒定實(shí)驗(yàn)不僅可以幫助學(xué)生掌握有機(jī)物提取流程和結(jié)構(gòu)鑒定方法，了解提取工藝對(duì)提取效率的影響，還將為我們的學(xué)生以后服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)打下基礎(chǔ)。

1 文獻(xiàn)查閱和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段

實(shí)驗(yàn)的第一階段為文獻(xiàn)查閱和方案設(shè)計(jì)階段。首先依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)學(xué)生進(jìn)行分組，每組3～4人。安排學(xué)生通過中國知網(wǎng)(CNKI)、RSC、Wiley、ACS和Elsevier等數(shù)據(jù)庫查閱近五年相關(guān)文獻(xiàn)5～10篇，了解銀杏葉中總黃酮的提取方法，提取率影響因素及結(jié)構(gòu)表征分析。然后小組成員對(duì)題目所涉及到的知識(shí)、原理、方法和儀器等進(jìn)行討論，確定好實(shí)驗(yàn)方案并提交老師審核。讓學(xué)生利用課余時(shí)間去查閱文獻(xiàn)，并引導(dǎo)學(xué)生主動(dòng)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，使學(xué)生感受到綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的不同之處。

2 銀杏葉中總黃酮的提取

實(shí)驗(yàn)的第二階段為銀杏葉中總黃酮的提取。文獻(xiàn)中總黃酮的提取方法通常有：回流提取法、超聲提取法和微波提取法等。由于超聲提取法和微波提取法很難開展多組實(shí)驗(yàn)，因此隨機(jī)抽取兩組學(xué)生分別通過超聲提取法和微波提取法進(jìn)行銀杏葉中總黃酮的提取，其他組學(xué)生均通過乙醇回流法提取銀杏葉中的總黃酮?？傸S酮含量均采取硝酸鋁顯色法進(jìn)行測定[12]。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

準(zhǔn)確稱取恒重過的無水蘆丁0.030 0 g，用50%的乙醇溶液配制成100.00 mL溶液備用。用移液管分別移取5.00、10.00、15.00、20.00和25.00 mL的蘆丁溶液于50 mL容量瓶中，依次加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉溶液顯色后定容，測定其在510 nm的吸光度。最后以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)，要求標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合度達(dá)到0.999以上。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)分組及結(jié)果分析

單因素實(shí)驗(yàn)是指在實(shí)驗(yàn)中，保持其他因素不變，只觀察一種因素的變化來確定整體實(shí)驗(yàn)中該因素的具體作用及影響。乙醇回流提取法中影響總黃酮提取效率的因素通常包括提取時(shí)間、提取溫度、液料比、乙醇濃度以及提取次數(shù)等，因此在實(shí)驗(yàn)過程中可以將學(xué)生分為5組，每組以其中一個(gè)因素為對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算不同條件下銀杏葉中總黃酮的提取效率，通過對(duì)比各小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步得出銀杏葉中總黃酮提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，一般要求學(xué)生進(jìn)行2～3次提取實(shí)驗(yàn)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中找出自己的不足進(jìn)行改進(jìn)。由于每一組實(shí)驗(yàn)為一個(gè)單因素，因此在實(shí)驗(yàn)過程中，還要求學(xué)生進(jìn)行團(tuán)隊(duì)合作。

圖2是學(xué)生單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖2 提取時(shí)間(a)、提取溫度(b)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(c)、液料比(d)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2 The effect of extraction time (a)，extraction temperature (b)，ethanol content (c)and liquid-solid ration (d)on the extraction efficiency of ginkgo biloba flavonoids

由圖2可知，延長提取時(shí)間，總黃酮提取率出現(xiàn)先增加，后幾乎不變的趨勢，因此在實(shí)際提取過程，需綜合考慮提取率和提取成本的關(guān)系，以本結(jié)果為例，可選擇提取率最高的4 h作為實(shí)驗(yàn)條件，也可選擇提取率較低的2 h作為實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)榇藭r(shí)雖然提取率較低，但提取的時(shí)間成本和能耗成本更低。從圖2b可以看出，隨著提取溫度的增加，總黃酮提取量不斷增加，這是由于提取溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)速度越快，黃酮類化合物從銀杏葉轉(zhuǎn)移至乙醇中的速率也會(huì)加快，使得提取量不斷增大。但溫度超過乙醇沸點(diǎn)后，乙醇揮發(fā)嚴(yán)重，能耗成本也在不斷增加，因此本例中可選擇70 ℃作為最佳反應(yīng)條件。圖2c為提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效率的影響，由圖2c可知，所使用乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，總黃酮的提取效果越好。銀杏葉提取物主要以有機(jī)物為主，乙醇濃度越大，提取效果越好，符合有機(jī)萃取法的科學(xué)原理。液料比對(duì)總黃酮的提取效率也有著明顯影響，隨著液料比的增大，總黃酮提取率出現(xiàn)了先增加，后減小的趨勢(圖2d)。原因可能是隨著液料比的增加，銀杏葉粉末可以與溶劑進(jìn)行充分的接觸，黃酮類化合物能更好的進(jìn)入溶劑，銀杏葉提取物的總黃酮得率隨之增大。當(dāng)液料比過高時(shí)，會(huì)有更多的雜質(zhì)溶出，或者部分黃酮類化合物與溶劑長時(shí)間接觸會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，使得總黃酮得率降低。

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，讓學(xué)生充分意識(shí)到實(shí)驗(yàn)工藝對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同時(shí)明白在實(shí)際生產(chǎn)中要綜合考慮生產(chǎn)成本和產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率。

3 總黃酮結(jié)構(gòu)初步分析

本實(shí)驗(yàn)的第3階段為樣品的表征階段。目前，鑒定黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的方法主要有顯色反應(yīng)、紫外-可見分光光度法、紅外光譜法、核磁共振和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[13-15]。在此階段，教師可以提前布置任務(wù)，讓學(xué)生自主學(xué)習(xí)各儀器的基本原理，了解不同儀器的功能和使用方法。實(shí)驗(yàn)過程中，可由教師或者有經(jīng)驗(yàn)的研究生助教帶領(lǐng)學(xué)生完成儀器操作過程。在這一過程，學(xué)生對(duì)接觸到的大型儀器設(shè)備興趣非常濃厚，因此大多數(shù)學(xué)生都可以積極主動(dòng)的完成儀器設(shè)備的自主學(xué)習(xí)和實(shí)際操作部分。實(shí)驗(yàn)完成后，教師要進(jìn)一步引導(dǎo)學(xué)生在小組內(nèi)展開討論，通過文獻(xiàn)資料的查閱對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)合理的分析，使學(xué)生在實(shí)踐過程中學(xué)會(huì)透過實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象去探索實(shí)驗(yàn)本質(zhì)，豐富學(xué)生的知識(shí)儲(chǔ)備。最后，學(xué)生需按組提交測試結(jié)果和相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

3.1 顯色反應(yīng)

黃酮類化合物可以發(fā)生多種顯色反應(yīng)，例如：多數(shù)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物可以與鹽酸-鎂粉(或鋅粉)反應(yīng)顯橙紅～紫紅色，少數(shù)顯紫藍(lán)色，兒茶素、查爾酮和橙酮無此顯色反應(yīng)；二氫黃酮類化合物與NaBH4反應(yīng)顯紅色或紫色，其它黃酮類化合物均不顯色，因此NaBH4可專屬鑒別二氫黃酮類化合物；二氫黃酮、二氫黃酮醇類與醋酸鎂的甲醇溶液，加熱可顯天藍(lán)色熒光，而黃酮、黃酮醇及異黃酮類等則顯黃色、橙黃色或褐色。此外還可以通過不同類型的黃酮類化合物在日光下紙斑反應(yīng)顏色的變化來進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其中黃酮醇類化合物會(huì)先變黃色，通空氣后變?yōu)樽厣?，二氫黃酮類化合物則呈現(xiàn)出黃色或橙色，氨蒸氣處理后在空氣中顏色褪去[13]。銀杏葉提取液顏色反應(yīng)結(jié)果如表1所示。

表1 銀杏葉提取物與不同試劑的顏色反應(yīng)結(jié)果Table 1 Color reaction of ginkgo biloba extract with different reagents

從表1中可以初步判斷銀杏葉中含有二氫黃酮類化合物。

3.2 紫外-可見光譜分析

大多數(shù)黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中存在苯甲?；腿夤瘐；慕徊婀曹楏w系，其中肉桂?；a(chǎn)生的吸收帶(帶I)對(duì)應(yīng)的最大吸收波長在310～400 nm內(nèi)，苯甲?；a(chǎn)生的吸收帶(帶II)對(duì)應(yīng)的最大吸收波長在245～285 nm內(nèi)。但是不同類型的黃酮化合物由于其分子中羥基數(shù)目和位置不同，或者共軛體系存在形式的不同，其紫外-可見吸收光譜會(huì)存在一定差異。其中黃酮或黃酮醇化合物帶I和帶II吸收峰峰強(qiáng)相似，均為主峰；查耳酮及橙酮類化合物的帶II吸收峰則較帶I吸收峰略弱，即帶I為主峰，帶II為次強(qiáng)峰；而異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物帶II吸收峰很強(qiáng)，帶I很弱，常表現(xiàn)為在主峰的長波方向處有一肩峰[13]。從圖7可以看出，蘆丁分別在359 nm和257 nm處出現(xiàn)了由肉桂酰生色團(tuán)和苯甲酰生色團(tuán)產(chǎn)生的吸收峰，吸收峰強(qiáng)度相似，屬于黃酮醇類。銀杏葉提取物的紫外吸收光譜較蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物則有明顯不同，參照文獻(xiàn)可知，銀杏葉帶I為肩峰，峰強(qiáng)度較弱，因此可初步判斷銀杏葉提取物中為二氫黃酮或二氫黃酮醇類。

圖3 蘆丁及銀杏葉提取物的紫外-可見光譜圖Fig.3 The UV-Vis spectra of rutin and ginkgo biloba extract

3.3 紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法測試蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和銀杏葉提取物的紅外光譜。由圖4可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品與銀杏葉提取物在約3 400 cm-1處存在羥基伸縮振動(dòng)峰，位置與強(qiáng)度略有不同，其中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的羥基伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在3 432 cm-1處，峰強(qiáng)較大，而銀杏葉提取物中羥基伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在3 400 cm-1處，峰強(qiáng)減小，并且銀杏葉提取物的峰形相比蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品要寬。一般地，當(dāng)黃酮類化合物上的羥基數(shù)量較多時(shí)會(huì)導(dǎo)致峰形變寬，因此產(chǎn)生這種細(xì)微差異的原因可能是由于銀杏葉提取物中羥基數(shù)量較蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品更多所致[16]。3 009 cm-1為苯環(huán)C-H的彎曲振動(dòng)吸收峰，在1 617 cm-1處存在銀杏葉提取物中羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 394 cm-1處存在銀杏葉提取物分子中苯環(huán)碳骨架的伸縮振動(dòng)吸收峰，此外銀杏葉提取物在1 076 cm-1和1 039 cm-1處存在明顯的伸縮振動(dòng)吸收峰，應(yīng)該歸屬為醚類物質(zhì)中的C-O鍵的伸縮振動(dòng)。結(jié)合顯色反應(yīng)和紫外-可見分光光度法的結(jié)果，推測銀杏葉提取物主要成分可能為二氫黃酮類化合物中的水飛薊素。

圖4 蘆丁和銀杏葉提取物的紅外光譜圖Fig.4 The FT-IR spectra of rutin and ginkgo biloba extract

利用顯色反應(yīng)、紫外-可見分光光度法及紅外光譜法初步鑒定銀杏葉提取物的結(jié)構(gòu)后，教師可進(jìn)一步引導(dǎo)有興趣的同學(xué)進(jìn)行質(zhì)譜和高效液相色譜檢測，對(duì)銀杏葉提取物中的具體成分做更準(zhǔn)確的分析。

4 結(jié) 語

將銀杏葉中總黃酮的提取和結(jié)構(gòu)鑒定引入本科教學(xué)中，實(shí)驗(yàn)所用原料具有地方特色且廉價(jià)易得，實(shí)驗(yàn)原理有科學(xué)依據(jù)，實(shí)驗(yàn)過程豐富，著重鍛煉學(xué)生對(duì)分析化學(xué)中定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中回流法、有機(jī)波譜分析以及現(xiàn)代儀器測試方法的相關(guān)能力，能顯著提升學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)水平，符合綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)的大綱要求，可以作為一個(gè)具有地方特色的實(shí)驗(yàn)課題進(jìn)入綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。