異喹啉類生物堿與鳥(niǎo)嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-腺嘌呤型三鏈DNA相互作用的質(zhì)譜與光譜學(xué)研究

關(guān)鍵詞鳥(niǎo)嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-腺嘌呤型三鏈DNA；生物堿；質(zhì)譜法；紫外可見(jiàn)光譜；熒光光譜；圓二色光譜

三鏈DNA分子是由第三條寡聚脫氧核苷酸（Triplex-formingoligonucleotides，TFOs）的堿基通過(guò)Hoogsteen氫鍵配對(duì)的方式結(jié)合在雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)的大溝區(qū)而成，在體內(nèi)和體外均可形成[1]。三鏈DNA可以抑制DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，產(chǎn)生位點(diǎn)專屬的突變，通過(guò)斷裂DNA誘導(dǎo)同源重組[2-3]，在納米尺度的材料工程、治療學(xué)、基因診斷學(xué)和其它一些領(lǐng)域中具有很大的應(yīng)用潛力[4-5]?；诘谌龡l鏈的起源，三鏈DNA可以分為分子間三鏈DNA、分子內(nèi)三鏈DNA和G-三鏈DNA等[1，6]。根據(jù)三鏈DNA的組成和取向，分子間三鏈DNA可以分為3類：胸腺嘧啶-胞嘧啶（Thymidine-cytocine，TC）型三鏈DNA、鳥(niǎo)嘌呤-胸腺嘧啶（Guanine-thymidine，GT）型三鏈DNA和鳥(niǎo)嘌呤-腺嘧啶（Guanine-adenine，GA）型三鏈DNA[1]。

研究者已對(duì)三鏈DNA作為基因療法進(jìn)行了很多研究，但由于三鏈結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性和TFOs的細(xì)胞攝取率均較差，研究進(jìn)展緩慢。如何提高三鏈DNA在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性一直是三鏈DNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。常規(guī)研究策略有兩種：（1）對(duì)TFOs進(jìn)行化學(xué)修飾，包括堿基修飾、磷酸骨架修飾和糖配體修飾；（2）利用小分子與三鏈DNA形成非共價(jià)復(fù)合物[7-8]。

生物堿是中草藥中重要的有效成分，具有抗乳腺癌、抗結(jié)腸癌和抗非小細(xì)胞肺癌等多種抗腫瘤生物活性[9]。近年來(lái)，異喹啉生物堿在腫瘤治療方面的應(yīng)用潛力備受關(guān)注。異喹啉生物堿通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞死亡、降低促生存蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和抑制促生存細(xì)胞信號(hào)通路等方式展示其抗腫瘤效果；同時(shí)，異喹啉生物堿還具有良好的抗炎和鎮(zhèn)痛效果[10]。DNA和RNA一直被認(rèn)為是發(fā)揮抗癌作用的靶標(biāo)。異喹啉類生物堿與三鏈DNA主要通過(guò)插入結(jié)合模式相互作用，例如，小檗堿和甲氧檗具有誘導(dǎo)和穩(wěn)定DNA三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的能力，能夠抑制端粒酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，因此可成為潛在的抗癌藥物[11-12]。目前，研究DNA-小分子配體相互作用的方法包括電噴霧電離質(zhì)譜法（ESI-MS）、紫外-可見(jiàn)（UV-vis）光譜法、熒光光譜法和圓二色（CD）光譜法等[13-14]。一級(jí)全掃描質(zhì)譜不僅能夠快速確定配體是否與DNA結(jié)合，還可直接得到絡(luò)合物的化學(xué)計(jì)量比，可用于評(píng)價(jià)配體與DNA結(jié)合的親和力和選擇性[15]。通常，紫外可見(jiàn)吸收光譜中的減色效應(yīng)表明小分子與DNA以經(jīng)典插入模式結(jié)合[16]，而增色效應(yīng)表明小分子通過(guò)靜電吸引與DNA結(jié)合[17]。配體本身的熒光或熒光探針試劑與DNA結(jié)合后的熒光可用于研究小分子與三鏈DNA的相互作用[18-19]。常用的熒光探針?shù)寤义V（EB）是一種典型的DNA插入劑，幾乎不具有穩(wěn)定三鏈DNA的作用[20]，可用于研究小分子與三鏈DNA是否具有插入結(jié)合作用。CD光譜法在DNA領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，小分子配體與DNA作用后，會(huì)使DNA的構(gòu)象發(fā)生變化，因此，可通過(guò)小分子配體和DNA堿基的電子躍遷偶極矩間偶合產(chǎn)生的信號(hào)測(cè)定結(jié)合模式[21]。

本研究組在前期工作中利用超高效液相色譜-質(zhì)譜法、ESI-MS、紫外光譜、熒光分析和CD光譜法研究了生物堿類小分子與TC和TTT型三鏈DNA的相互作用，發(fā)現(xiàn)DNA的序列和小分子的結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)合模式都有明顯影響[22-24]。本研究利用質(zhì)譜法結(jié)合光譜學(xué)方法對(duì)異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結(jié)合方式進(jìn)行了研究，探討了生物堿類小分子和三鏈DNA的相互作用機(jī)理，為進(jìn)一步研究具有生物活性的黃酮類藥效小分子的藥用機(jī)理及新型藥物的設(shè)計(jì)提供了參考。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司），配有電噴霧（ESI）離子源及Xcalibur2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；UV-1102ii紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司），配備通道長(zhǎng)度為1cm的石英比色容器；MOS-450圓二色光譜偏振儀（法國(guó)Bio-Logic公司）；安捷倫1100FLD熒光光譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）。

黃連堿、藥根堿、表小檗堿、非洲防己堿、小檗紅堿、防己諾林堿和粉防己堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；3條寡聚脫氧核苷酸分子5′-CTCCTCCTCCTCC-3′（CCT，SY）、5′-GGAGGAGGAGGAG-3′（GGA，SR）和5′-GAGGAGGAGGAGG-3′（GGA）（大連寶生物工程有限公司）；EB標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；氯化銅、氯化鋅和氯化鎳（上海阿拉丁生化科技有限公司）；氯化鈷（上海麥克林生化有限公司）；氯化錳和氯化鎂（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；醋酸銨（美國(guó)Fluka公司）；甲醇（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（長(zhǎng)春萊博帕特科技發(fā)展有限公司超純水機(jī)制備，18.25MΩ·cm）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1三鏈DNA的退火制備

3條單鏈DNA按摩爾比為1∶1∶1在150mmol/L乙酸-乙酸銨溶液（pH6.8）中混合，在加入或不加入1mmol/L二價(jià)金屬離子的情況下，于90℃加熱10min，然后緩慢冷卻到室溫，過(guò)夜，退火，分別制備100μmol/L三鏈DNA儲(chǔ)備液，置于–20℃，待測(cè)。

1.2.2電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）條件

采用25mmol/L乙酸-乙酸銨（pH6.8）/甲醇（80∶20，V/V）將三鏈DNA和小分子稀釋，然后將小分子和三鏈DNA按摩爾比為2∶1混合，使小分子終濃度為20μmol/L，三鏈DNA終濃度為10μmol/L。所有樣品均采用直接進(jìn)樣方式，蠕動(dòng)泵流速為8L/min，透鏡電壓為–180V，噴霧電壓為3.6kV，氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，流速分別為55和85L/h。所有數(shù)據(jù)均在負(fù)離子模式下掃描，毛細(xì)管溫度為250℃。

1.2.3紫外可見(jiàn)吸收光譜與紫外熱變性實(shí)驗(yàn)條件

采用50mmol/L乙酸-乙酸銨醋酸銨溶液（pH6.8）將三鏈核酸儲(chǔ)備液稀釋到0.8μmol/L，7種生物堿類小分子稀釋到1.6μmol/L，在200～450nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度。對(duì)于熱變性實(shí)驗(yàn)，升溫范圍為20～75℃，升溫速率為1℃/min。在260nm處測(cè)量樣品的紫外吸光度，得到吸光度-溫度曲線。熔解溫度（Meltingtemperature，Tm）由吸光度-溫度曲線的導(dǎo)數(shù)圖得到。

1.2.4熒光光譜法條件

在激發(fā)波長(zhǎng)為520nm、發(fā)射波長(zhǎng)為604.5nm的條件下，固定熒光滴定猝滅實(shí)驗(yàn)中EB濃度為3μmol/L（溶解于150mmol/L乙酸-乙酸銨溶液（pH6.8）），不斷滴入三鏈DNA溶液，同時(shí)加入適量EB溶液，保證其濃度不變，直到熒光強(qiáng)度不再增加，此時(shí)三鏈DNA溶液濃度的一半為實(shí)驗(yàn)所需濃度。在建立的熒光猝滅方法的基礎(chǔ)上，將不同濃度的藥物溶液不斷滴入熒光猝滅體系中，同時(shí)加入適量的EB和三鏈DNA，以保證EB-DNA體系濃度不變。

1.2.5圓二色光譜法條件

采用20mmol/L乙酸-乙酸銨（pH6.8）溶液將三鏈核酸儲(chǔ)備液稀釋到20μmol/L，置于1mm微量石英池中，待測(cè)。設(shè)定掃描波長(zhǎng)為200～320nm，掃描速度為200nm/min。譜圖為3次掃描的平均值，并且已經(jīng)扣除了緩沖溶液的背景值。

2結(jié)果與討論

2.1ESI-MS檢測(cè)異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結(jié)合強(qiáng)度

在未加入金屬離子的3條單鏈DNA溶液退火后的質(zhì)譜圖（電子版文后支持信息圖S1A）中，只檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于單鏈（m/z1037.64和m/z1251.65）、W-C雙鏈（m/z1581.53和m/z1660.53）和同型二聚體的譜峰（m/z1383.83），未檢測(cè)到GGA型三鏈DNA離子。在金屬離子中，堿土金屬M(fèi)g2+與三鏈核酸的相互作用研究最廣泛，能穩(wěn)定d（C）nd（G）nd（G）n三鏈核酸[25-26]。為了考察金屬離子對(duì)GGA型三鏈DNA穩(wěn)定性的影響，將堿土金屬M(fèi)g2+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+和Ni2+分別加入到3條單鏈寡核苷酸的混合溶液中一起退火。將退火后的混合溶液進(jìn)行ESIMS分析，發(fā)現(xiàn)上述金屬離子與GGA型三鏈DNA復(fù)合物的相對(duì)豐度分別為0%、5%、14%、13%、16%和19%。由此可見(jiàn)，金屬離子穩(wěn)定GGA型三鏈DNA的能力順序?yàn)镹i2+gt;Zn2+gt;Cu2+gt;Co2+gt;Mn2+gt;Mg2+。相較于堿土金屬M(fèi)g2+，過(guò)渡金屬Ni2+和Zn2+等對(duì)嘌呤的N7位具有更高的親和力[25，27]，這使得DNA構(gòu)象縮攏程度增強(qiáng)，甚至產(chǎn)生縮合，因此能更有效地促進(jìn)GGA型三鏈核酸的形成。其中，Ni2+與GGA型三鏈DNA的結(jié)合力最強(qiáng)，因此，本研究在Ni2+存在條件下研究7種生物堿類小分子與GGA型三鏈DNA的結(jié)合能力。

在質(zhì)譜圖中，除了檢測(cè)到了單鏈和雙鏈DNA與Ni2+的復(fù)合物，還檢測(cè)到了三鏈DNA與Ni2+及小分子的復(fù)合物，其中，m/z1814.24為[T+5Ni+黃連堿]7–（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1B），m/z1589.74和1817.12分別為[T+5Ni+藥根堿]8–和[T+5Ni+藥根堿]7–（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1C），m/z1811.16為[T+5Ni+表小檗堿]7–（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1D），m/z1814.20為[T+5Ni+小檗紅堿]7–離子（電子版文后支持信息圖S1E），m/z1577.57為[T+4Ni+非洲防己堿]8–（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1F），m/z1850.06為[T+5Ni+防己諾林堿]7–（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1G），m/z1620.20和1852.32分別為[T+5Ni+粉防己堿]8–和[T+5Ni+粉防己堿]7–（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1H）。本研究結(jié)果表明，7種生物堿類小分子與GGA型三鏈DNA結(jié)合強(qiáng)度的順序?yàn)椋悍鄯兰簤Agt;表小檗堿≈非洲防己堿gt;黃連堿gt;防己諾林堿gt;藥根堿gt;小檗紅堿（圖1）。此外，GGA型三鏈核酸與小分子的復(fù)合物峰，無(wú)論是形成7電荷還是8電荷的離子，均為其與5個(gè)Ni2+的加合峰。因此，異喹啉類生物堿均可與GGA型三鏈核酸相互作用，其中粉防己堿的結(jié)合強(qiáng)度最強(qiáng)。

2.2紫外可見(jiàn)光譜法分析異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用

在1μmol/LGGA型三鏈DNA溶液中加入2μmol/L異喹啉類生物堿小分子后，其紫外吸光度的變化如圖2所示，其中，黃連堿（圖2A）、藥根堿（圖2B）、小檗紅堿（圖2D）和非洲防己堿（圖2E）與GGA型三鏈DNA結(jié)合后最大吸收強(qiáng)度增大，說(shuō)明這4種小分子通過(guò)靜電結(jié)合到DNA骨架的磷酸基團(tuán)，使DNA互補(bǔ)堿基不能形成氫鍵，造成三鏈DNA結(jié)構(gòu)收縮和破壞。表小檗堿（圖2C）與GGA型三鏈DNA結(jié)合后，260nm處的吸收強(qiáng)度減小并且紅移，推測(cè)表小檗堿的芳香發(fā)色團(tuán)與三鏈DNA的堿基發(fā)生了堆疊作用，π-π*電子躍遷能量降低，最大吸收波長(zhǎng)紅移，進(jìn)而導(dǎo)致減色效應(yīng)。研究表明，表小檗堿與GGA型三鏈DNA通過(guò)插入作用結(jié)合[17]。防己諾林堿（圖2F）和粉防己堿（圖2G）與GGA型三鏈DNA結(jié)合后，最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移且吸收強(qiáng)度增大，說(shuō)明這兩種生物堿類小分子也不能穩(wěn)定GGA型三鏈DNA的結(jié)構(gòu)。紫外可見(jiàn)光譜分析結(jié)果表明，異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結(jié)合模式取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

為了考察這7種小分子能否穩(wěn)定GGA型三鏈DNA，對(duì)摩爾比為1∶2的GGA型三鏈DNA/小分子復(fù)合物進(jìn)行變溫紫外分析。通過(guò)考察小分子存在/不存在時(shí)三鏈DNA的Tm值變化，判斷此小分子是否具有穩(wěn)定三鏈DNA的作用：若Tm提高則為三鏈DNA穩(wěn)定劑，若Tm降低則為三鏈DNA去穩(wěn)定劑[28-29]。如圖3所示，加入黃連堿、藥根堿、表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿后的Tm值與GGA三鏈DNA單獨(dú)存在時(shí)的Tm的差異較?。▓D3A～3C，3F和3G），表明這5種異喹啉類生物堿不能穩(wěn)定GGA型三鏈DNA。加入小檗紅堿和非洲防己堿后，ΔTm分別為5℃和4℃（圖3D和3E），表明小檗紅堿和非洲防己堿可在一定程度上穩(wěn)定GGA型三鏈DNA。

2.3熒光光譜法研究異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用

選擇一種典型的插入劑EB分析異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結(jié)合模式。固定熒光滴定猝滅實(shí)驗(yàn)中EB的濃度為3μmol/L，隨著三鏈核酸濃度增加，熒光強(qiáng)度不斷增大。如圖4A所示，當(dāng)熒光強(qiáng)度不再增大時(shí)，三鏈核酸濃度為9.51μmol/L?；诖私Y(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)需要的GGA型三鏈DNA的濃度為4.755μmol/L。由7種不同化合物存在條件下的EB-GGA型三鏈DNA體系的熒光光譜（圖4B～4H）可見(jiàn)，向此體系中加入表小檗堿（圖4D）、防己諾林堿（圖4G）和粉防己堿（圖4H）后，EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度隨著藥物濃度增加而逐漸降低，直到低于最大熒光強(qiáng)度的50%，并且CTarget/CDNAlt;100，表明加入表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿會(huì)影響體系中EB與GGA型三鏈DNA的作用，即部分EB被藥物分子置換出來(lái)而變成游離態(tài)，表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿與GGA型三鏈DNA的作用方式主要為插入結(jié)合模式。向EB-GGA型三鏈DNA中加入黃連堿后，EB體系的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化（圖4B），說(shuō)明黃連堿不與EB-GGA型三鏈DNA體系發(fā)生作用，其作用方式還需進(jìn)一步研究。當(dāng)藥根堿（圖4C）、小檗紅堿（圖4E）和非洲防己堿（圖4F）濃度逐漸增加時(shí)，EB-DNA體系熒光強(qiáng)度也在逐漸降低，但未能降低到最大熒光強(qiáng)度的50%，盡管不能判斷出其與GGA型三鏈DNA的相互作用為插入結(jié)合，但也表明這3種生物堿與GGA型三鏈DNA的結(jié)合能力很強(qiáng)。

2.4圓二色光譜法研究相互作用模式

為了進(jìn)一步研究GGA型三鏈DNA與異喹啉類生物堿混合物在溶液中的結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)行了CD光譜檢測(cè)。在保持三鏈DNA濃度為20μmol/L的實(shí)驗(yàn)條件下，將生物堿小分子的濃度從1nmol/L增加至500μmol/L，觀察系統(tǒng)的CD信號(hào)變化。結(jié)果表明，在配體存在的情況下，DNA的CD光譜發(fā)生顯著改變，這是因?yàn)镈NA與配體結(jié)合后DNA構(gòu)象的改變導(dǎo)致DNA堿基耦合發(fā)生變化[30]。由圖5可見(jiàn)，除表小檗堿（圖5C）外，隨著小分子配體濃度增加，CD譜峰強(qiáng)度增強(qiáng)，并且7種化合物與GGA型三鏈DNA結(jié)合后出現(xiàn)負(fù)的譜峰，表明這7種小分子的躍遷矩垂直于DNA堿基對(duì)的長(zhǎng)軸方向[31]。根據(jù)文獻(xiàn)[31-32]報(bào)道的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這些小分子與GGA型三鏈DNA的作用為插入結(jié)合模式。

目前，許多DNA為臨床使用或在高級(jí)臨床試驗(yàn)中的藥物的藥理學(xué)靶點(diǎn)，其中具有抗腫瘤活性的DNA插入劑引起了研究者的特別關(guān)注。例如，一些吖啶和蒽環(huán)類衍生物是良好的DNA插入劑，已作為化療藥物在市場(chǎng)上銷售[33]。綜合考慮本研究結(jié)果，表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿作為GGA型三鏈DNA的插入劑，影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程，有助于從分子水平上了解抗癌藥物的作用機(jī)理，有望發(fā)展成為治療腫瘤的化學(xué)藥物，為后續(xù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾奠定了理論基礎(chǔ)。通過(guò)研究生物堿類小分子與DNA的相互作用模式，可為新藥研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和思路，以期設(shè)計(jì)出更有效的藥物，提高藥物的療效和安全性。深入研究這種相互作用機(jī)制，將為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)更多的創(chuàng)新和突破。

3結(jié)論

采用質(zhì)譜法、UV-vis光譜法、熒光光譜法和CD光譜法研究了黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗紅堿、非洲防己堿、防己諾林堿和粉防己堿與GGA型三鏈DNA的相互作用。比較了多種堿土金屬離子對(duì)GGA型三鏈DNA形成的穩(wěn)定性影響，發(fā)現(xiàn)Ni2+能更有效地促進(jìn)GGA型三鏈DNA的形成。此外，研究表明，異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用存在多種機(jī)制，本研究觀察到了靜電作用和插入結(jié)合模式，相互作用的差異說(shuō)明了小分子結(jié)構(gòu)影響的重要性。紫外變溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗紅堿和非洲防己堿可以穩(wěn)定GGA型三鏈DNA結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果有助于理解異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用，同時(shí)為研發(fā)新型異喹啉類生物堿治療試劑提供了理論基礎(chǔ)。