鹽脅迫下野菊離子的吸收轉運情況及相關基因的表達1)

羅玢曄 陳勝艷 楊宇佳 薄杉 孫穎

(東北林業(yè)大學,哈爾濱,150040)

由于全球氣候暖化和人類活動加劇,全球土壤鹽漬化問題日益嚴重,據(jù)統(tǒng)計,全球受鹽堿化威脅的土壤面積約占7%[1],且這一數(shù)字還在持續(xù)攀升。鹽堿化嚴重的土質會導致植物體發(fā)生滲透脅迫,造成離子毒害,從而影響植物生長,甚至枯萎死亡[2],嚴重影響園林綠化效果,不利于社會發(fā)展[3]。但植物中的高抗鹽類群對鹽堿化土壤有良好的適應性,在鹽堿土上依然有著較好的觀賞效果[4]。所以研究植物類群抗鹽機理,有利于改善植物的抗鹽性,促進土壤鹽堿化嚴重地區(qū)的園林事業(yè)發(fā)展。

野菊(Chrysanthemumindicum),屬于菊科(Compositae)菊屬(DendraothemasGaertn.)植物,在我國大部分地區(qū)廣為分布[5]。菊花是我國傳統(tǒng)名花,花色豐富、形態(tài)各異,在園林綠化中被廣泛運用,具有較高的文化價值、觀賞價值與經(jīng)濟價值[6]。野菊與其他菊花品種有較近的親緣關系,但野菊生于野外,與其他菊花品種相比,具有適應性強、育種潛力高等優(yōu)點[7]。但目前對野菊的研究集中在栽培育種、化學成分分析、遺傳特性和藥用價值等方面,對其抗鹽性等方面的研究較少。所以研究野菊的抗鹽性,對于改善菊花抗鹽性,選育菊花耐鹽品種具有重大意義[8-9]。

植物為適應高鹽環(huán)境,自身會啟動一定的調節(jié)機制,主要通過離子區(qū)域化、選擇性吸收和分配等方式來抵御不利影響,維持離子穩(wěn)態(tài)[10]。非鹽生植物通過控制鹽離子的吸收或者把鹽離子轉移到較老的組織器官或根部,以有效地隔離鹽離子,保護那些代謝較強的組織免受影響[11-12];鹽生植物通過增加根冠比更大限度地保留鹽離子,控制它們向地上部分轉移[13]。抗鹽性強的植物能夠通過減少體內K+、Ca2+等營養(yǎng)離子的流失,并控制Na+的含量,以維持K+、Ca2+的吸收與代謝過程能夠正常進行[14-15]。Yang et al.[16]的研究表明維持細胞w(K+)∶w(Na+)值穩(wěn)定是耐鹽植物對過量離子反應的重要適應特征。同時,在這一過程中,許多基因的表達都扮演著不容忽視的角色。Na+和H+逆向轉運蛋白基因(NHX)和高親和性鉀離子轉運蛋白基因(HKT)是在植物體內參與離子轉運調節(jié)的重要蛋白基因,在植物抗逆性方面的作用一直為人們廣泛關注。NHX基因家族介導Na+和H+的跨膜運輸,促進Na+在液泡中的區(qū)隔作用,調節(jié)植物體內Na+的平衡,維持植物的離子平衡與正常的生理代謝活動[17-18]。HKT蛋白是高親和性鉀轉運體,是一種在質膜上具有Na+和K+雙重轉運功能的離子運輸體,介導植物體內Na+長距離運輸以及維持K+和Mg2+動態(tài)平衡,在逆境脅迫中起著重要作用[19-20]。

課題組前期引進了207個野菊株系,完成了野菊抗鹽株系的篩選,并分析其中6個株系在鹽脅迫下的表型、光合生理及滲透調節(jié)物質的變化情況,初步探明野菊的抗鹽機理[21]。因此,本研究重點關注鹽脅迫下,6個抗鹽性不同的野菊株系各部位離子質量分數(shù)、比例、運輸情況的變化;并在鑒別出野菊NHX基因家族成員的基礎上,利用實時熒光定量PCR技術,分析不同時間點CiNHX1-6基因、CiHKT1基因在鹽脅迫下的表達水平。以明確鹽脅迫下植物體內的離子分布運輸情況及相關基因表達的變化規(guī)律,旨在從更深層次上認識植物的抗鹽機理,對研發(fā)和培育新的抗鹽品種,提高育種效益意義重大。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料選取前期篩選的2個高抗株系[21]3-25-2(H1)、4-4-6(H2);2個中抗株系3-18-3(M1)、2-13-2(M2);2個低抗株系5-11-2(L1)、4-7-2(L2)。

選取頂端生長良好的野菊取其莖段,以珍珠巖為基質,進行扦插繁殖,置于溫室中生長。直至扦插苗根長1～2 cm時,取長勢一致的野菊扦插苗,根部用蒸餾水洗凈,并適當修剪使每個單株保留4～6片真葉。將處理好的野菊扦插苗置于霍格蘭營養(yǎng)液中水培,2 d更換1次營養(yǎng)液,水培7 d后,將處理組野菊株系置于含有NaCl(濃度為150 mmol/L)的霍格蘭營養(yǎng)液中進行鹽脅迫處理,對照組仍采用霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)。每組設置3個重復,每個重復為15株。

在鹽處理后0、12、24、72 h,對野菊各株系的根、莖、葉分別取樣。樣品放于冰箱中-80 ℃保存,用于后續(xù)試驗。每個取樣時間設置3個生物學重復。

1.2 Na+、K+離子質量分數(shù)的測定

鹽脅迫72 h后,野菊用蒸餾水清凈,用信封分別包好根、莖、葉,置于烘箱內105 ℃殺青15 min,75 ℃烘干至恒質量,用研缽研磨烘干后的樣品至粉末狀,100目過篩,稱取0.1 g烘干過目后的樣品,參考劉松[22]的方法進行消解。用安捷倫特微波等立子體MP-4200測定Na+、K+離子質量分數(shù),并計算各株系中根、莖、葉鉀鈉離子質量分數(shù)比值(w(K+)∶w(Na+))。

參考烏鳳章等[23]的方法對野菊不同部位離子選擇性運輸能力S(K+,Na+)進行計算：

S(K+,Na+)=庫器官{w(K+)∶w(Na+)}/
源器官{w(K+)∶w(Na+)}。

式中：Na+、K+,分別表示Na+、K+離子質量分數(shù),單位為mg/g。

1.3 野菊NHX家族成員鑒定

由于野菊未有基因組數(shù)據(jù)公布,因此利用菊花腦與甘野菊(Chrysanthemumseticuspe)基因組數(shù)據(jù)庫進行比對[24]。從TAIR數(shù)據(jù)庫(https：//www.arabidopsis.org/)獲得8個擬南芥AtNHXs基因的序列,對菊花腦與甘野菊基因組進行蛋白序列比對(BLASTP),搜索出候選的CiNHXs[25]。然后利HMMER3.0軟件進行比對分析,比對結果經(jīng)Pfam(http：//pfam.xfam.org)、CDD(https：//www-ncbi-nlm-nih-gov.webvpn.nefu.edu.cn/cdd)和SMART(http：//smart.embl)進行驗證,去除不含Na+和H+交換保守結構域的蛋白序列,獲得6個野菊的NHX基因家族成員,按照其在染色體上的位置依次命名。

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1.4 總RNA提取與熒光定量PCR

采用E.Z.N.A Plant RNA Kit (OMEGA)試劑盒提取野菊的總RNA,隨后用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO)試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。通過熒光定量PCR技術,測量樣品Na+和H+逆向轉運蛋白基因(NHX)：CiNHX1-6、高親和性鉀離子轉運蛋白基因(HKT)：CiHKT1的表達量。以CmEF1α為內參基因。每組3個重復。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和計算采用Excel 2013,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0,系統(tǒng)聚類分析采用TBtools。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對野菊離子分布與運輸?shù)挠绊?/h3>

2.1.1 鹽脅迫對野菊各部位離子質量分數(shù)的影響

鹽脅迫會導致大量的Na+和Cl-進入植物體內,導致有害離子過度積累,并影響植物對其他有益離子的吸收和離子平衡,造成離子毒害。據(jù)表1數(shù)據(jù)顯示,各株系在正常生長時,Na+和K+的質量分數(shù)相差不大。然而鹽脅迫后,與對照組相比,處理組的各株系的根、莖和葉的Na+質量分數(shù)均顯著增加(P<0.05),同時與對照組相比,K+質量分數(shù)均顯著降低(P<0.05)。其中根系Na+質量分數(shù)高于莖和葉,且根系Na+質量分數(shù)隨著株系鹽能力的降低而不斷增加。H1、H2、M1、M2株系的K+質量分數(shù)為葉高于根高于莖,而L1株系的K+質量分數(shù)為根高于葉高于莖,L2株系的K+質量分數(shù)為根高于葉高于莖。不同株系中同一部位的Na+和K+質量分數(shù)也存在顯著差異(P<0.05)。隨著株系抗鹽能力的降低,根、莖和葉中的Na+質量分數(shù)呈持續(xù)上升趨勢,而K+質量分數(shù)則呈持續(xù)下降趨勢。

表1 鹽脅迫下野菊各器官Na+、K+質量分數(shù)的變化

2.1.2鹽脅迫對野菊各器官w(K+)∶w(Na+)值的影響

維持植物內部離子平衡對于其正常生理代謝至關重要,而鉀鈉離子質量分數(shù)比值(w(K+)∶w(Na+))是反映離子平衡的重要指標。據(jù)表2數(shù)據(jù)顯示,在受到鹽脅迫后,與對照組相比,處理組各株系根、莖、葉的w(K+)∶w(Na+)值均顯著降低(P<0.05);隨著株系抗鹽能力的降低,根中w(K+)∶w(Na+)值較對照組分別降低了76.42%、82.95%、89.63%、92.81%、95.72%、96.02%,莖中w(K+)∶w(Na+)值較對照組分別降低了70.67%、83.14%、87.07%、93.62%、95.91%、96.59%,葉片中w(K+)∶w(Na+)值較對照組分別降低了59.28%、72.53%、83.73%、91.48%、95.99%、98.29%。在處理組中,除L2株系外,其他株系的葉片中w(K+)∶w(Na+)值均高于莖和根。同株系中同一部位的w(K+)∶w(Na+)值也存在顯著性差異(P<0.05)。由此可見,隨著株系抗鹽能力的降低,根、莖、葉的w(K+)∶w(Na+)值均呈持續(xù)下降趨勢。

表2 鹽脅迫下野菊各器官鉀鈉離子質量分數(shù)比值的變化

2.1.3鹽脅迫對野菊各部位間離子選擇性運輸能力的影響

表3 鹽脅迫下野菊各部位間離子選擇性運輸能力的變化

2.2 鹽脅迫對野菊NHX、HKT基因相對表達的影響

2.2.1 鹽脅迫對野菊CiNHX基因相對表達的影響

Na+和H+逆向轉運蛋白(NHX)基因,具有保守的Na+和H+交換結構域?？梢詫⒓毎麅冗^多的Na+區(qū)域化或排出體外,維持細胞內的正常Na+質量分數(shù)。試驗測定了6個抗鹽性不同的野菊株系根、莖、葉中CiNHX1-6基因在鹽脅迫下不同時間點的表達水平,結果如表4所示。

鹽脅迫后,野菊CiNHX2基因在株系H1的根中,株系M1的葉中均出現(xiàn)較高的相對表達量,鹽脅迫處理24 h時分別達到了9.96、12.03,是未脅迫的7.84、11.04倍。該基因在株系H1、H2根中的表達豐度遠高于抵抗株系,且上調幅度大于莖和葉,說明該基因在根中發(fā)揮的作用大于莖和葉。鹽脅迫后,野菊CiNHX4基因的相對表達量在株系H1、H2的根、葉中出現(xiàn)了大幅上調,明顯高于其他株系,鹽脅迫處理24 h時分別達到了11.43、12.27、10.60、17.72,是未脅迫的8.66、14.44、9.72、10.55倍。與未脅迫相比,鹽脅迫處理12、24 h時,6個株系根、莖、葉中CiNHX1、CiNHX3、CiNHX5、CiNHX6基因相對表達量均未出現(xiàn)明顯變化,表達水平介于0.81～3.68,均處在較低的表達水平。其中CiNHX3在根部的相對表達量略高,CiNHX1、CiNHX6在葉部的相對表達量略高。

以上結果表明野菊CiNHX2、CiNHX4基因受鹽脅迫的影響明顯,在鹽脅迫下被激活,提高了鹽脅迫下野菊的抗鹽能力;CiNHX1、CiNHX3、CiNHX5、CiNHX6基因在野菊體內表達水平整體較低,與野菊株系抗鹽性強弱關系不大,在野菊株系抗鹽的過程中未發(fā)揮重要作用。

2.2.2 鹽脅迫對野菊CiHKT1基因相對表達的影響

HKT類蛋白是高親和性K+載體,編碼Na+、K+轉運或K+-Na+共轉運質膜通道蛋白[26],在維持Na+、K+平衡等方面發(fā)揮著重要作用。

鹽脅迫下野菊CiHKT1基因相對表達量的變化如表5所示,CiHKT1在根、葉中的表達受鹽脅迫的影響較為明顯,高抗株系的表達量出現(xiàn)一定程度的上調。其中,株系H1、H2的葉片在鹽脅迫處理24 h后的相對表達量大幅上調,達到了10.38和6.26,是未脅迫的7.75和7.63倍,說明該基因在野菊響應鹽脅迫的過程中發(fā)揮了一定的作用。鹽脅迫處理12 h時,CiHKT1在株系H1、H2根中的表達量高于鹽脅迫處理24 h時的表達量,說明該基因可在根中短時間內被激活并大量表達。

野菊CiHKT1基因在根、葉中的表達受鹽脅迫的影響較為明顯,高抗株系的相對表達量大幅上調,說明CiHKT1基因與野菊株系的抗鹽性強弱密切相關,是野菊抵御鹽脅迫的關鍵基因。

3 討論與結論

鹽脅迫導致的離子毒害、水分缺失和激素失調會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響[27]。為了對抗高鹽脅迫的影響,植物會啟動多種抗逆反應,例如限制Na+進入根,將Na+從根細胞中排除,以及將Na+區(qū)隔化于液泡中等方式,以降低鹽脅迫對細胞內其他生理活動的有害影響[28-29]。本研究結果顯示,處理組中各株系的根、莖和葉的Na+質量分數(shù)均高于對照組,表明鹽脅迫導致野菊吸收了大量的Na+且遍布體內。但處理組中株系的抗鹽性越強其體內的Na+質量分數(shù)越低,表明鹽脅迫下抗鹽性較強的株系能更好地外排Na+,一定程度上減輕了Na+的毒害作用。處理組中,同一株系中的Na+質量分數(shù)由高到低均為根、葉、莖,表明野菊將Na+集中在根部,減少對莖、葉的損害,以保持正常的營養(yǎng)物質運輸和光合作用。Na+和K+二者的分子相似性導致K+易被Na+取代,但Na+并不能代替K+在植物體內的生理生化功能[30]。K+在維持離子平衡、滲透壓和細胞膨壓等生理功能方面起重要作用[31]。本研究結果顯示,處理組中各株系的根、莖和葉的K+質量分數(shù)均低于對照組,表明鹽脅迫阻礙了野菊對K+的吸收和向各部位的轉運。處理組中,抗鹽性越弱的株系根、莖、葉中K+降低幅度越大,且在株系L1、L2中,葉片中的K+質量分數(shù)低于莖和根,表明鹽脅迫下抗鹽性越弱的株系吸收和轉運K+的能力越弱,低抗株系沒有充足的K+來支持正常的生理活動,葉片受到的影響最為嚴重。

植物需要維持正常的鉀鈉離子質量分數(shù)比以進行正常的生理活動,w(K+)∶w(Na+)值也是反應植物抗鹽性的指標之一[32]。本研究結果顯示,與對照組相比,處理組各株系的根、莖和葉的w(K+)∶w(Na+)值均有不同程度的降低,抗鹽性越弱的株系降低幅度越大,說明w(K+)∶w(Na+)值與野菊的抗鹽性密切相關,這與路斌等[33]的研究結果一致?？赡苁且驗榭果}株系根系的ATPase酶活性增加,促進了植物體對K+的吸收和轉運,同時刺激增加了質膜上Na+和H+逆向轉運蛋白的活性,減少了Na+的吸收并促進了其外排。與對照組相比,處理組株系L2的w(K+)∶w(Na+)值降低幅度較大,而葉片的w(K+)∶w(Na+)值低于莖和根,表明低抗株系在鹽脅迫下離子平衡被嚴重破壞,Na+的外排與區(qū)域化和K+的吸收與轉運受到嚴重影響,這可能是其葉片枯黃率增加和萎蔫的原因之一。

離子轉運系數(shù)是反映離子向上選擇性運輸?shù)闹笜薣21]。植物的不同部位離子選擇性運輸能力(S(K+,Na+))可以反應植物將K+向地上部分輸送和將Na+控制在根中的能力,也可反應植物的抗鹽性[34]。本研究結果顯示,在處理組中,H1、H2、M1、M2株系的根-莖、莖-葉和根-葉的S(K+,Na+)較對照組有所上升或變化不大,L1、L2株系的根-莖、莖-葉和根-葉的S(K+,Na+)低于對照組,各株系根-莖、莖-葉和根-葉的S(K+,Na+)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這表明在鹽脅迫下高抗株系具有較強的Na+外排和K+選擇性吸收能力,因此其離子的轉運和吸收受到的影響較小;中抗株系受脅迫的影響相對較大,吸收了較多的Na+,但通過選擇性運輸可以防止過多的Na+對地上部分造成毒害,從而保證生理活動能夠基本正常進行;低抗株系的調節(jié)能力較弱,其膜系統(tǒng)受到嚴重破壞,生理活動相關酶活性明顯降低,導致大量Na+進入并分布在體內,影響了K+的吸收和運輸,從而影響整體生長情況。

在鹽脅迫期間,許多通道、轉運蛋白和反轉運蛋白在維持高等植物細胞pH、K+和Na+穩(wěn)態(tài)發(fā)揮作用[35],其中之一是Na+和H+逆向轉運蛋白(NHX)[36]。Na+和H+交換蛋白跨膜參與細胞內外Na+和H+的交換,在植物、藻類和真菌的液泡中較為活躍[37-39]。本研究結果顯示,在鹽脅迫下,CiNHX2和CiNHX4基因在野菊的體內都有一定程度的上調,尤其在高抗株系中上調的幅度明顯,CiNHX2基因在高抗株系的根和莖中表達模式相同,而CiNHX4基因在高抗株系的根和葉中表達模式相同。說明CiNHX2和CiNHX4的表達與野菊株系的抗鹽性密切相關,據(jù)此推測CiNHX2和CiNHX4在植物維持離子平衡、減輕離子毒害過程中起著重要作用。對擬南芥和水稻的廣泛研究已經(jīng)證明了NHX在耐鹽性中發(fā)揮的關鍵作用,OsNHX1過度表達顯示轉基因植物對鹽脅迫有更高的耐受性,從而提高耐鹽性[40-42];鹽脅迫后香蕉體內部分NHX基因的表達明顯上調[43],與本研究結果相似。

與NHX相比,高親和力的K+轉運蛋白(HKT)基因編碼了Na+和K+的轉運系統(tǒng),在質膜上起作用[44]。擬南芥鹽脅迫適應性的關鍵蛋白--AtHKT1;1通過將流入木質部的Na+卸載到木質部實質細胞中來促進地上部分向地下部分的運輸,并通過韌皮部還流抑制Na+從地下部分向地上部分運輸[45]。已有研究表明,在擬南芥中AtHKT1;1的過度表達可提高其耐鹽性[46];AtHKT2;1基因可以控制Na+和K+的吸收和空間分布,從而最終調控了植物在鹽脅迫下的生長[47]。本研究結果顯示,在受到鹽脅迫后,CiHKT1基因在野菊的根和葉中的相對表達量明顯上調,高于低抗株系,這說明CiHKT1的高表達在一定程度上提高了野菊株系的抗鹽性。推測CiHKT1對野菊的K+轉運具有很強的親和性,可以使高抗株系在鹽脅迫下維持正常的K+質量分數(shù),進而維持正常的生理代謝活動。