基于正交設計探索高尿酸血癥大鼠模型的最佳配伍

王 燕,楊宇軒,彭 玥,郭忠琴

隨著經濟的發(fā)展和人們生活水平的提高,高尿酸血癥(HUA)的發(fā)病率也呈快速增長趨勢,且與動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、冠心病和糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展及死亡密切相關,已然成為危害人類健康的主要疾病之一。因此,構建高尿酸血癥模型是疾病研究及高效安全的降尿酸藥物研發(fā)的基礎。

近年來,高果糖飲食已被證實與痛風發(fā)病呈正相關[1],長期的高果糖攝入正在影響著人類的健康[2-4]。對于年輕群體來說,由于現(xiàn)代食品技術的改進,添加糖[高果糖玉米糖漿(HFCS)]代替了傳統(tǒng)的蔗糖糖漿,廣泛應用于食品加工,已經成為乳制品、軟飲料、面包和糕點等加工食品中的主要甜味劑[5]。含糖飲料、烘焙糕點以及高糖水果的大量攝入都是尿酸升高的潛在影響因素。已有研究表明,果糖是唯一能通過長期攝入使血清尿酸升高的糖類[6]。為了模擬人類因高糖飲食而引起的高尿酸血癥,建立長期、穩(wěn)定、肝腎損傷小的高尿酸血癥動物模型,本研究以SD大鼠為研究對象,利用氧嗪酸鉀競爭性地與大鼠體內尿酸酶結合,抑制尿酸分解的特性[7-9]聯(lián)合果糖,根據三因素兩水平的正交設計探索給藥劑量與給藥途徑的最佳配伍。

1 資料與方法

1.1 一般資料:用到的試劑和儀器有果糖[(D-(-)-Fructose,美國SIGMA公司)];氧嗪酸鉀(OAPS,美國SIGMA公司);尿酸、尿素氮、肌酐測定試劑盒[貝克曼庫爾特(愛爾蘭)股份有限公司];AU400全自動生化分析儀(Olympus)等。

1.2 實驗動物:6周齡SPF級雄性SD大鼠20只,體重(180±20)g。動物實驗方案通過寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心審批,符合寧夏醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準(動物許可證IACUC-NYLAC-2022-030)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立:按照完全隨機設計將20只大鼠分為4個實驗組和1個空白對照組,共5組,再根據三因素兩水平正交設計表按照相應實驗安排將實驗組分為4組[A1B1C1組采用5%果糖水+100 mg/(kg·d)OAPS灌胃;A1B2C2組采用5%果糖水+200 mg/(kg·d)OAPS腹腔注射;A2B1C2組采用10%果糖水+100 mg/(kg·d)OAPS腹腔注射;A2B2C1組采用10%果糖水+200 mg/(kg·d)OAPS灌胃],其中,灌胃組每日8:00給藥,腹腔注射組每日8:00和18:00給藥,連續(xù)給藥8周。

1.3.2 樣本的收集及血清生化指標測定:各組大鼠于實驗開始前、實驗開始后第2、4、6周進行眼眶靜脈竇采血,第8周末進行心尖取血,取血前禁食并禁水12 h。血液靜置2 h后以轉速2 000 r/min離心15 min,取上層血清,于-80 ℃冰箱保存。將冷凍保存的血清常溫解凍,使用全自動生化分析儀進行尿酸、尿素氮、肌酐水平的測定。心臟血收集結束后,取右葉肝臟、右側腎臟制作HE染色切片,光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 不同時間各組大鼠生長情況及血清學變化比較

2.1.1 不同時間各組大鼠體重比較:整個實驗過程中各組大鼠活動正常、毛色正常、精神狀態(tài)良好、體重增長均勻、未出現(xiàn)死亡,見表1。

表1 不同時間各組大鼠體重比較

2.1.2 不同時間各組大鼠飲水量比較:第0周為大鼠適應性喂養(yǎng)階段,從實驗第1周開始各實驗組大鼠自由飲用果糖水,從實驗第2周開始,除A1B2C2組第3周、第8周、A2B1C2組第7周,A2B2C1組第8周外,各組間飲水量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 不同時間各組大鼠飲水量比較

2.1.3 不同時間各組大鼠尿酸水平比較:實驗第8周時,各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。觀察各組尿酸變化趨勢,僅有A1B1C1組大鼠尿酸出現(xiàn)明顯升高趨勢,其余各組大鼠尿酸水平變化比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

表3 不同時間各組大鼠尿酸水平比較

2.1.4 不同時間各組大鼠血清尿素氮水平比較:僅在實驗第2周時,各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其余各時間點空白對照組與實驗組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。

表4 不同時間各組大鼠血清尿素氮水平比較

2.1.5 不同時間各組大鼠血清肌酐水平比較:空白對照組與各實驗組大鼠血清肌酐水平均呈上升趨勢,實驗第8周時,各組大鼠血清肌酐比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);A1B1C1組、A2B2C1組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各實驗組與空白對照組比較均無統(tǒng)計學意義。各實驗組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表5。

表5 不同時間各組大鼠血清肌酐水平比較

2.2 各組大鼠組織病理切片觀察

2.2.1 肝臟組織病理切片觀察:肉眼觀察空白對照組與實驗組大鼠肝臟外觀,發(fā)現(xiàn)其呈紅褐色,表面光滑,質軟有彈性;實驗組大鼠肝臟個別出現(xiàn)水腫、體積增大。鏡下觀察空白對照組大鼠肝臟肝小葉結構完整,肝細胞以中央靜脈為中心于小葉周圍呈放射狀排列,大小均勻,肝細胞間界限清晰。實驗組大鼠肝臟肝小葉結構完整,肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。實驗組均有不同程度的肝細胞萎縮、肝竇擴張及肝細胞脂肪變性,整體損傷較輕,A2B2C1組出現(xiàn)一處點狀壞死,見圖1(封2)。

2.2.2 腎臟組織病理切片觀察:肉眼觀察空白對照組與實驗組大鼠腎臟外觀,發(fā)現(xiàn)其呈紅褐色,蠶豆狀,質地柔軟,表面光滑無腫塊,切面腎皮質與腎髓質分界清晰。鏡下觀察空白對照組大鼠腎臟結構完整,腎小球、腎小管形態(tài)正常,分布均勻,未見明顯萎縮或增生,無明顯炎癥浸潤。實驗組大鼠腎臟結構完整,腎小球未見損傷,均以腎小管損傷為主,可見輕微擴張及炎細胞浸潤。腎小管管壁無增厚,管腔內無結晶、沉淀,各實驗組可見不同程度的刷狀緣脫落,少見腎小管水腫,A2B2C1組可見明顯小灶性炎細胞浸潤,無明顯纖維化,見圖2(封2)。

2.3 正交設計分析:正交設計分析以三因素兩水平的果糖水濃度、OAPS給藥濃度、OAPS給藥途徑對實驗大鼠尿酸影響的數據進行計算及方差分析。使用Minitab 19軟件對各因子進行極差分析?？蓮木淀憫碇械贸龉菨舛葘Υ笫竽蛩嵊绊懽畲?取值為水平1(5%);其次為OAPS給藥途徑,取值為水平1(灌胃);OAPS給藥濃度對大鼠尿酸影響相對較小,為次要因素,取值為水平1 100 mg/(kg·d)。說明3個因素的影響排序為果糖水濃度>OAPS給藥途徑>OAPS給藥劑量。綜合分析正交最優(yōu)組合為A1B1C1,見表6。

表6 大鼠尿酸水平極差分析

3 討論

本研究選用果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀使大鼠體內尿酸水平升高,從而構建大鼠高尿酸血癥模型。劉杰[10]采用濃度為5%和10%的果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀100 mg/(kg·d)造模,發(fā)現(xiàn)濃度為5%的果糖引起的大鼠肝腎損傷較小,更適合應用于控制和治療高尿酸血癥的藥物篩選。Dhouibi等[11]連續(xù)15 d 對大鼠進行250 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀腹腔注射,建立慢性高尿酸血癥模型,而15 d 后停止腹腔注射,大鼠尿酸逐漸恢復至正常水平。Patil等[12]比較了幾種已經報道的高尿酸血癥模型,發(fā)現(xiàn)同種藥物在不同給藥途徑下(如灌胃、腹腔注射、關節(jié)內注射)可能導致不同的結果。本課題采用正交設計開展實驗,實現(xiàn)了不同給藥途徑和給藥濃度構建高尿酸血癥大鼠模型的探究。

在正交設計實驗下,4個實驗組中僅有A1B1C1組大鼠尿酸水平持續(xù)上升,上升程度不高但整體呈現(xiàn)緩慢穩(wěn)定上升趨勢,且第8周大鼠尿酸水平與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余組別大鼠尿酸水平上升均不明顯,這可能是由于該組果糖水攝入量遠高于其他各組,過量果糖水的攝入引起了尿酸代謝異常,很好地模擬了長期高果糖攝入導致的高尿酸血癥。整個實驗期間血清肌酐整體呈上升趨勢,第8周A1B1C1組與A2B2C1組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結合2組腎臟病理切片,發(fā)現(xiàn)確有輕微腎臟損傷;血清尿素氮水平無明顯變化,僅在第2周出現(xiàn)組間差異(P<0.05),這些結果表明各組大鼠腎臟組織均出現(xiàn)了不同程度的損傷。大鼠肝臟組織病理切片結果顯示,各組大鼠肝臟組織出現(xiàn)輕微損傷,少見肝細胞脂肪變性,可能與高果糖的攝入有關。有研究[13-15]證實長期攝入果糖會引起大鼠產生脂肪肝的病理改變,這種改變通常出現(xiàn)在高果糖攝入的第8周,這與本實驗觀察的結果相符。

正交設計結果分析顯示,果糖水濃度對模型尿酸水平升高影響最大,其次為OAPS給藥途徑,給藥濃度影響相對較弱。5%果糖水對于該模型的影響最大,OAPS灌胃次之。本實驗周期較短,腹腔注射未出現(xiàn)不良反應,但基于氧嗪酸鉀不溶于水的特性,腹腔注射極易引起腹腔積水等不良反應。出于建立長期穩(wěn)定的高尿酸血癥模型考慮,選取灌胃的給藥方式對大鼠的刺激較輕,構建的高尿酸血癥模型也更好[16]。此外,高濃度的氧嗪酸鉀造模對腎臟損傷較大[17-18],且尿酸升高極不穩(wěn)定。故結合本實驗正交分析各因子效應程度,初步推斷最優(yōu)組合為A1B1C1組。

結合基礎數據分析、正交設計結果與肝、腎組織HE染色病理改變,本研究認為在不同果糖濃度、不同OAPS劑量及不同給藥方式下探索的最優(yōu)高尿酸血癥大鼠模型配伍為5%果糖聯(lián)合100 mg/(kg·d)OAPS灌胃。