黃馨枝干炭疽病病原菌的鑒定

王旭 施文娟 孔婷 孫榮華

（1 鎮(zhèn)江市城市綠化管理站，鎮(zhèn)江 212000；2 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232；3 上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232）*為通信作者

黃馨（Jasminummesnyi），又稱云南黃素馨，為常綠藤狀灌木，喜溫暖濕潤的環(huán)境，因其適宜于堤岸、花架綠籬或坡地高地懸垂種植，在我國各地得到了廣泛栽培[1]。例如，在江蘇省鎮(zhèn)江市，黃馨是高架、立交橋道路及公園綠地等區(qū)域的主栽品種。

近年來，黃馨的病害發(fā)生引起了廣泛關(guān)注。目前，國內(nèi)外已報(bào)道引起黃馨葉部病害的病原菌有C.cassiicola、C.siamense[2-3]，但鮮有關(guān)于黃馨枝干病害病原菌的研究報(bào)道。目前，鎮(zhèn)江市的黃馨上出現(xiàn)了一種新的枝干炭疽病，受害枝干在發(fā)病初期出現(xiàn)近橢圓形的病斑，隨著病程的推進(jìn)，病斑可從數(shù)厘米長發(fā)展至整個(gè)枝干，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)易造成大量枝干枯萎死亡，給當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)景觀效果帶來較大影響。鑒于此，筆者對鎮(zhèn)江市黃馨枝干炭疽病的病原菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)和致病性測定，并利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因聯(lián)合分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行了致病菌的鑒定，旨在為該病害的診斷及科學(xué)防控提供理論研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 癥狀觀察

2019 年，筆者在江蘇省鎮(zhèn)江市七里甸街道，觀察并記錄黃馨枝干炭疽病的發(fā)病情況與危害特點(diǎn)，同時(shí)采集發(fā)病枝條帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)參照羅卿權(quán)等[4]提出的標(biāo)準(zhǔn)，具體為：0 級，無枝枯；1 級，1 枝無分枝的小枝枯萎；2 級，無分枝的小枝枯萎，數(shù)量大于1 枝；3 級，1枝有頂級分枝的枝條枯萎；4級，有頂級分枝的枝條枯萎且枝條枯萎?dāng)?shù)大于1 枝；5 級，1 枝或1 枝以上基部大枝（至少有兩級分枝）枯萎；6級，整株枯萎。

計(jì)算公式：株發(fā)病率＝（發(fā)病株數(shù)÷總株數(shù)）×100%；病情指數(shù)＝[∑(各級病株數(shù)×各級代表值)÷（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）]×100。

1.2 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

將發(fā)病癥狀典型的病枝用組織分離法進(jìn)行病原菌分離[4]，培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA）。取發(fā)病枝條病健交界處約3 mm ×3 mm 大小的植物組織，經(jīng)75% 乙醇消毒15～20 s、5%次氯酸鈉消毒2 min、無菌水漂洗3次、晾干后，接種在含1% 乳酸的PDA 平板上，然后將其置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，在14 h 光照/10 h 黑暗條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d 后，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特征，記錄分生孢子的形狀和大小，挑取孢子，采用玻片萌發(fā)法觀察附著胞的形態(tài)，參照相關(guān)文獻(xiàn)從形態(tài)上進(jìn)行初步鑒定[5-6]。

1.3 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定。具體方法為：用無菌手術(shù)刀劃傷枝條表皮，形成長度為1 cm 的傷口，將菌絲塊正面朝向傷口，用已浸濕無菌水的脫脂棉保濕，每個(gè)菌株重復(fù)接種3個(gè)枝條，并設(shè)置清水對照。接種后5～7 d 觀察枝條發(fā)病情況，并對發(fā)病枝條進(jìn)行病原菌再分離，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.4 多基因聯(lián)合鑒定

1.4.1 菌株DNA 提取與PCR 擴(kuò)增

在接種菌株的PDA 平板于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱、14 h 光照/10 h 黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d 后，用滅菌的刀片刮取PDA 平板表面菌絲，置于研缽中，加入液氮研磨，采用CTAB 法提取基因組DNA[7]。對真菌的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間隔區(qū)（internal transcribed spaces，ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（actin，ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）、ApMAT基因 (partial mating type Mat1-2 gene)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase gene，GS)、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列及退火溫度等見表1[8-9]，引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。PCR 體系總體積為25.0 μL，包括0.1 μL Taq 聚合酶（5 U/μL）、2.5 μL PCR Buffer(含Mg2+)、2.0 μL dNTPs、引物(10 μmol/L)各1.0 μL、1.0 μL 模板DNA，然后用滅菌ddH2O 補(bǔ)足25.0 μL。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列、退火溫度及PCR 產(chǎn)物長度

1.4.2 聚類分析

采用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blastn 工具進(jìn)行序列比對和同源性分析，下載相似性高的序列及其對應(yīng)模式菌的序列用于聚類分析。將所需序列，用Clustal X 2.0.1 0 進(jìn)行比對剪切后，按ITS-GAPDHACT-TUB-ApMAT-GS的順序分別首尾相連接，用MEGA-X 軟件以鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自展法 (Bootstrap，1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀觀察及病情調(diào)查

黃馨枝干炭疽病在鎮(zhèn)江市始發(fā)于4月下旬，故本研究于2019 年5 月—9 月進(jìn)行調(diào)查，共調(diào)查50 株黃馨。結(jié)果表明，5月黃馨枝干炭疽病的病株率為28%、病情指數(shù)為12.5，6 月黃馨枝干炭疽病的病株率為48%、病情指數(shù)為19.0，7 月黃馨枝干炭疽病的病株率為62%、病情指數(shù)為32.0，8月黃馨枝干炭疽病的病株率為78%、病情指數(shù)為40.3，9月黃馨枝干炭疽病的病株率為82%、病情指數(shù)為42.6。黃馨枝干炭疽病在初發(fā)時(shí)，受害枝干出現(xiàn)黑褐色、近橢圓形病斑，隨著病情的推進(jìn)，病斑中心凹陷，病斑擴(kuò)展延長呈長橢圓形或不規(guī)則形，且無分枝的小枝受害時(shí)，小枝萎蔫；在發(fā)病后期，基部枝條上病斑沿枝干擴(kuò)展成條塊狀，使枝條上葉片枯萎，直至黃馨整株萎蔫干枯。病原菌不僅可以侵染黃馨較小的分枝，導(dǎo)致分枝枯死，也可侵染黃馨基部主枝，導(dǎo)致黃馨整株枯萎死亡。

2.2 病原菌分離與致病性

從采集的發(fā)病癥狀典型的黃馨病枝中，分離培養(yǎng)得到10 個(gè)菌落形態(tài)一致的分離物（命名為JM-1），其菌落呈圓形，邊緣整齊，初期為白色；氣生菌絲為白色至灰白色，后漸變?yōu)樯罨疑?、絮狀或絨狀，培養(yǎng)皿背面呈現(xiàn)不均勻的灰白色。挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)移純化，將菌株命名為2019JM。為驗(yàn)證菌株2019JM 的致病性，將其接種于黃馨枝條，接種5 d 后發(fā)現(xiàn)，接種枝條萎蔫，發(fā)病癥狀與黃馨枝枯病自然狀態(tài)下的感染癥狀相同，接種清水的枝條不發(fā)病。對接種發(fā)病的黃馨枝條進(jìn)行病原菌再次分離，所得分離物的菌落形態(tài)與原分離物JM-1 一致，證明2019JM 為黃馨枝干炭疽病的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌2019JM 接種在PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中、于14 h 光照/10 h 黑暗條件下，培養(yǎng)5 d 后，病原菌分生孢子呈橢圓形至長橢圓形，兩端鈍圓或一端略尖，無隔膜，單細(xì)胞，無色；分生孢子大小基本相近，大小為（12.1～16.5）μm×(4.0～5.0)μm，見圖1-A。分生孢子萌發(fā)后，在頂端產(chǎn)生附著胞，附著胞為黑褐色、棍棒形或橢圓形，邊緣大多規(guī)則，大小為(5～11)μm×(4～8)μm，見圖1-B。依據(jù)孢子和附著胞的形態(tài)特征，將其初步鑒定為炭疽菌屬真菌，具體的種需要采用分子手段進(jìn)行進(jìn)一步鑒定[5-6]。

圖1 菌株2019JM 的形態(tài)特征

2.4 病原菌rDNA-ITS 序列分析

提取病原菌基因組DNA 并對ITS、GAPHD、GS、TUB2、ACT和ApMAT序列片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將序列提交給NCBI 數(shù)據(jù)庫，獲得序列號，具體見表2。以Colletotrichumhippeastri（CBS 241.78）作為外群[6]，多基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類分析結(jié)果見圖2，菌株2019JM 與GenBank 中的模式菌株暹羅炭疽菌C.siamense(ICMPl8578、LC2940、LC2941、CBS125378) 以很高的支持率聚為一支，表明菌株2019JM 為暹羅炭疽菌。因此，綜合依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，本研究將引起江蘇省鎮(zhèn)江市黃馨枝干炭疽病的病原菌鑒定為C.siamense。

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析中的菌株信息

圖2 基于多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)真菌寄主廣泛，是世界范圍內(nèi)許多糧食作物及經(jīng)濟(jì)作物上的重要致病菌[5-6]，但是，炭疽菌屬不同種之間的形態(tài)特征差異微小，且繼代培養(yǎng)性狀不穩(wěn)定，故依據(jù)形態(tài)特征鑒定炭疽菌不夠準(zhǔn)確。同時(shí)，ITS基因序列難以區(qū)分膠孢炭疽菌復(fù)合群下近緣相似種之間的差異[10]，但依據(jù)多基因序列可以有效鑒定膠孢炭疽菌復(fù)合群下各種，故目前，多基因分析方法已成為炭疽菌屬真菌鑒定的必要手段[5-6]。例如，ApMAT和GS的單基因或者雙基因可以將暹羅炭疽菌從膠孢炭疽菌復(fù)合群下鑒定出來[5-6]。本研究前期采用單基因分析發(fā)現(xiàn)，依據(jù)ITS基因發(fā)育樹的自展支持率較低，不能有效區(qū)分各序列的進(jìn)化關(guān)系，而GS、TUB-2、ApMAT基因可以將暹羅炭疽菌的各菌株聚在一起，但是對膠孢炭疽菌復(fù)合群下其他種的自展支持率較低，說明只有依賴多基因序列才能有效區(qū)分膠孢炭疽菌復(fù)合群下各種的進(jìn)化關(guān)系。

暹羅炭疽菌C.siamense最早在泰國咖啡上被發(fā)現(xiàn)[10]，隨后有C.siamense在草莓、葡萄、油茶、辣椒、橡膠等多種寄主植物上發(fā)生的報(bào)道[6,8,11-14]，由于C.siamense具有較強(qiáng)的致病力，故對寄主植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在鎮(zhèn)江市，C.siamense為害黃馨枝干引起的炭疽病一般在4 月下旬開始發(fā)生，病害初發(fā)時(shí)，受害枝條上出現(xiàn)不規(guī)則病斑，無分枝的小枝受害時(shí)，會(huì)造成小枝枯萎；在5 月—6 月，黃馨枝干炭疽病的病株率有所升高，但病害總體發(fā)生程度較輕，偶有頂級枝條萎蔫，多表現(xiàn)為無分枝的小枝枯萎和枝干部位出現(xiàn)病斑；7 月—9月是黃馨枝干炭疽病的發(fā)病高峰期，且此時(shí)夏季高溫，受溫度脅迫易造成大量枝干枯萎死亡，甚至造成黃馨整株枯死，嚴(yán)重影響了黃馨的生態(tài)景觀價(jià)值。

本研究利用病原菌形態(tài)特征結(jié)合多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，首次明確了引起鎮(zhèn)江市黃馨枝干炭疽病的病原菌為C.siamense，這為該病害的診斷提供了理論依據(jù)，且這是國內(nèi)首次報(bào)道C.siamense引起黃馨枝干炭疽病。

有研究認(rèn)為，炭疽菌易發(fā)生復(fù)合侵染，即多種炭疽菌可同時(shí)侵染同一寄主植物。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，辣椒炭疽病的致病菌有4 種；李楊等[14]在海南省的油茶上分離到3種不同的炭疽菌。因此，關(guān)于黃馨枝干炭疽病是否存在優(yōu)勢菌株和復(fù)合侵染現(xiàn)象也有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。