光學法血小板計數(shù)對采血后可逆性血小板聚集的解聚效果

鄧晨霞 梅燕萍 張 霞 黃寶山 添 丹 曹夢婷 胡永奇 林勇平 田禮軍

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336；2.南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006；3.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；4.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇 徐州 221002）

血小板（platelet，PLT）在人體內(nèi)主要參與止血與血栓形成，具有重要的生理功能，PLT計數(shù)是常見的臨床檢驗項目之一[1]。目前，血液分析儀檢測PLT的方法既有傳統(tǒng)的阻抗法，也有能排除更多檢測干擾因素的核酸熒光染色法[2]。阻抗法速度快、成本低，常規(guī)檢測一般采用阻抗法完成，但當PLT被紅細胞碎片或大PLT干擾時，則需用核酸熒光染色法進行糾正[3]。PLT聚集也是PLT計數(shù)的常見干擾因素，會導致PLT假性減少，但核酸熒光染色并不能解決這種干擾[4]，通常的解決方法是更換抗凝管，重新采集標本進行二次檢測[5]。這種方法雖然大部分情況下有效，但是會顯著影響急診出報告時間。有研究發(fā)現(xiàn)，血液分析儀的光學法PLT計數(shù)時會加入解聚劑，高速混勻、加溫后，對乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥（ethylenediaminetetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）的PLT聚集有較好的解聚效果[4]。

與EDTA-PTCP的PLT計數(shù)進行性降低不同，還有一種PLT聚集是在采血后新鮮血液與抗凝劑混勻時立即發(fā)生的，但這種PLT聚集是可逆的，隨著時間的延長，聚集的PLT會自行解聚，PLT計數(shù)隨著時間的延長會逐漸升高[5-6]。對于這種可逆性PLT聚集，實驗室通常會將樣本靜置5～10 min再上機檢測。本研究擬分析光學法PLT計數(shù)的解聚效果是否適用于采血后的可逆性PLT聚集，以便為急診快速、準確報告結(jié)果提供更好的解決方案，并分析對于EDTA-PTCP標本需要二次采血的患者采用立即采血立即檢測的方式是否受可逆性聚集的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2021年12月—2022年8月上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院、南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院、廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、徐州市兒童醫(yī)院門急診檢驗201例PLT正常的乙二胺四乙酸抗凝靜脈血標本，患者年齡6個月～93歲，所有標本采集后均在室溫（18～25 ℃）條件下完成檢測。排除標準：1）既往有輸血史，急性炎癥、慢性炎癥、癌癥、慢性粒細胞白血病、再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病患者；2）PLT計數(shù)＜100×109個/L或＞300×109個/L，PLT功能異常；3）近2周服用過影響PLT數(shù)量或功能的藥物。本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 儀器和試劑

深圳邁瑞公司BC-6800Plus全自動血液分析儀，BC-7500全自動血液分析儀及配套試劑和質(zhì)控品。

1.3 方法

采血后輕輕混勻，于采血后0、5、15、30 min這4個時間點分別用血液分析儀CDR模式進行PLT計數(shù)各3次，部分標本在這4個時間點進行血涂片制備和染色，在血涂片兩側(cè)、片尾、海岸線處尋找并拍攝清晰的PLT聚集圖片。確保質(zhì)控在控。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料采用±s表示，不同方法之間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 采血后不同時間點阻抗法PLT計數(shù)結(jié)果

采血后第0、5、15、30分鐘阻抗法PLT計數(shù)分別為（243±74）×109/L、（252±72）×109/L、（257±73）×109/L、（261±74）×109/L。與第30分鐘比較，第0、5、15分鐘的PLT計數(shù)的均值偏差分別為6.92%、3.28%、1.65%。

2.2 采血后不同時間點光學法PLT計數(shù)結(jié)果

采血后第0、5、15、30分鐘，光學法PLT計數(shù)分別為（263±75）×109/L、（262±75）×109/L、（261±75）×109/L、（261±75）×109/L。與第30分鐘比較，第0、5、15分鐘PLT計數(shù)的均值偏差分別為0.76%、0.35%、0.03%。

2.3 采血后第30分鐘光學法與阻抗法PLT計數(shù)比較

采血后第30 分鐘，阻抗法PLT 計數(shù)為（261±74）×109/L，光學法PLT計數(shù)為（261±75）×109/L，2種方法差異無統(tǒng)計學意義（P=0.686）。

2.4 采血后第0、5、15分鐘光學法與阻抗法PLT計數(shù)比較

采血后第0 分鐘，阻抗法PLT 計數(shù)為（243±75）×109/L，光學法PLT 計數(shù)為（263±75）×109/L，兩者均值偏差為7.62%，2種方法差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。采血后第5分鐘，阻抗法PLT計數(shù)為（252±72）×109/L，光學法PLT計數(shù)為（262±75）×109/L，兩者均值偏差為3.62%，2種方法差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。采血后第15分鐘，阻抗法PLT計數(shù)為（257±73）×109/L，光學法PLT計數(shù)為（261±75）×109/L，兩者平均值偏差為1.67%，2種方法差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.5 部分標本涂片鏡檢結(jié)果與各時間點光學法和阻抗法PLT計數(shù)分析

分別于采血后第0、5、15、30分鐘對部分標本進行涂片鏡檢和全片掃描，結(jié)果顯示，有1例標本在0和5 min的血涂片中檢出PLT聚集，但在15和30 min的血涂片中幾乎找不到PLT聚集，見圖1。這例標本第0、5、15、30分鐘的光學法和阻抗法PLT計數(shù)分別為226×109/L和237×109/L、219×109/L和236×109/L、240×109/L和240×109/L、235×109/L和232×109/L。

圖1 采血后不同時間點血涂片上PLT聚集情況

3 討論

PLT聚集導致的PLT計數(shù)假性減少是臨床檢驗工作中常遇見的情況，處理不當容易造成臨床誤診。當血液樣本發(fā)生PLT聚集時，不定數(shù)量的PLT黏連成1個大“顆?！?，常規(guī)的電阻抗法通過計數(shù)特定體積區(qū)間的顆粒數(shù)這一原理難以準確計數(shù)。人工鏡檢法可以直觀地觀察到PLT聚集，起到復核的作用，但要準確地計數(shù)該標本的PLT仍然需要重新采集標本進行二次檢測。

二次采血方案受患者依從性的影響，操作不便利。除了二次采血外，還有一些對聚集PLT的體外“解聚”方法，如在抽血后30 min內(nèi)加入阿米卡星，有助于糾正部分PLT聚集標本EDTAPTCP[7]。除阿米卡星外，卡那霉素等氨基糖苷類抗菌藥物和CaCl2等無機鹽離子也具有一定的PLT解聚功能[8]。此外，對血液標本進行溫浴[9]，或者上機檢測前充分震蕩混勻[10]，也可糾正部分PLT聚集導致的假性PLT減低，但上述方法的對PLT聚集標本的PLT計數(shù)糾正效果不佳，僅對約50%聚集的標本有糾正功能。HE等[11]檢測了22例EDTA-PTCP標本，光學法PLT計數(shù)結(jié)果顯著高于阻抗法PLT計數(shù)，與第2次更換枸櫞酸鈉采血的結(jié)果一致，偏差均在8%以內(nèi)；BAO等[4]對23例PLT聚集標本進行光學法PLT計數(shù)和阻抗法PLT計數(shù)，并通過公式計算解聚率（PLT聚集標本光學法PLT計數(shù)/PLT真實計數(shù)×100%），發(fā)現(xiàn)22例標本的解聚率＞80%。光學法PLT計數(shù)的解聚效果在其他實驗室也得到驗證[12-15]。與體外加解聚劑、加溫或震蕩相比，光學法PLT計數(shù)的解聚效果更佳，而且無需額外操作，有利于實驗室設(shè)定復檢規(guī)則，可對PLT聚集的標本進行光學法PLT計數(shù)自動解聚。

盡管光學法PLT計數(shù)的解聚效率得到極大提升，但并不能完全解聚所有PLT聚集標本，最主要的原因是光學法PLT計數(shù)的解聚效率呈時間依賴性。大部分門診送檢標本的檢測時間為10～30 min，大部分住院患者送檢標本的檢測時間為20～50 min[16-17]，發(fā)生PLT聚集的標本進行光學法PLT計數(shù)復檢的時間則更晚。蔡麗秀等[18]研究了光學法PLT計數(shù)對EDTA-PTCP患者采血后不同時間點標本的解聚效果，發(fā)現(xiàn)采血后0～5 min上機進行光學法PLT計數(shù)的解聚率可達100%，20 min后則降至77.8%。基于相關(guān)研究結(jié)果和日常檢驗科操作流程，可設(shè)置復檢規(guī)則“當儀器提示‘聚集PLT’報警或PLT結(jié)果＜100×109/L時，自動開啟網(wǎng)織紅細胞通道復檢光學法PLT計數(shù)”，可解決大多數(shù)PLT聚集導致的PLT計數(shù)假性減低。對于一些光學法PLT計數(shù)解聚不佳的PLT聚集標本，可通知患者儀器旁二次采血，采血后立即行光學法PLT計數(shù)，此流程可顯著降低重新抽血的概率，并能解決幾乎所有EDTA-PTCP導致的PLT假性減低的問題。

然而，0～5 min上機行光學法PLT計數(shù)的一個干擾因素是采血后離體的PLT會發(fā)生可逆性PLT聚集，該可逆性聚集會也會導致PLT假性減低。本研究結(jié)果顯示，采血后立即行阻抗法PLT計數(shù)，結(jié)果會受到PLT可逆性聚集的影響，平均偏差為6.92%，標本放置5 min后行阻抗法PLT計數(shù)結(jié)果雖然與30 min后的結(jié)果有差異，但差異＜5%。而光學法PLT計數(shù)的結(jié)果不會受到可逆性PLT聚集的影響，采血后不同時間點的光學法PLT計數(shù)結(jié)果基本上保持一致，平均偏差＜1%。本研究對采血后不同時間點的標本制備血涂片，并鏡下查找PLT聚集，但因為聚集數(shù)量太少，以及人工掃描的局限性，并未發(fā)現(xiàn)血涂片上的PLT聚集與PLT計數(shù)的相關(guān)性。值得注意的是，本研究掃描部分標本后，發(fā)現(xiàn)了一些典型的血涂片：0和5 min時間點的血涂片上發(fā)現(xiàn)了PLT聚集，阻抗法PLT計數(shù)結(jié)果降低；15和30 min時間點的血涂片上未發(fā)現(xiàn)PLT聚集，阻抗法PLT計數(shù)結(jié)果正常；光學法PLT計數(shù)在各個時間點的結(jié)果均保持一致并且正常，提示光學法PLT計數(shù)對可逆性PLT聚集同樣具有解聚功能。

綜上所述，本多中心研究證實了血液分析儀光學法PLT計數(shù)對PLT聚集的解聚功能同樣適用于采血后短時間內(nèi)的PLT可逆性聚集。對于少部分光學法PLT計數(shù)解聚不佳的患者可以二次采血后立即行光學法PLT計數(shù)，結(jié)果不受PLT可逆性聚集的影響。