血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA 表達(dá)與急性缺血性腦卒中患者血管性認(rèn)知障礙的相關(guān)性

朱 倩 褚麗芳 馬彩云 姚 潔

（石家莊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū)，河北 石家莊 050011）

卒中居我國(guó)居民死亡原因的第3位，急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是最常見(jiàn)的卒中類(lèi)型，我國(guó)AIS患病率為1 255.9/10萬(wàn)，年發(fā)病率為144.8/10萬(wàn)，死亡率為62.2/10萬(wàn)[1-2]。有研究結(jié)果顯示，卒中患者發(fā)病后認(rèn)知障礙的發(fā)生率高達(dá)30%，血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）居癡呆原因的第2位，僅次于阿爾茨海默病[3]。因此，早期預(yù)測(cè)AIS后VCI發(fā)生意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)參與了VCI的發(fā)生、發(fā)展[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性小分子RNA，能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生參與VCI的發(fā)生、發(fā)展[5]。miR-140-5p是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在出血性腦卒中患者血液中表達(dá)上調(diào)，與神經(jīng)缺損程度和預(yù)后有關(guān)[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-140-5p參與了大鼠腦出血后的神經(jīng)發(fā)生[7]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α（peroxisome-proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，能通過(guò)抑制活性氧產(chǎn)生來(lái)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PGC-1α參與調(diào)節(jié)缺氧缺血性腦病大鼠神經(jīng)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥[9]。目前，關(guān)于血清miR-140-5p、PGC-1α表達(dá)與AIS患者VCI發(fā)生的關(guān)系的報(bào)道較少。本研究擬探討血清miR-140-5p、PGC-1α水平與AIS患者發(fā)生VCI的關(guān)系，旨在為早期防治VCI提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年1月—2022年1月石家莊市人民醫(yī)院AIS患者163例，其中男114例、女49例，年齡（59.86±8.62）歲，體重指數(shù)為（21.53±2.87）kg/m2；受教育程度：小學(xué)及以下34例、中學(xué)48例、大學(xué)81例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）經(jīng)顱腦電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）/磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）確診為AIS，符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2）年齡≥18歲；3）臨床資料完整；4）患者或家屬知情并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）既往認(rèn)知功能障礙；2）近3個(gè)月內(nèi)有顱腦手術(shù)史或外傷史；3）因精神疾病、失語(yǔ)、聽(tīng)力障礙、視力障礙等不能完成神經(jīng)心理測(cè)試；4）合并造血、免疫系統(tǒng)損傷；5）不能接受隨訪；6）合并惡性腫瘤。另選取同期石家莊市人民醫(yī)院體檢健康者57名作為正常對(duì)照組，其中男40名、女17名，年齡（57.88±7.18）歲，體重指數(shù)為（21.47±1.88）kg/m2；受教育程度：小學(xué)及以下12例、中學(xué)17例、大學(xué)28例。2個(gè)組年齡、性別、體重指數(shù)和受教育程度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)石家莊市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（院科倫審〔2019〕第69號(hào)），所有研究對(duì)象或家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集

收集AIS患者的一般資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、受教育程度、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病（包括高血壓、糖尿病、高脂血癥）、病灶位置（腦葉、腦干、白質(zhì)、基底節(jié)、丘腦）和入院時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分[11]。

1.2.2 miR-140-5p和PGC-1α mRNA檢測(cè)

采集AIS患者入院次日和體檢者體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血3 mL，1 007×g離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。采用Trizol試劑盒（貨號(hào)ALH011，北京百奧萊博科技有限公司）提取總RNA，采用NanoDrop微量分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）驗(yàn)證純度、濃度合格（A260nm/A280nm比值為1.8～2.0）后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RR036A，日本TaKaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，采用VeritiPro PCR儀（美國(guó)ABI公司）和SYBR Premix Ex Taq試劑盒（貨號(hào)DRR820A，上海赫果生物科技有限公司）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)和合成由上海劍鈍生物科技有限公司完成。miR-140-5p正向引物為5'-TAACCGCAGAGGTCACACTCAG-3'，反向引物為5'-CTCAGAAACTGTGGCATCCCGA-3'。miR-140-5p 內(nèi)參U6 正向引物為5'-ACTTTCACGCCGCTCATCCAGT-3'，反向引物為5'-TCTCAGGACTGGTTCACAGCGT-3'。PGC-1α正向引物為5'-TAATCTCAGCTGGCAACTGTG-3'，反向引物為5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；PGC-1α 內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）正向引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3'，反向引物為5'-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3'。PCR反應(yīng)體系：共10 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA模板1.0 μL、ROX Reference Dye（50×）0.2 μL、DNaseⅠ溶液3.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-140-5p和PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪和分組

通過(guò)復(fù)診方式對(duì)AIS患者隨訪3個(gè)月，參考《2018中國(guó)癡呆與認(rèn)知障礙診治指南（一）：癡呆及其分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)》[12]診斷VCI：1）有明確的卒中病史；2）認(rèn)知障礙（簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表，文盲＜17分、小學(xué)＜20分，初中及以上＜24分）相對(duì)急性發(fā)病或呈階梯樣進(jìn)展；3）認(rèn)知障礙與卒中有明確的因果和時(shí)間關(guān)系（哈金斯基缺血指數(shù)量表≥7分）；4）影像學(xué)檢查顯示大腦皮質(zhì)或皮質(zhì)下病灶，且直徑＞1.5 cm。根據(jù)是否合并VCI分為VCI組（41例）和非VCI組（122例）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS28.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用U檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析評(píng)估AIS患者發(fā)生VCI的危險(xiǎn)因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA判斷AIS患者發(fā)生VCI的效能，采用Hanley & McNeil檢驗(yàn)比較各項(xiàng)指標(biāo)的曲線下面積（area under curve，AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIS組與正常對(duì)照組血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA表達(dá)比較

AIS 組血清miR-140-5p 相對(duì)表達(dá)量（4.52±1.19）高于正常對(duì)照組（1.71±0.45）（t=25.374，P＜0.001），PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量（1.16±0.40）低于正常對(duì)照組（3.14±0.61）（t=22.857，P＜0.001）。

2.2 VCI組與非VCI組各項(xiàng)指標(biāo)比較

隨訪3個(gè)月后，163例AIS患者中，有41例（25.15%）發(fā)生VCI。VCI組NIHSS評(píng)分和miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量均顯著高于非VCI組（P＜0.05），PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于非VCI組（P＜0.05），2個(gè)組之間性別、年齡、體重指數(shù)、受教育程度、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病、病灶位置差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 VCI組與非VCI組各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.3 AIS患者VCI發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

以NIHSS評(píng)分、miR-140-5p、PGC-1α mRNA為自變量，是否發(fā)生VCI（是為“1”；否為“0”）為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，NIHSS評(píng)分、血清miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量升高和血清PGC-1α相對(duì)表達(dá)量降低是AIS患者發(fā)生VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為3.298、1.438、0.716，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為1.983～5.485、1.147～1.801、0.585～0.876]。見(jiàn)表2。

表2 AIS患者發(fā)生VCI的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA判斷AIS患者VCI的效能

采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測(cè)方程為：Logit（P）=0.225+0.358×miR-140-5p-0.330×PGC-1α mRNA。ROC曲線分析顯示，miR-140-5p、PGC-1α mRNA單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)判斷AIS患者發(fā)生VCI的AUC分別為0.790、0.780、0.905，聯(lián)合檢測(cè)的AUC顯著高于單項(xiàng)檢測(cè)（Z值分別為3.357、3.769，P值分別為0.001、＜0.001）。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA判斷AIS患者發(fā)生VCI的ROC曲線

表3 血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA表達(dá)預(yù)測(cè)AIS患者發(fā)生VCI的效能

3 討論

腦卒中后VCI是指卒中事件后出現(xiàn)的認(rèn)知損害，與腦卒中存在時(shí)序關(guān)系。與阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病引起的癡呆不同，腦卒中后VCI具有病程波動(dòng)性、斑片狀認(rèn)知缺損等特點(diǎn)，且致殘、致死率較高，患者5年生存率為39%，而同齡無(wú)VCI的腦卒中患者5年生存率為75%，VCI已成為腦卒中疾病負(fù)擔(dān)的重要原因[13]。目前，尚無(wú)針對(duì)腦卒中后VCI的特異性指標(biāo)，主要通過(guò)簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表或蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表評(píng)估認(rèn)知功能來(lái)進(jìn)行診斷，不適用于腦卒中后合并忽視癥、失語(yǔ)癥的患者，因此有必要尋找可靠的生物標(biāo)志物用于腦卒中后VCI的輔助診斷。

在生理狀態(tài)下，側(cè)腦室外側(cè)壁的腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞能通過(guò)不斷增殖產(chǎn)生新的神經(jīng)元，即神經(jīng)發(fā)生來(lái)維持神經(jīng)功能，但腦卒中引起的血管損傷會(huì)損害神經(jīng)血管單元，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生功能被破壞，直接影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，誘發(fā)VCI[14]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了VCI的發(fā)生、發(fā)展[15]。miR-140-5p位于人16號(hào)染色體q22.1，與神經(jīng)功能密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-140-5p能靶向分揀連接蛋白12，加重其對(duì)糖尿病大鼠的神經(jīng)毒性，而敲除miR-140-5p則可減弱其對(duì)糖尿病大鼠的神經(jīng)毒性作用[16]。miR-140-5p能通過(guò)下調(diào)ADAM金屬肽酶結(jié)構(gòu)域10，加大對(duì)阿爾茨海默病患者的神經(jīng)毒性作用[17]。腦卒中后抑郁癥是一種腦卒中后的神經(jīng)功能障礙。有研究結(jié)果顯示，AIS小鼠模型腦組織miR-140-5p表達(dá)上調(diào)與腦卒中后抑郁癥發(fā)生有關(guān)[18]。在采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立的腦缺血模型中，miR-140-5p過(guò)表達(dá)能通過(guò)靶向Prospero同源框蛋白1（prospero homeobox 1，Prox1）調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，抑制神經(jīng)元的增殖和分化，減少神經(jīng)元數(shù)量[7]。這提示miR-140-5p與AIS患者的神經(jīng)功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，AIS患者血清miR-140-5p表達(dá)顯著上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道[6]一致；VCI組miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于非VCI組（P＜0.05），且miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量升高是AIS患者發(fā)生VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.438，95%CI為1.147～1.801）。說(shuō)明血清miR-140-5p可能參與了AIS后VCI的發(fā)生，原因可能與miR-140-5p能靶向下調(diào)Prox1，抑制神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。Prox1是海馬齒狀回顆粒下區(qū)的成體神經(jīng)新生不可或缺的正性調(diào)節(jié)因子，Prox1表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)新生降低[19]。LIANG等[20]的研究結(jié)果顯示，miR-140-5p過(guò)表達(dá)能靶向下調(diào)Prox1，抑制神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)可塑性，進(jìn)而促進(jìn)VCI的發(fā)生、發(fā)展。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生和代謝的中心，AIS患者缺氧、鈣超載等一系列病理變化可導(dǎo)致線粒體功能障礙，產(chǎn)生大量活性氧，進(jìn)而發(fā)生氧化應(yīng)激，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)活化，加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損害，因此線粒體功能障礙被認(rèn)為是VCI發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[21]。PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)劑，能通過(guò)上調(diào)線粒體DNA和誘導(dǎo)編碼線粒體蛋白的基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)線粒體的生物合成。有研究結(jié)果顯示，PGC-1α能通過(guò)促進(jìn)活性氧解毒酶和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)，減少活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)線粒體的抗氧化應(yīng)激能力[22]。另外，PGC-1α還與認(rèn)知功能有關(guān)，運(yùn)動(dòng)后，PGC-1α表達(dá)會(huì)上調(diào)，可增加海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，改善衰老引起的認(rèn)知功能障礙[23]。采用PGC-1α激活劑上調(diào)PGC-1α表達(dá)能抑制帕金森病大鼠模型的神經(jīng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[24]。本研究結(jié)果顯示，AIS患者血清PGC-1α mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，可能與AIS影響PGC-1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯修飾，導(dǎo)致PGC-1α mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，VCI組PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于非VCI組（P＜0.05），且PGC-1α相對(duì)表達(dá)量降低是AIS后VCI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=0.716，95%CI為0.585～0.876），說(shuō)明血清PGC-1α mRNA表達(dá)下調(diào)可能參與了AIS后VCI的發(fā)生，這可能與PGC-1α能增強(qiáng)線粒體抗氧化應(yīng)激能力，進(jìn)而抑制神經(jīng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。在采用閉塞雙側(cè)頸總動(dòng)脈方式建立的大鼠腦灌注不足模型中，上調(diào)PGC-1α表達(dá)能抑制大鼠的線粒體損傷和活性氧產(chǎn)生，保護(hù)海馬區(qū)域的神經(jīng)元免受炎癥損傷，改善認(rèn)知功能[25]。本研究結(jié)果還顯示，NIHSS評(píng)分是AIS患者發(fā)生VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=3.298，95%CI為1.983～5.485）。NIHSS評(píng)分反映了患者神經(jīng)功能缺損的程度，評(píng)分越高，提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，發(fā)生VCI的風(fēng)險(xiǎn)越高。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-140-5p、PGC-1α mRNA單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)判斷AIS后發(fā)生VCI的AUC分別為0.790、0.780、0.905。由此可見(jiàn)，血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA或可作為AIS患者發(fā)生VCI的預(yù)警指標(biāo)，且聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)效能更高。

綜上所述，AIS患者血清miR-140-5p和PGC-1α mRNA表達(dá)均異常，與VCI發(fā)生密切相關(guān)，或可作為VCI發(fā)生的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但本研究隨訪時(shí)間較短，關(guān)于血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA表達(dá)與AIS患者遠(yuǎn)期發(fā)生VCI的關(guān)系還需進(jìn)一步研究，二者參與AIS患者VCI發(fā)生的機(jī)制也需進(jìn)一步研究。