基于轉錄組測序和RT-qPCR技術的煙草糖酯合成基因挖掘

黃申,閆茗熠,2,陳夢月,尚紫博,楊晨,張金林,褚智國,毛多斌

1.鄭州輕工業(yè)大學 煙草科學與工程學院,河南 鄭州 450001;2.山東中煙工業(yè)有限責任公司 濟南卷煙廠,山東 濟南 250000;3.山東中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心,山東 濟南 250000

0 引言

在煙草中,由煙葉表面腺毛細胞分泌的糖酯[1-2]是一類重要的香味前體物,也是煙用香精香料的重要組成部分之一,對煙葉的香氣品質有積極影響[3-5]。在卷煙燃燒時,糖酯的裂解產物主要是3-甲基丁酸、3-甲基戊酸、異丁酸、異戊酸等揮發(fā)性酸性物質,可以提升卷煙香氣,使香氣更加濃郁[6]。糖酯還能夠在煙草葉面上生成一層油水相隔的雙分子層保護膜,具有保潤、保香作用[7-9],相較于其他保濕劑,其更具安全性且不易影響煙草本香。此外,煙草糖酯還能夠調節(jié)植物生長,具有抗蟲、抗菌活性,因其作用廣泛而被學者關注[10]。

糖酯的合成機制較為復雜,主要分為?；満铣珊王；溑c蔗糖底物羥基的連接兩個步驟。目前,對與煙草同屬茄科的番茄、牽?；ǖ戎参锾酋ズ铣赏緩降年P鍵基因和分子機制的研究已取得重要進展[11-13],但對調控煙草糖酯合成途徑關鍵基因的研究仍較為缺乏。因此,深入探索煙草中參與糖酯形成的基因,對進一步揭示煙草糖酯合成調控的分子機制,以及對糖酯的進一步開發(fā)利用具有重要意義。

通過轉錄組測序可以分析組織內所有轉錄產物(RNA),從而獲得組織內基因表達水平[14-15]。熒光實時定量PCR(RT-qPCR)技術能夠定量評估特定基因在樣品中的表達水平,可作為轉錄組測序分析更加精準的技術補充[16]。基于此,本文擬對比分析煙草腺毛細胞和葉細胞的轉錄組數(shù)據(jù),以篩選與糖酯合成相關的功能基因,并通過RT-qPCR對這些基因表達水平進行驗證,以期初步挖掘煙草糖酯合成基因,進而為研究糖酯的代謝調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

主要材料:K326烤煙中部煙葉,生長于河南省平頂山市,生長周期為90 d,長度為40～50 cm。

主要試劑:RNeasy Plant mini Kit 試劑盒,上海恒斐生物技術有限公司;PrimeScript TM 1st stand cDNA Synthesis Kit 試劑盒,寶日醫(yī)生物技術北京有限公司;二氯甲烷,分析純,山東禹王和天下新材料有限公司;BSTFA-TMCS、DMF,均為分析純,美國默克生命科學技術有限公司。

主要儀器:Agilent 8890型氣相色譜質譜-聯(lián)用(GC-MS)儀,美國安捷倫科技有限公司;Mini Pro 300V Power Supply型電泳儀,上海器仁儀器有限公司;Tanon2500型凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司;Labnet Sub System 70型電泳槽,蘇州賽恩斯儀器有限公司;TIB8600型實時熒光定量PCR儀,泰普生物科學中國有限公司;Lieca DM750型常規(guī)正置光學顯微鏡,德國徠卡顯微系統(tǒng)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙葉表面糖酯的提取及GC-MS分析采用浸提法從新鮮煙葉樣品中提取糖酯[17],將煙葉樣品在3個盛有25 L二氯甲烷的不銹鋼桶中按順序分別浸提3次,每次2～3 s,合并和過濾二氯甲烷浸提液,在40 ℃條件下旋轉蒸發(fā)濃縮,將濃縮液于60 ℃條件下干燥,即得煙葉表面浸提物。取少量浸提物加入0.2 mL BSTFA-TMCS和 DMF體積比為1∶1的溶液中,密封,在70 ℃水浴中保溫1 h進行衍生化處理[18]后,進行GC-MS檢測。

GC條件為:HP-5 MS毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);初溫120 ℃保持3 min,以10 ℃/min的速率升溫至270 ℃,再以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃保持20 min,結束;汽化室溫度300 ℃;載氣為高純He(99.999%);流速1.0 mL/min;進樣量為1.0 μL,分流比1∶1。

MS條件為:電離方式電子轟擊(EI);電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子倍增器電壓1.34 kV;掃描范圍40～900 amu;全掃描模式。

1.2.2 細胞樣品制備及轉錄組測序顯微鏡下煙葉表面腺毛形態(tài)如圖1所示。采用冷刷法[19]分離腺毛,將在液氮中冷凍后的葉片置于傾斜的不銹鋼板上,用合適的毛刷刷洗,并將分離出的腺毛和刷洗后的葉片分別作為腺毛細胞樣品(Y1,Y2,Y3)與葉細胞樣品(C1,C2,C3)保存于液氮中。使用RNeasy Plant mini kit試劑盒的標準方案提取細胞樣品總RNA,通過甲酰胺凝膠電泳評估RNA的質量和數(shù)量。將所得RNA干冰保存送至南京派森諾基因科技有限公司進行轉錄組測序及基本數(shù)據(jù)分析。每個樣品的測序量為6.8～8.0 Gb。采用 DESeq 對腺毛細胞組和葉細胞組基因表達進行差異分析,根據(jù)倍性變化(Fold Change,FC)和P值篩選差異表達基因,篩選條件為:表達差異倍數(shù) |log2(FC)|>1 ,顯著性P<0.05。

1.2.3RT-qPCR分析使用PrimeScript TM 1st stand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成cDNA.,擴增體系和反應程序如下:反應體系為 20 μL,其中2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL,10 μmol的正反向引物各0.4 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8.2 μL。將配制的PCR反應溶液置于實對熒光定量PCR儀上進行PCR反應,反應程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。每個樣品重復3次。

2 結果與討論

2.1 煙葉表面糖酯GC-MS分析結果

煙葉表面浸提物衍生化后GC-MS總離子圖如圖2所示。由于標準譜庫中沒有相應的衍生物的標準MS圖,因此,通過解析MS碎片并與文獻[20-21]中報道的數(shù)據(jù)對照進行定性分析,確認了保留時間為36～47 min的一系列峰為煙草糖酯中主要成分(蔗糖四酯,STE)的特征峰。由圖2可知,煙葉樣品在該生長發(fā)育期具有蔗糖酯生物合成活性,可作為轉錄組測序和RT-qPCR分析的樣品。

2.2 差異表達基因篩選及其功能分析

2.2.1 測序結果統(tǒng)計學分析6個樣品的Q30堿基均達90%,采用 Cutadapt 去除 3′ 端帶接頭的序列,去除平均質量分數(shù)低于 Q20 的序列,通過對轉錄本數(shù)據(jù)的合并組裝,拼接后共得到 73 945 條序列,過濾后數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表1。

表1 過濾后序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Table 1 Statistics of sequence data after filtering

對腺毛細胞和葉細胞樣品的基因進行統(tǒng)計學分析,結果如圖3所示。由圖3a)可知,同類樣品間相似性高,符合后續(xù)研究要求。由圖3b)可知,腺毛細胞組織和葉細胞組織的基因表達水平表現(xiàn)出明顯差異。

圖3 腺毛細胞和葉細胞樣品基因統(tǒng)計學分析結果Fig.3 Gene statistical analysis of glandular hair cells and leaf cell samples

2.2.2 差異表達基因分析腺毛細胞和葉細胞之間差異表達基因如圖4所示。由圖4可知,葉細胞組和腺毛細胞組之間共有11 962個差異基因的表達顯示出差異,腺毛細胞中有5145 個(43%)上調表達基因、6817 個(57%)下調表達基因。

圖4 腺毛細胞和葉細胞之間差異表達基因Fig.4 Differentially expressed genes between glandular hair cellsand bundle sheath cells

2.2.3 功能分析為了解腺毛細胞基因的差異表達情況,對上調表達基因進行GO富集分析,根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫,所有具有GO分類信息的基因被分配到3個主要的類別共3797個條目中,包括生物學進程(2265個條目)、分子功能(1169個條目)和細胞成分(363個條目),每個類別富集最顯著的10個功能條目,結果如圖5所示。由圖5可知,分子功能主要包括氧化還原酶活性、四吡咯結合,細胞成分主要包括葉綠體、質體相關、類囊體膜等,這些基因與糖酯合成的相關度較小。生物學進程中可能與糖酯合成相關的條目主要有氧化還原過程(包含1915個基因)、碳水化合物代謝過程(包含967個基因)、代謝過程(10450個基因)、催化活性(8836個基因)等,后續(xù)將在這些基因中作進一步的篩選。

圖5 GO功能富集結果Fig.5 GO functional classification

根據(jù)KEGG pathway數(shù)據(jù)庫,可將生物學進程相關基因定位到122個具體的代謝通路,根據(jù)參與的代謝通路將基因分為3個分支,環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing),人類疾病(Human Diseases)和代謝(Metabolism)(見圖6)。由圖6可知,其中于糖酯合成相關的糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis,307個)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and Sucrose Metabolism,337個)、苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid Biosynthesis,480個)代謝通路被高度富集,且所包含基因較多,?；峭凤@著上調。同時還富集到與脂質代謝相關的脂肪酸延長(Fatty Acid Elongation,77個)、不飽和脂肪酸生物合成(Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids,54個)和甘油脂代謝(Glycerolipid Metabolism,166個)等通路。

圖6 KEGG 通路富集結果Fig.6 KEGG functional classification

2.3 糖酯合成基因篩選結果

相關研究[22-26]已鑒定了一類糖酯合成關鍵基因屬于?；D移酶家族(BAHD家族),在腺毛中特異性表達,可催化?；?CoA與蔗糖骨架上的羥基發(fā)生酯化反應,形成不同類型的糖酯。本文對比了煙草腺毛轉錄組和葉細胞轉錄組數(shù)據(jù),篩選出20個可能與糖酯合成相關的煙草腺毛上調表達基因(見表2)。將20個上調表達基因在紅花煙草參考基因組(Nicotiana Tabacum Reference Genome Ntab-TN90)數(shù)據(jù)庫中進行比對,剔除致病相關蛋白(gene50509)和脯氨酸富集蛋白(gene73405)等8個和煙草糖酯合成不相關的基因,發(fā)現(xiàn)剩余的12個高表達基因(gene53224、gene16194、gene63826、gene54958、gene19020、gene58818、gene65489、gene40415、gene37511、gene9182、gene42122和gene69978)與已報道BAHD家族基因[27]相似性較高,功能上與?；D移酶相關,推測其可能與煙草糖酯合成相關。

表2 20個上調差異表達基因Table 2 The 20 up-regulated DEGs

2.4 RT-qPCR驗證結果

為進一步驗證上文篩選得到的這12個差異表達基因的準確性,進行 RT-qPCR 分析,所用引物信息見表3。差異表達基因在腺毛細胞和葉細胞中的相對表達量結果見圖7,其中ns表示沒有差異;*表示P<0.05,差異顯著;** 表示P<0.01,差異極顯著;*** 表示P<0.001,差異極顯著。由圖7可知,12個差異表達基因中,除gene53224外的其他11個基因在腺毛細胞中的表達明顯上調,gene63826、gene16194和gene37511表達上調倍數(shù)較大,分別為195.79倍、166.23倍和132.65倍,這表明轉錄組測序數(shù)據(jù)基本可靠。

表3 差異表達基因RT-qPCR所用引物Table 3 Primers used for RT qPCR of differentially expressed genes

3 結論

本研究通過DESeq對煙草葉片的腺毛細胞和葉細胞進行轉錄組測序分析,共獲得73 945條序列,通過差異表達基因分析在腺毛細胞中篩選到5145 個上調表達基因、6817 個下調表達基因。上調表達基因主要包括生物過程、分子功能、細胞成分三大類,可將基因序列定位到122條代謝通路中,其中與糖酯合成相關的糖酵解/糖異生、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成被高度富集。結合其他植物腺毛轉錄組分析結果和紅花煙草參考基因組發(fā)現(xiàn)gene73405、gene68311、gene66072等12個上調表達基因可能與糖酯合成有關。RT-qPCR驗證分析進一步表明,這12個基因中除gene73405外的其他11個基因在腺毛細胞中的表達明顯上調,其中gene63826、gene16194和gene37511的表達分別上調195.79倍、166.23倍和132.65倍,轉錄組測序數(shù)據(jù)基本可靠。本文從煙草腺毛細胞轉錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘到一系列與煙草蔗糖四酯類化合物生物合成相關的酶基因,有助于從分子水平上解析煙草蔗糖四酯的生物合成途徑,為其進一步研究提供理論基礎。