大鼠BMG吸附MSCs修復骨缺損的可行性及有效性研究

盧志華 孫煜喆 許丁文

在臨床骨科研究中，關于骨缺損修復的研究較為困難，臨床對使用人工合成骨、自體骨移植、異體骨移植等方式進行骨缺損修復[1-3]。其中自體骨移植為修復骨缺損的最好方式，但自體骨來源獲取較為困難，可限制臨床自體骨移植的使用。臨床研究中，關于修復骨缺損的研究逐漸增多，多采用組織工程的方法構建新生骨組織，且種子細胞的選取和培養(yǎng)為骨組織工程學中的重要步驟，骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）既可修復關節(jié)軟骨面的缺損，也可修復包括軟骨下骨的關節(jié)軟骨缺損，是最佳理想的種子細胞的選擇[3-5]。臨床骨組織工程學的研究，載體選擇具有重要作用。同種異體骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）是異體骨經過脫鈣等一系列過程處理后的產物，含有在加工處理過程中未被破壞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白骨成形蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），而BMPs 是具有成骨誘導活性的一組生長因子，有利于骨的生長和再生[6-7]。基于此，本研究以MSCs 為種子細胞，以大鼠BMG 為載體，探討大鼠BMG 吸附MSCs 修復骨缺損的可行性及有效性，以期為臨床構建骨缺損的修復提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

54 只成年雄性美國斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝╯prague-dawley，SD）大鼠[浙江省中藥研究所有限公司，SYXK（浙）2023-0025]，無特定病原體級（specific pathogen free，SPF），購自實驗動物中心，SD 大鼠體質量為231～284 g，平均（257.25±12.87）g，飼養(yǎng)于溫度為22～23℃、濕度為60%的無菌環(huán)境中，光照為12 h 光照/黑暗周期，所有大鼠經過5 d 適應期后進行實驗。本研究獲得揚州市職業(yè)大學醫(yī)學院動物保護委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 BMG 的制備

取SD 大鼠，解剖分離四肢長骨，去除軟組織，用蒸餾水反復沖洗清除骨髓組織，依次進行脫鈣、脫脂、凍干和滅菌處理，并保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 MSCs 的分離與培養(yǎng)

取SD 大鼠，100 g/L 水合氯醛麻醉，采用75%乙醇浸泡20 min，無菌條件下取出兩側肱骨和股骨，刮除軟組織、骨膜和干骺端的軟骨部分，剪去骨骺端，骨髓用含10%胎牛血清的l-dmem 完全培養(yǎng)基洗滌，混合均勻后接種于細胞專用培養(yǎng)瓶，并加入10%的滅活FBS，放入含有5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞的融合度至80%～90%時，采用0.25%的胰蛋白酶對細胞進行消化處理，后實施傳代培育，按1∶3 的比例傳代擴增。

1.2.3 骨缺損模型的制備

100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉后（3 mL/kg），無菌暴露雙側橈骨中段按照長骨缺損臨界值制成5 mm 節(jié)段性缺損。

1.2.4 實驗分組

共有18 只大鼠骨缺損模型制備失敗，將制備成功36只大鼠分為每組18 只，對照組BMG 植入，實驗組MSCs經熒光標記后與BMG 共同培養(yǎng)植入。均不予以內外固定，逐層縫合傷口。

1.3 觀察指標

（1）分別于術后1、2、3 周、1、2 個月處死大鼠2 只，比較各組成骨效應。（2）觀察術后2個月取骨缺損區(qū)組織形態(tài)，采用熒光染料標記實驗組骨缺損區(qū)的骨痂，判斷骨痂來源。

1.3.1 骨缺損區(qū)放射學評分檢測

術后1、2、3 周、1、2 個月麻醉下行左側前肢正側位X 射線檢查。后根據X 射線片評分標準對X 射線進行評分[8]。0 分：無骨形成，可見骨連接線，缺損區(qū)未形成骨髓腔；2 分：新生骨占缺損區(qū)域的50%，可見部分骨折線，缺損區(qū)骨髓腔形成再通；4 分：新生骨占缺損區(qū)域的100%，未見骨折線，缺損區(qū)骨髓腔形成再通后腔內皮質骨形成。

1.3.2 骨缺損修復組織學評分檢測

術后1、2、3 周、1、2 個月截取大鼠修復部位標本，固定于40 g/L 多聚甲醛中，并進行脫水、包埋處理，制作5 張切片，切片厚度為0.5 μm，后進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE staining），光學顯微鏡下對組織的結構與細胞的形態(tài)進行觀察，并按照組織學評分標準對各組標本進行評分[9]。1 分：缺損區(qū)域受到新形成的結締組織（含有毛細血管、成纖維細胞、巨噬細胞、新形成的膠原纖維）填充，且結締組織較疏松；2 分：密集結締組織處，具有較多的大量分化細胞，且纖維有序排列；3 分：形成較多新骨，結締組織分化形成骨基質、骨單位；4 分：產生骨組織。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析處理。計量資料以（）表示，采用t檢驗；正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗與Levene 檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組成骨效應比較

對照組類骨樣組織形成量較實驗組同期標本明顯較少，且骨量與成熟程度均明顯低于實驗組。見表1、圖1。

圖1 術后2 個月檢測情況（×100）。對照組BMG 部位可見骨組織形成，但骨量與成熟程度較低，具有炎性細胞浸潤；實驗組毛細血管及結締組織增多，形成大量新骨。

表1 實驗組與對照組成骨效應比較

2.2 兩組熒光染料標記情況比較

通過熒光染料標記確認，脛骨骨缺損區(qū)的骨痂來源于MSCs。見圖2。

圖2 術后2 個月二脒基苯基吲哚（diamidinyl phenyl indole，DAPI）染色組織切片熒光染料標記情況（×150）。對照組脛骨骨缺損區(qū)的骨痂形成較少，缺損區(qū)邊緣帶有少量骨痂組織；實驗組脛骨骨缺損區(qū)形成大量骨痂。

2.3 兩組大鼠骨缺損區(qū)放射學評分比較

與對照組比較，實驗組1、2、3 周、1、2 個月放射學評分較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 實驗組與對照組大鼠骨缺損區(qū)放射學評分比較（分，）

表2 實驗組與對照組大鼠骨缺損區(qū)放射學評分比較（分，）

2.4 兩組大鼠骨缺損修復組織學評分比較

與對照組比較，實驗組1、2、3 周、1、2 個月組織學評分較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 實驗組與對照組大鼠骨缺損修復組織學評分比較（分，）

表3 實驗組與對照組大鼠骨缺損修復組織學評分比較（分，）

3 討論

本研究結果顯示，對照組類骨樣組織形成量較實驗組同期標本明顯較少，且骨量與成熟程度均明顯低于實驗組。HE 染色確認脛骨骨缺損區(qū)的骨痂來源于MSCs。成骨效應分析：在SD 大鼠的脛骨骨缺損區(qū)，植入MSCs 與BMG 的復合物，根據骨缺損區(qū)局部微環(huán)境的誘導因子對成骨進行調控，但成骨細胞的調控可受到局部血供的影響，使細胞的分化，骨缺損區(qū)具有良好的血供可分化為成骨細胞，血供不足可分化為軟骨細胞[10]。本研究結果顯示，MSCs 與BMG 復合組的骨缺損修復能力高于單純BMG 組，且單純BMG 組成骨能力較好。大鼠進行移植骨缺損后，未發(fā)現(xiàn)異型、炎性細胞，表明該方式不會造成瘤變、排斥反應，安全性較強。

而單純BMG 具有具有一定成骨能力，分析原因在于：BMG 中含有較多BMPs，且未受到破壞，BMPs 為生長因子，具有較強的誘導活性，可誘導血管周圍未分化的MSCs 成骨分化[11-12]。BMPs 可使MSCs 的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性增加，并增強間充質細胞活性，使細胞外基質鈣鹽沉著[13-15]。MSCs成骨細胞分化時，可抑制脂肪細胞的分化，使骨形成、再生速度加快[16-17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠在3 周、1 個月時在少量溶解吸收BMG 區(qū)域形成類骨樣組織，但實驗組大鼠在2 周后BMG 區(qū)域出現(xiàn)類骨樣組織，該結果表明，實驗組的成骨效果優(yōu)于對照組。在2 個月時，對照組BMG部分出現(xiàn)骨組織形，但與實驗組比較，具有較少骨量，且成熟度較晚，為早期骨組織的形成表現(xiàn)。原因可能為，BMPs 通過局部間充質細胞誘導成骨細胞分化，但成骨細胞的分化數(shù)量低于骨髓間充質干細胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rMSCs），故導致對照組低于實驗組同一時間成骨量，延長臨床骨質生成時間。

本研究選用BMG 作為rMSCs 載體，原因為BMG 可運輸機體內種子細胞，使其發(fā)生黏附且BMG 可促使毛細血管的生長，使載體基質溶入受體骨基質，BMG 可使受體細胞、種子細胞共同作用，形成骨痂，在臨床研究中具有重要作用。

綜上所述，大鼠BMG 吸附MSCs 修復骨缺損具有可行性及有效性。