枇杷酵素發(fā)酵過程生物學(xué)特性和主要功效酶活性研究

陳洲琴，張祝蘭*，程 賢，林仙菊，楊煌建，嚴(yán)雪浪，朱愛明，連云陽*

[1.福建省微生物研究所/福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350007;2.仙游縣清風(fēng)生態(tài)農(nóng)莊有限公司, 福建 莆田 351200]

枇杷是福建省莆田市四大名果之一，果實(shí)營養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有清熱、潤肺等作用，具有較高的營養(yǎng)和食用價(jià)值。枇杷成熟期集中在初夏高溫、多濕季節(jié)，應(yīng)季產(chǎn)量大，但保質(zhì)期短、易腐爛變質(zhì)，不利于貯藏和長途運(yùn)輸[1-3]，因此枇杷短時(shí)集中上市和滯銷問題備受關(guān)注。目前枇杷果實(shí)除鮮食外，相關(guān)的加工產(chǎn)品主要有枇杷汁、枇杷罐頭、枇杷果醬及枇杷酒等[4-6]。近年來，隨著發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)展，水果酵素也逐漸走進(jìn)了人們的生活[7-9]，將枇杷發(fā)酵成枇杷酵素產(chǎn)品也是解決枇杷產(chǎn)品銷售困難的一個(gè)重要手段。對(duì)于水果酵素的研究大多集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化、生物活性的探究及代謝物質(zhì)的分析等研究[10-16]，目前對(duì)于枇杷酵素的報(bào)道較少，有對(duì)其抗氧化活性功能開展研究[17]，但對(duì)于枇杷酵素自然發(fā)酵過程中微生物群落、氨基酸等代謝產(chǎn)物和主要功效酶等變化規(guī)律的全面評(píng)價(jià)，以及其發(fā)酵過程的監(jiān)控研究尚未系統(tǒng)開展。

本研究以枇杷為原料，探究發(fā)酵時(shí)間對(duì)枇杷酵素生物學(xué)特性及主要功效酶活的影響，為構(gòu)建枇杷酵素的綜合評(píng)價(jià)體系以及枇杷的高價(jià)值化利用和精深加工提供參考，為促進(jìn)當(dāng)?shù)靥厣庸ぜ案碑a(chǎn)物產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枇杷由仙游清風(fēng)生態(tài)農(nóng)莊有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1試驗(yàn)儀器 LC-2030高效液相色譜儀：日本島津公司；Allegra X-15R離心機(jī)：德國Beckman公司；752紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；L-8900型氨基酸分析儀：日本日立公司；DKZ-2B 型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；S20K酸度計(jì)：梅特勒-托利多公司。

1.2.2主要試劑 紅糖(食品級(jí))：廣西馬山南華糖業(yè)有限責(zé)任公司；YPD培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乳酸、乳酸鈉、β-葡聚糖、無水碳酸鈉、乙酸、乙酸鈉、三氯乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉等(均為分析純)：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；DNS試劑、SOD酶活性試劑盒、脂肪酶活性試劑盒、福林酚溶液、酚酞：生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇(色譜純)、磷酸(色譜純)、檸檬酸鈉(色譜純)、氫氧化鈉(色譜純)、鹽酸(色譜純)、酪蛋白和L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：默克密理博公司；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院；沒食子酸、葡萄糖、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 枇杷酵素的制備無菌水清洗枇杷2～3次，于潔凈處晾干，切片、去除核，按枇杷∶糖∶無菌水為1∶3∶10(質(zhì)量比)配制，28℃左右自然發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間140 d。定期取樣，將樣品離心后的上清液保存于-80℃超低溫冰箱中待測。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1有效活菌數(shù)的測定 取發(fā)酵1、5、20、35、50、65、80、95、110、125和140 d的樣品測定有效活菌數(shù)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，分別用YPD培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行選擇培養(yǎng)，測定酵母菌和細(xì)菌菌落數(shù)。菌落計(jì)數(shù)方法測定參照GB4789.2-2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》。

1.4.2pH值和總酸的測定 取發(fā)酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的樣品測定pH值和總酸。使用精密pH計(jì)測定酵素樣品的pH值；總酸含量的測定方法參照GB12456-2021《食品中總酸的測定》。

1.4.3有機(jī)酸含量的測定 取發(fā)酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的樣品測定有機(jī)酸含量。測試液以去離子水稀釋10倍后，0.22 μm微孔濾膜過濾后用HPLC測定酵素中的有機(jī)酸含量。色譜條件：色譜柱為Kromasil100-5-C18(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-甲醇(97.5%～2.5%)比例的流動(dòng)相，流速0.6 mL·min-1，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長210 nm；結(jié)果以乳酸質(zhì)量濃度g·L-1計(jì)。

1.4.4總酚含量的測定 總酚含量測定參照GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：蒸餾水配制0.1 mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；精確量取系列沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 mL)，分別加入10%福林-酚試劑1 mL及7.5%的Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)1 h后，在765 nm波長下測定OD值，以測定的OD765值為橫坐標(biāo)，沒食子酸各溶液的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取發(fā)酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的樣品測總酚含量，測試液以去離子水稀釋10倍后，量取樣品0.25 mL，加入福林酚試劑1 mL及7.5% Na2CO3溶液2 mL，蒸餾水定容至10 mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)1 h，測定的OD765值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣品中總多酚含量。

1.4.5氨基酸含量的測定 取發(fā)酵35、80和140 d的發(fā)酵液測定氨基酸含量。氨基酸含量的測定方法參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》。

1.4.6主要功效酶活力測定 取發(fā)酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的發(fā)酵液測定主要功效酶活力。蛋白酶活力測定參照CB/T 28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》；脂肪酶活力測定參照脂肪酶試劑盒的操作說明；β-葡聚糖酶測定參照NY/T 911-2020《飼料添加劑β-葡聚糖酶活力的測定 分光光度法》；SOD酶活力測定參照SOD酶試劑盒的操作說明。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效活菌數(shù)

由表1可知，枇杷酵素的有效活菌數(shù)在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，在發(fā)酵5 d后，有效活菌數(shù)快速上升達(dá)到109數(shù)量級(jí)，發(fā)酵140 d有效活菌數(shù)保持在108數(shù)量級(jí)上，說明枇杷酵素菌群生長狀態(tài)良好，具有穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境。

表1 枇杷酵素發(fā)酵過程中有效活菌數(shù)的變化

2.2 pH值與總酸

由圖1可知，隨著發(fā)酵進(jìn)程，pH值在20 d內(nèi)由4.8下降至3.5，后期一直穩(wěn)定于3.5左右；總酸總體呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)，總酸在125 d達(dá)到最大值12.5 g·L-1，發(fā)酵至140 d后總酸含量有所下降。

圖1 枇杷酵素發(fā)酵過程中pH、總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid content in the fermentation process of loquat ferments

2.3 有機(jī)酸含量

由圖2可知，枇杷酵素的有機(jī)酸含量在1～20 d呈快速上升趨勢(shì)，有機(jī)酸含量增加至6.26 g·L-1，20～140 d有機(jī)酸含量趨于穩(wěn)定。

圖2 枇杷酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化Fig.2 Changes of the organic acid content in the fermentation process of loquat ferments

2.4 總酚含量

總酚測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0049x+0.1025，R2=0.9978線性關(guān)系良好。枇杷酵素發(fā)酵過程中總酚含量呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)，在65 d總酚含量達(dá)到0.9 mg· mL-1，到65～140 d后呈下降趨勢(shì)。

圖3 總酚測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve for the determination of total phenols

圖4 枇杷酵素發(fā)酵過程中總酚變化Fig.4 Changes of total phenols in the fermentation process of loquat ferments

2.5 氨基酸含量

由表2可知，枇杷酵素含有17種氨基酸，其中含量較高的氨基酸分別為天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸。隨著發(fā)酵時(shí)間增加，各氨基酸含量在不同階段出現(xiàn)波動(dòng)變化，總氨基酸含量與必需氨基酸含量逐漸提高，說明一定時(shí)間的發(fā)酵能提高酵素中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，且提高程度較明顯。

表2 枇杷酵素發(fā)酵過程中氨基酸含量的測定結(jié)果

2.6 主要功效酶的酶活力

由圖5可知，枇杷酵素自然發(fā)酵過程中不同功效酶酶活力出現(xiàn)波動(dòng)性變化，其中蛋白酶活力在1～35 d呈逐漸上升趨勢(shì)，在發(fā)酵35 d時(shí)其酶活力最高達(dá)15.14 U·mL-1，在發(fā)酵35 ～65 d呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，65～140 d酸性蛋白酶活性趨于穩(wěn)定；SOD酶活力在1～65 d階段呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵65 d時(shí)其酶活力最高達(dá)42.0 U·mL-1，在發(fā)酵65～140 d呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)；β-葡聚糖酶活性在1～20 d呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵20 d時(shí)其酶活力最高達(dá)4.52 U·mL-1，在發(fā)酵20～140 d β-葡聚糖酶活性趨于穩(wěn)定；脂肪酶活力在1～5 d呈現(xiàn)較較快的上升趨勢(shì)，并在5 d取得最大值0.12 U·mL-1，然而隨著發(fā)酵時(shí)間延長，發(fā)酵液中脂肪酶活性逐漸降低。

圖5 枇杷酵素發(fā)酵過中主要功效酶的變化Fig.5 Changes of the main efficacy enzymes in the fermentation process of loquat ferments

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)枇杷酵素發(fā)酵過程中生物學(xué)特性指標(biāo)(有效活菌數(shù)、pH值、總酸、總酚、氨基酸)及功效酶活性(SOD、蛋白酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵進(jìn)程，發(fā)酵液中有效活菌數(shù)保持在108數(shù)量級(jí)上，有效維持穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境，這對(duì)發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的變化有著重要影響作用。發(fā)酵液的 pH 值先降低后維持穩(wěn)定在3.5，而總酸含量不斷增加至6.26 g·L-1后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵前期總酸含量的快速上升是由于自然發(fā)酵過程乳酸菌大量繁殖、代謝活躍，利用發(fā)酵液的糖作為碳源發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、乳酸等有機(jī)酸，致使發(fā)酵液總酸含量增加、pH值降低[18]。而發(fā)酵后期體系中有機(jī)酸種類及含量的增加，可抑制部分有害菌生長，pH 值和總酸含量變化均趨于平緩，推測是因?yàn)榘l(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)基本被消耗殆盡，微生物代謝緩慢，僅將有機(jī)酸等替代碳源維持生命活動(dòng)，故總酸含量降低[16]?？偡雍吭?～65 d呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，到65～140 d后出緩慢下降趨勢(shì)。主要發(fā)揮抗氧化性能的物質(zhì)是多酚類，大分子物質(zhì)可以在微生物的發(fā)酵作用下，轉(zhuǎn)變成小分子酚類。枇杷酵素含有17種氨基酸，含量較高的氨基酸主要是天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸。隨著發(fā)酵時(shí)間增加，各氨基酸含量在不同階段出現(xiàn)化，總氨基酸含量與必需氨基酸含量逐漸提高，說明一定時(shí)間的發(fā)酵能提高酵素中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，且提高程度較明顯。氨基酸是人體不可或缺的重要物質(zhì)之一，不僅可以為身體提供能量還可以提高免疫力，具有很高的生物活性[19]。枇杷酵素中不同功效酶的活性變化規(guī)律不同，酸性蛋白酶活力在1～35 d呈逐漸上升趨勢(shì)，在發(fā)酵35 d時(shí)其最高酶活力至15.14 U·mL-1，在發(fā)酵35 ～65 d呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，65～140 d酸性蛋白酶活性趨于穩(wěn)定。SOD酶活力在1～65 d階段呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵65 d時(shí)其酶活力最高達(dá)42.0 U·mL-1，在發(fā)酵65～140 d呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。脂肪酶在1～5 d呈現(xiàn)較較快的上升趨勢(shì)，發(fā)酵5 d達(dá)到最大值為0.12 U·mL-1，隨著發(fā)酵時(shí)間延長發(fā)酵液中脂肪酶活性逐漸降低。脂肪酶活力較低，這可能與枇杷中脂肪含量較少有關(guān)，該結(jié)果與報(bào)道的水果酵素等一致[20]，由于酵素初期微生物迅速增長，使得體系pH下降至3.5，整體呈酸性，而脂肪酶的最適pH 在中性或堿性范圍內(nèi)，也可能是發(fā)酵過程中其活性較低的原因之一。β-葡聚糖酶活性在1～20 d呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵20 d時(shí)其酶活力最高達(dá)4.52 U·mL-1，在發(fā)酵20 ～140 d β-葡聚糖酶活性趨于穩(wěn)定。

枇杷酵素含有多種的功效酶，其中β-葡聚糖酶是一類重要的水解酶，具有抑菌作用且對(duì)對(duì)植物抗病防御體系中起著重要作用[21-24]。枇杷酵素中含有豐富的β-葡聚糖酶，使用酵素代替部分農(nóng)藥為解決使用化學(xué)農(nóng)藥殘留的問題提供一個(gè)新思路。酵素在建立綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中有著廣闊的應(yīng)用前景，進(jìn)一步研究酵素中β-葡聚糖酶的功效作用以及開發(fā)種類更多、酶活力更高、穩(wěn)定性和適用性更好的酵素酶具有重要意義。