氮磷添加下典型溫帶、亞熱帶森林土壤氮循環(huán)功能基因豐度和微生物群落屬性數(shù)據(jù)集

賈彥茹，唐玉倩*，張心昱，于貴瑞，王輝民，陳伏生，田大栓，張雷明

1.中國地質(zhì)大學(xué)，地理與信息工程學(xué)院，區(qū)域生態(tài)與環(huán)境變化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074

2.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

3.中國科學(xué)院大學(xué)，資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100190

4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，林學(xué)院，南昌 330029

引 言

中國東部森林生態(tài)系統(tǒng)是大氣氮沉降最嚴(yán)重的區(qū)域之一。大氣氮沉降能夠造成土壤氮含量變化、酸化、有機(jī)碳含量變化和磷限制[1-2]。氮和磷是調(diào)節(jié)植物和土壤微生物生長及活性的關(guān)鍵限制因素[3-4]。但不同于土壤氮能夠通過氮沉降和生物固氮積累，土壤磷元素的增加速率遠(yuǎn)小于氮[5]。在大氣氮沉降增加背景下，磷限制在森林生態(tài)系統(tǒng)會進(jìn)一步加劇。磷限制一方面會影響植物生長、限制生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和減少生物多樣性[6]；另一方面，全球變暖影響下土壤有機(jī)質(zhì)分解加速，土壤氮、磷有效性增加，這將進(jìn)一步影響土壤微生物及微生物驅(qū)動的土壤養(yǎng)分循環(huán)[3]。有關(guān)氮磷添加對森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物影響的數(shù)據(jù)集可以為養(yǎng)分循環(huán)機(jī)制研究、森林管理和環(huán)境科學(xué)研究提供數(shù)據(jù)和理論支持。

溫帶和亞熱帶森林是中國東部森林中具有典型植被和土壤養(yǎng)分狀況差異的地區(qū)。通常認(rèn)為，氮沉降在亞熱帶森林更嚴(yán)重[7]，土壤相對富氮缺磷，而溫帶森林氮沉降相對較輕，土壤相對亞熱帶森林富磷缺氮[8-9]。養(yǎng)分狀況的差異導(dǎo)致氮循環(huán)微生物對氮和磷添加有不同的響應(yīng)[10-15]?；跍貛Ш蛠啛釒珠L期氮磷添加野外聯(lián)網(wǎng)控制實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開展了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)調(diào)查和氮循環(huán)過程研究，但仍缺乏系統(tǒng)的氮循環(huán)功能微生物屬性的數(shù)據(jù)集，這將嚴(yán)重影響我們對森林土壤氮循環(huán)驅(qū)動機(jī)制及其對全球變化響應(yīng)機(jī)制的深入理解。

氮循環(huán)是陸地生態(tài)系統(tǒng)最重要的養(yǎng)分循環(huán)之一，直接影響生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)和功能的穩(wěn)定性[16]。土壤氮循環(huán)是由微生物驅(qū)動的相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)過程，主要包括生物固氮、礦化、硝化和反硝化。這些過程由一系列氮循環(huán)功能基因編碼的酶催化[17-18]。固氮微生物可以將大氣中的N2固定成NH3，這個過程是由nifH基因編碼的固氮酶催化[17]。幾丁質(zhì)是含氮量最豐富的天然大分子之一，其分解是由chiA基因編碼的幾丁質(zhì)酶催化[19]。硝化過程通常認(rèn)為包括兩個過程，即氨氧化和亞硝酸氧化[20]。氨氧化過程是自養(yǎng)硝化過程的限速步驟，其涉及的功能基因是氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌的amoA基因[20]。反硝化過程涉及一系列連續(xù)異化還原過程，逐步將NO3-還原為N2[21]。NO3-通過narG和napA基因編碼的硝酸鹽還原酶還原為NO2-[22]。NO2-主要通過nirK或nirS基因編碼的亞硝酸鹽還原酶轉(zhuǎn)化為NO 或N2O[17]。NO 通過氧化氮還原酶轉(zhuǎn)化為N2O。N2O 通過nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶轉(zhuǎn)化為N2[23]。靶向氮循環(huán)功能基因能夠?yàn)榈h(huán)的研究提供更直接的證據(jù)。

土壤環(huán)境和養(yǎng)分含量是影響氮循環(huán)微生物群落和活性的重要因素[17,24-25]。森林生態(tài)系統(tǒng)中，土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分含量沿土壤剖面差異顯著。相對于亞熱帶森林，溫帶森林土壤質(zhì)地稠密、滲透性弱，溶解性養(yǎng)分難以從土壤表層滲透到下層，導(dǎo)致下層土壤養(yǎng)分含量遠(yuǎn)低于表層[18]。因此，氮循環(huán)微生物在表層土壤的分布可能不同于下層土壤。同時，受不同氣候和植被狀況的影響，氮循環(huán)微生物沿土壤剖面的分布模式在亞熱帶和溫帶森林也是不同的。

本數(shù)據(jù)集測定和整理了中國東部典型溫帶和亞熱帶森林土壤氮循環(huán)功能基因的豐度和群落屬性，涉及氮磷添加聯(lián)網(wǎng)控制實(shí)驗(yàn)樣地和無養(yǎng)分添加土壤垂直剖面的樣品。具體數(shù)據(jù)指標(biāo)包括氮循環(huán)功能基因豐度、群落多樣性和結(jié)構(gòu)以及微生物活性。本數(shù)據(jù)集的創(chuàng)建和共享將為全球變化氮沉降和磷增加背景下森林土壤氮循環(huán)的微生物驅(qū)動機(jī)制及其模擬研究提供支持，為森林生態(tài)系統(tǒng)溫室氣體N2O的排放、氮素淋失和養(yǎng)分管理提供數(shù)據(jù)和依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)采集和處理方法

本數(shù)據(jù)集涉及3 個森林樣地，即長白山、千煙洲和鼎湖山，分別代表溫帶原生針闊混交林、亞熱帶杉木人工林和亞熱帶次生常綠闊葉混松林3 種典型森林類型。采樣點(diǎn)基本信息、氮磷添加處理及土壤樣品采集過程見表1。所有氮磷添加樣地設(shè)置為完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。鼎湖山、長白山和千煙洲的最高氮添加量相同，均為100 kg N hm-2yr-1，旨在模擬未來氮沉降持續(xù)增加的可能影響。長白山和鼎湖山的磷添加量（100 kg P hm-2yr-1）高于千煙洲（50 kg P hm-2yr-1），但基于之前的研究結(jié)果，兩個水平磷添加均顯著改變了土壤理化性質(zhì)和微生物豐度[11-12,25]。同時，氮磷添加樣品采集時，長白山、千煙洲和鼎湖山三個樣地均已施肥3 年，且三地的施肥樣地采樣時間均為距上次施肥30 d 左右。因此認(rèn)為三地的氮磷添加設(shè)置具有可比性。

土壤樣品過2 mm 篩后分小份保存。其中一份樣品放于4 ℃，用于測定土壤含水量、pH、土壤NO3-、NH4+、速效磷和溶解性有機(jī)碳含量；第二份樣品烘干后研磨，過0.25 mm 篩，用于測定總有機(jī)碳、總氮和總磷含量；第三份樣品保存于-80 ℃，用于DNA 提取及后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)；第四份存放于4 ℃，并盡快用于測定微生物活性。

1.1 土壤理化性質(zhì)測定

每個樣品重復(fù)三次測定土壤理化性質(zhì)。土壤pH 值使用玻璃電極測定體積比為2:5 的土:水懸浮液。土壤含水量用烘干法測定。用2 mol/L KCl 溶解提取NO3-和NH4+，并且用0.025 mol/L HCl-0.03 mol/L HN4F 溶液提取速效磷，然后用連續(xù)流動自動分析儀(Bran Lubbe, AA3, Germany)測量NO3-、NH4+和速效磷的濃度[26]。使用總有機(jī)碳分析儀(Liqui TOC II, Elementar, Germany)測定溶解性有機(jī)碳濃度?？偺己涂偟臐舛仁褂肅N 分析儀(Vario Max, Elementar, Germany)測定。土壤總磷使用H2SO4和HClO4消解，在700 nm 處用自動分光光度儀測定。土壤N2O 排放的測定采用靜態(tài)箱法。氣體采集時間為當(dāng)日8:00–11:00，在40 min 時段內(nèi)，用100 mL 注射器在0, 10, 20, 30, 40 min 時分別抽取1次氣體樣品，每個樣方共采集5 個氣樣，并于采集后24 h 內(nèi)完成濃度測定。施肥一周后連續(xù)采樣。

1.2 氮循環(huán)功能基因豐度測定

采用Power Soil DNA Isolation Kit 試劑盒(Mo Bio, Carlsbad, CA, USA)進(jìn)行土壤總DNA 提取，所提取的DNA 用微量紫外分光光度計(Nanodrop Technologies, USA)檢測其濃度和純度。DNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩＠肧YBR Green Premix (TaKaRa Bio Inc.)熒光試劑，通過Eco Real-Time PCR System(Illumina)對土壤氮循環(huán)功能基因進(jìn)行定量分析。氮循環(huán)各過程功能基因nifH、chiA、氨氧化古菌amoA、氨氧化細(xì)菌amoA、qnorB、narG、nirK、nirS、nosZ擴(kuò)增特異引物和退火溫度等信息見表2。

表2 氮循環(huán)各功能基因的功能和PCR 擴(kuò)增引物信息Table 2 Functions and primer pairs for nitrogen-cycling functional genes used in PCR

1.3 氮循環(huán)功能基因高通量測序

根據(jù)表2 對功能基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。利用QIAEX II?Gel Extraction Kit (Qiagen)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收并測定濃度，然后將PCR 產(chǎn)物混合，使各樣品用于高通量測序的DNA 濃度一致。高通量測序委托北京新科開源基因科技有限公司完成。對測序的初步數(shù)據(jù)通過next generation sequencing toolkit (NGS version 2.3.1)進(jìn)行過濾[36]。然后對干凈的序列進(jìn)行注釋，除chiA注釋信息來自NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)外，其他功能基因注釋信息來自FunGene 數(shù)據(jù)庫[37]。用Vsearch 軟件在97%相似度劃分分類單元（OTU）[38]，并舍掉數(shù)目少于2 個的OTU。通過Mothur 計算各功能基因的香濃多樣性指數(shù)[39]。所有測序序列上傳至NCBI Sequence Read Archive (SRA)數(shù)據(jù)庫。長白山施肥樣地氨氧化細(xì)菌amoA、氨氧化古菌amoA、nirS、nirK、nifH和chiA對應(yīng)的序列號分別為SRR5621828、SRR5621829、SRR5621826、SRR5621827、SRR5621833、SRR5621832；千煙洲施肥樣地氨氧化古菌amoA和nirK對應(yīng)的序列號為SRR3342862-SRR3342865和SRR3310928-SRR3310931；鼎湖山施肥樣地氨氧化細(xì)菌amoA、氨氧化古菌amoA、nirS、nirK、nifH和chiA對應(yīng)的序列號分別為SRR5621830、SRR5621831、SRR5621824、SRR5621825、SRR5621835、SRR5621834；土壤剖面樣品的chiA、nifH、氨氧化古菌amoA和nirS基因?qū)?yīng)的序列號分別為SRR5533727、SRR5533729、SRR5533730、SRR5533726。

1.4 氮循環(huán)微生物潛在活性測定

土壤凈硝化速率利用室內(nèi)培養(yǎng)法測定[40]。鮮土10 g 置于100 mL 的聚乙烯瓶中，在20 °C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。通過最終和最初單位干土中NO3-的變化量計算土壤的凈硝化速率，單位為μg NO3--N g-1soil d-1。

硝化潛勢的測定采用懸漿培養(yǎng)法[41]。鮮土2.5 g 中加入35 mL 含1 mmol/L (NH4)2SO4的培養(yǎng)液，并置于30 ℃，200 rpm 震蕩，黑暗中培養(yǎng)48 h。每隔12 h 開瓶通風(fēng)20 min 保證有氧環(huán)境。在培養(yǎng)的第20 min、48 h 分別取5 mL 懸漿用于測定NO2-、NO3-含量。硝化潛勢用μg N-(NO3-+NO2-)h-1g-1表示。

反硝化潛勢的測定采用乙炔抑制法[42-43]。鮮土4 g 置于150 mL 含培養(yǎng)液（含KNO3：50 μg N g-1干土，葡萄糖：0.5 mg C g-1干土和谷氨酸鈉：0.5 mg C g-1干土）的厭氧瓶中，震蕩混勻。將厭氧瓶抽真空后持續(xù)通入N2-C2H2（90:10 體積比）的混合氣，以制造厭氧環(huán)境并抑制N2O 的還原。分別在培養(yǎng)的初始時刻和培養(yǎng)后2 h 抽取氣體樣品，利用氣相色譜儀(Agilent 7890A, USA)測定N2O 濃度。反硝化潛勢用ng N-N2O h-1g-1干土表示。

固氮微生物活性的測定采用乙炔還原法[44]。鮮土10 g 置于120 mL 血清瓶中，滴加葡萄糖溶液，使土壤中的C 含量保持在1 mg C g-1土壤，密封后混勻。抽取10 %瓶中空氣后注入同體積的乙炔。在28 °C 恒溫黑暗培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，抽取50 μL 氣體樣品，用氣相色譜儀(Agilent, 7890A, USA)測定培養(yǎng)瓶中乙烯（C2H4）氣體濃度。固氮酶活性單位用乙炔還原速率表示，單位nmol C2H4h-1g-1。

有機(jī)氮分解潛勢采用MUB 底物結(jié)合微孔板熒光法測定β-1,4-乙?；?葡糖胺糖苷酶（β-1,4-Nacetyl-glucosaminidase, NAG）活性[45]。具體操作為：取1 g 鮮土，用醋酸緩沖液充分混勻，制備土壤懸浮液，吸取200 μL 土壤懸浮液和50 μL 4-甲基傘形酮酰-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷（4-MUB-Nacetyl-β-D-glucosaminide）底物于96 孔板。20 °C 黑暗中培養(yǎng)4 h，加入10 μL 1 mol/L 的NaOH 終止反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是4-甲基傘型酮(4-MUB, 4-methylumbelliferyl)，在365 nm 波長處激發(fā)，450 nm 波長處測定。NAG 活性的單位是nmol h-1g-1。

2 數(shù)據(jù)樣本描述

本數(shù)據(jù)集集合了東部典型溫帶（長白山）和亞熱帶森林（鼎湖山和千煙洲）聯(lián)網(wǎng)控制實(shí)驗(yàn)氮磷添加樣地和無氮磷添加樣地土壤垂直剖面中氮循環(huán)功能基因豐度、群落多樣性和組成、氮循環(huán)微生物潛在活性和土壤理化性質(zhì)的數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)集由2 個Excel 文件組成：Excel 1 為氮循環(huán)微生物屬性相關(guān)數(shù)據(jù)，Excel 2 為土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)。Excel 1 由7 個Sheet 組成，具體內(nèi)容及字段含義見表3。

表3 本數(shù)據(jù)集Excel 1 內(nèi)容及字段含義Table 3 Data content and descriptions in Excel 1

Excel 2 為土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)，由2 個Sheet 組成，具體內(nèi)容及字段含義見表4。Excel 中的空白項為未測定數(shù)據(jù)。

表4 本數(shù)據(jù)集Excel 2 內(nèi)容及字段含義Table 4 Data content and descriptions in Excel 2

3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和評估

3.1 季節(jié)差異、采樣和樣品測試誤差控制

長白山溫帶森林和鼎湖山亞熱帶森林采樣時間為8 月，為植物生長季；千煙洲亞熱帶森林土壤采樣時間為4 月，盡管季節(jié)上存在差異，但是也基本進(jìn)入了亞熱帶的生長季。因此，所采樣品能夠代表氮磷添加影響下典型溫帶和亞熱帶森林土壤。

所有土壤樣品的采集均采用五點(diǎn)采樣法，以保證樣品的均勻性和代表性。同時，采樣均在無降水天氣晴好的時間進(jìn)行。此外，除測序外，土壤理化性質(zhì)和微生物屬性的測定均在中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，以降低測試誤差。

3.2 功能基因豐度數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

氮循環(huán)功能基因豐度測定時，陰性對照、樣本和標(biāo)準(zhǔn)品一式三份同時擴(kuò)增，優(yōu)化擴(kuò)增條件確保擴(kuò)增效率達(dá)到90%–110%，R2值達(dá)到0.996–0.999。定量PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過溶解曲線估計，擴(kuò)增片段的大小使用瓊脂糖凝膠電泳法確定。

3.3 功能基因高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

原始序列通過Next Generation Sequencing toolkit (NGS version 2.3.1) 進(jìn)行質(zhì)量篩選[36]，其中短于200 bp 的序列、長于6 bp 的均聚物、包括模糊堿基或者超過50 %的低質(zhì)量堿基數(shù)（average Q value<15）的片段被移除。為獲得高質(zhì)量的測序序列，通過Mothur 軟件移除條形碼和錯誤序列，通過UCHIME 算法移除嵌合體序列，通過pre.cluster command (diffs=2)對序列進(jìn)行降噪處理。

3.4 氣體樣本N2O 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

氣體N2O 的采集采用施肥后一周連續(xù)采樣，減少N2O 通量日波動的影響。樣本采集后，在一天內(nèi)完成樣本濃度測定，避免其他氣體的污染。每個樣方重復(fù)測量5 次，減少測量誤差。

4 數(shù)據(jù)價值

目前已有數(shù)據(jù)集提供中國森林生態(tài)系統(tǒng)的土壤性質(zhì)、土壤微生物分類和大氣氮沉降數(shù)據(jù)。然而還沒有基于中國典型森林生態(tài)系統(tǒng)氮磷添加聯(lián)網(wǎng)實(shí)驗(yàn)平臺的氮循環(huán)功能微生物屬性數(shù)據(jù)集，也沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)集展示氮循環(huán)微生物在土壤剖面的分布模式。本數(shù)據(jù)集選取中國東部具有代表性的典型森林生態(tài)系統(tǒng)，以溫帶針闊混交林，亞熱帶杉木人工林和亞熱帶次生林作為研究對象，旨在對比不同森林類型中土壤氮循環(huán)微生物的不同分布模式，及其在全球變化氮沉降和磷添加影響下的不同響應(yīng)。本數(shù)據(jù)集既可以與之前發(fā)表的溫帶、亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)碳水通量[46-48]和土壤理化性質(zhì)[49]等數(shù)據(jù)協(xié)同使用，也對缺乏的溫帶、亞熱帶森林土壤微生物數(shù)據(jù)做了補(bǔ)充。

本數(shù)據(jù)集的各項指標(biāo)測定均基于全國聯(lián)網(wǎng)氮磷添加實(shí)驗(yàn)平臺，保證了各臺站之間數(shù)據(jù)的有效性和可比性，能夠?yàn)闇貛Ш蛠啛釒值h(huán)過程對全球變化氮沉降和磷添加的響應(yīng)機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。鑒于功能微生物在調(diào)節(jié)氮循環(huán)過程中的重要生態(tài)作用，本數(shù)據(jù)集提供的氮循環(huán)功能基因豐度和氮循環(huán)微生物活性等數(shù)據(jù)有助于深入理解森林生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的微生物驅(qū)動機(jī)制，為研究陸地生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分周轉(zhuǎn)和溫室氣體排放機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐，為降低森林土壤養(yǎng)分損失的管理措施提供數(shù)據(jù)和依據(jù)。

致 謝

感謝中國生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡(luò)（CERN）長白山、千煙洲和鼎湖山野外臺站和樣地負(fù)責(zé)老師以及樣地維護(hù)人員對本項目取樣和指標(biāo)測定提供的便利和幫助。

數(shù)據(jù)作者分工職責(zé)

賈彥茹（1998—），女，河南濮陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)橥寥牢⑸锷鷳B(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：數(shù)據(jù)匯編、整理和論文撰寫。

唐玉倩（1985—），女，山東煙臺人，博士，研究方向微生物生態(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：數(shù)據(jù)測定、匯編、整理和論文撰寫。

張心昱（1973—），女，遼寧桓仁人，研究員，研究方向?yàn)榈厍颦h(huán)境化學(xué)。主要承擔(dān)工作：鼎湖山站數(shù)據(jù)檢測和技術(shù)指導(dǎo)；數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，技術(shù)指導(dǎo)和論文修改。

于貴瑞（1959—），男，遼寧大連人，研究員，研究方向生態(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：項目統(tǒng)籌和論文修改。

王輝民（1967—），男，吉林長春人，研究員，研究方向生態(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：千煙洲站數(shù)據(jù)檢測和技術(shù)指導(dǎo)。

陳伏生（1973—），男，江西永豐人，教授，研究方向生態(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：千煙洲站杉木林施肥樣地建立和維護(hù)，數(shù)據(jù)檢測和技術(shù)指導(dǎo)。

田大栓（1985—），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，副研究員，研究方向生態(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：長白山站數(shù)據(jù)檢測和技術(shù)指導(dǎo)。

張雷明（1974—），男，河南開封人，副研究員，研究方向生態(tài)學(xué)。主要承擔(dān)工作：數(shù)據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。