不同污水處理廠活性污泥微生物多樣性差異分析

郭 楓，張文俊，張俊霞，劉 彪，扶詠梅，胡紅偉

（1.河南城建學(xué)院河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467036；2.華北水利水電大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，河南 鄭州 450011）

活性污泥法具有處理效率高和運(yùn)行成本低等優(yōu)勢，被廣泛用于污水處理［1］。微生物是活性污泥的重要組成部分，微生物群落驅(qū)動著污染物的降解和轉(zhuǎn)化，直接影響污水處理廠的處理效率和穩(wěn)定性［2－3］。因此，研究污水處理廠中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能對深入了解污水生物凈化的機(jī)制具有重要意義。

近年來，通過高通量測序技術(shù)對活性污泥微生物群落進(jìn)行研究，獲得了許多成果。Ibarbalz等［4］研究了8個污水處理廠好氧處理單元的活性污泥樣本，發(fā)現(xiàn)污水特征是驅(qū)動微生物群落結(jié)構(gòu)組裝的決定因素。市政污水主要來源于日常生活產(chǎn)生的污水，其有機(jī)物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)、糖類、纖維等［5］。研究表明，市政污水處理廠活性污泥微生物群落的優(yōu)勢種群主要為Proteobacteria和Bacteroidetes［6－8］。

工業(yè)廢水的特點(diǎn)與市政生活污水存在顯著的差異，不同類型的工礦企業(yè)在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢水具有不同的特點(diǎn)，大多數(shù)工業(yè)廢水可生化性較差，需經(jīng)預(yù)處理提高其可生化性，再進(jìn)行生物處理。在生物處理過程中，微生物群落結(jié)構(gòu)與廢水的組成密切相關(guān)。Yang等［9］發(fā)現(xiàn)，在工業(yè)廢水活性污泥中Nitrospira較市政污水低，表明工業(yè)廢水的復(fù)雜性影響硝化和反硝化過程。在巧克力生產(chǎn)廢水中，F(xiàn)irmicutes是最為優(yōu)勢的微生物群落［10］，而在石化廢水中，以Proteobacteria為主導(dǎo)的微生物種群對復(fù)雜化合物具有良好的降解性能［11］。趙婷婷等［12］研究了淀粉廢水處理系統(tǒng)中微生物群落，發(fā)現(xiàn)最重要優(yōu)勢細(xì)菌類群為Proteobacteria?？梢姡煌愋臀蹚U水中活性污泥微生物群落組成各有特點(diǎn)。

本研究通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，以16SrRNA基因的V4區(qū)為靶基因，對7個污水處理廠好氧生物處理單元中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，其中5個來自市政污水處理廠，2個來自工業(yè)廢水處理廠（尼龍化工和氯堿化工）。研究結(jié)果將對市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異的認(rèn)識和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2019年1月對市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠的好氧生物處理單元進(jìn)行了采樣，采樣深度為10～30 cm，分別標(biāo)記樣本為BF、BY、PDS、YZA、YZB和LJ、LLY。采集后，樣本立即被置于無菌聚乙烯容器中，在低溫條件下保存，并在2～3 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。BF、BY和PDS生物處理工藝為奧貝爾氧化溝，YZA和YZB生物處理工藝為厭氧－缺氧－好氧聯(lián)合工藝（A2O）。LJ樣本來自氯堿化工廠，該廠主要生產(chǎn)燒堿和聚氯乙烯等化工原料，廢水在中期和后期采用接觸氧化法進(jìn)行處理。LLY樣本來自尼龍化工廠，該廠主要生產(chǎn)己內(nèi)酰胺、環(huán)己醇和環(huán)己酸，廢水經(jīng)氨肟化預(yù)處理后采用MSBR工藝進(jìn)行處理。

1.2 理化指標(biāo)測定

采用便攜式測量儀（Hanna HI98130，意大利）測定pH值，采用重鉻酸鹽法測定化學(xué)需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD），采用納氏試劑法測定氨氮（NH4－N），采用酚二磺酸法測定硝酸鹽氮（NO3－N），采用N－（1－萘基）－乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽氮（NO2－N），采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定總氮（Total Nitrogen，TN）。上述測定均使用紫外可見分光光度計（普析T6，北京）。

1.3 高通量測序分析

采用0.2μm孔徑的混合纖維濾膜進(jìn)行生物樣本收集。使用DNA試劑盒（OMEGA E.Z.N.ATMMag－Bind DNA Kit，US）從7個污水處理廠的活性污泥中提取微生物DNA。使用Qubit2.0DNA定量系統(tǒng)（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）測量DNA濃度。微生物多樣性鑒定區(qū)域?yàn)?6S rRNA基因的V4區(qū)，使用引物515F：5′－GTGCCAGCMGCCGCGGTAA－3′和806R：5′－GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3′。經(jīng)PCR擴(kuò)增和純化，使用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序。高通量測序由生工生物技術(shù)（上海）有限公司完成。原始數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后按照序列相似性大于97%聚類為一個OTU（Operational Taxonomic Unit）。原始測序數(shù)據(jù)已存入NCBI序列讀取檔案（SRA）數(shù)據(jù)庫，登錄號為：SRP332584。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用R（版本4.2.1）中的vegan包計算樣本α多樣性指數(shù)［13］。使用SPSS 25.0進(jìn)行環(huán)境因子與α多樣性指數(shù)之間的Pearson相關(guān)性分析。使用冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）方法分析微生物對環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系［14］，數(shù)據(jù)處理及可視化使用R語言中的vegan、plyr和ggplot2包。使用主坐標(biāo)分析（Principal Co－ordinates Analysis，PCoA）方法分析各樣本的β多樣性差異［15］，數(shù)據(jù)處理及可視化使用R語言vegan、ape和ggplot2包。使用PICRUSt2基于測序數(shù)據(jù)和直系同源集簇（Clusters of Orthologous Groups，COG）數(shù)據(jù)庫對各樣本微生物群落進(jìn)行功能注釋［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子分析

本研究中所獲得的樣本環(huán)境因子數(shù)據(jù)如表1所示，7個樣本的pH值均大于7，其中LJ的pH值最大。NH4－N、NO3－N和NO2－N的范圍分別為1.41～12.60 mg·L－1、0.28～5.24 mg·L－1和0.02～2.55 mg·L－1。COD的范圍為100.00～420.00 mg·L－1，其中LJ的COD值為340 mg·L－1，LLY的COD值為420 mg·L－1。工業(yè)廢水處理廠樣本COD和pH值均高于市政污水處理廠。此外，PDS的TN濃度最低為11.48 mg·L－1，LJ的TN濃度最高達(dá)到109.33 mg·L－1。

表1 污水處理廠好氧處理單元水樣環(huán)境因子

2.2 微生物多樣性和相關(guān)性分析

各樣本微生物α多樣性指數(shù)如表2所示。

表2 活性污泥微生物α多樣性

由表2可知，市政污水的香農(nóng)指數(shù)均大于5，而工業(yè)廢水香農(nóng)指數(shù)則均小于3。工業(yè)廢水中的辛普森指數(shù)均大于0.1，而市政污水中的辛普森指數(shù)為0.01。市政污水處理廠的ACE指數(shù)均在2 100以上，而工業(yè)廢水的ACE指數(shù)均在500以下，其中LLY的ACE指數(shù)最低，僅為346.07。市政污水的Chao1指數(shù)均超過2 000，而工業(yè)廢水的Chao1指數(shù)均低于500?？傮w而言，工業(yè)廢水處理廠樣本微生物群落多樣性低于市政污水處理廠。環(huán)境因子與微生物α多樣性指數(shù)的皮爾遜相關(guān)性分析表明，pH和COD濃度與微生物多樣性呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05）（見表3）。

表3 環(huán)境因子與微生物α多樣性指數(shù)的皮爾遜相關(guān)性

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)及樣本聚類分析

在門水平上（見圖1（a）），市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠的微生物群落相對豐度存在差異，其主要的微生物門類包括Proteobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi、Actinobacteria和Deinococcus－Thermus。在7個樣本中，Proteobacteria是最具優(yōu)勢的微生物，在市政污水處理廠樣本中占比31.40%～43.97%，在工業(yè)廢水處理廠LJ和LLY分別占86.78%和58.77%。在LLY 中，Deinococcus－Thermus的相對豐度為20.57%，在其他6個樣本中的相對豐度均低于0.1%，顯示出LLY具有獨(dú)特的微生物群落。

圖1 微生物群落結(jié)構(gòu)及樣本聚類分析

在屬水平上（見圖1（b）），市政污水中優(yōu)勢菌屬主要包括Ferruginibacter、Zavarzinella和Hyphomicrobium，LJ和LLY的微生物群落組成與市政污水存在較大差異。在LJ中，最優(yōu)勢的微生物菌屬包括Acinetobacter、Novosphingobium和Polynucleobacter，其中Acinetobacter在LJ的相對豐度最高，而在其他樣本中均低于2%。在LLY中，最優(yōu)勢的微生物菌屬包括Meiothermus、Hyphomicrobium和Comamonas，其中Meiothermus在LLY中的相對豐度為19.72%，而在其他樣本中未檢測到。

基于Bray－Curtis距離的PCoA分析結(jié)果顯示（見圖1（c）），市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠的活性污泥在樣本聚類上相互分離，兩個工業(yè)廢水廠樣本均遠(yuǎn)離市政污水廠樣本?；贠TU水平的RDA分析結(jié)果顯示（見圖1（d）），pH對微生物群落分布有顯著的影響（p＜0.05）。

2.4 功能基因多樣性及豐度

基于COG的功能基因分析表明，市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠樣本在功能基因的多樣性上差異較?。ㄒ妶D2（a）），但在聚類（見圖2（b））及其豐度分布（見圖2（c））上存在較大差異。市政污水處理廠樣本形成聚類，而工業(yè)廢水處理廠樣本則與其有較大的分離。功能基因豐度熱圖則揭示了在污水處理中，能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換（Energy production and conversion）、氨基酸運(yùn)輸與代謝（Amino acid transport and metabolism）、碳水化合物運(yùn)輸與代謝（Carbohydrate transport and metabolism）、細(xì)胞壁／膜／包被生物發(fā)生（Cell wall／membrane／envelope biogenesis）以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Signal transduction mechanisms）等類別的功能基因至關(guān)重要。特別是，LJ中這些功能基因的豐度普遍低于其他樣本，而LLY中這些功能基因的豐度則普遍高于其他樣本。市政污水處理廠樣本之間在功能基因豐度上的差異相對較小。

圖2 基于COG的功能基因分析

3 討論

微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間存在密切關(guān)系，但特定廢水組成對微生物群落的影響較為復(fù)雜。污廢水處理過程中，微生物受到有機(jī)負(fù)荷、pH、溫度、溶解氧等多種因素的影響。本研究中，LJ的高pH與燒堿等產(chǎn)品生產(chǎn)過程中排放的廢水性質(zhì)密切相關(guān)，而LLY的高COD濃度與己內(nèi)酰胺、環(huán)己醇生產(chǎn)過程中排放的碳源相關(guān)。同時，工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物群落具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，且pH和COD對活性污泥微生物群落的形成有較大影響，該結(jié)果與Xu等［17］的研究結(jié)果相似。COD與廢水中有機(jī)質(zhì)的種類和濃度相關(guān)，而pH與微生物的代謝環(huán)境相關(guān)，二者的共同作用導(dǎo)致了其獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)。已有研究表明，廢水的類型被認(rèn)為是引起活性污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)差異最重要的原因［18］，與本研究的結(jié)果相符。

本研究中，7個污水處理廠樣本微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異。市政污水處理廠樣本在門水平上的微生物群落組成與之前的研究相似［8，19］。工業(yè)廢水處理廠樣本則表現(xiàn)出獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，與市政污水處理廠中常見的微生物群落組成有較大差異［20］。此外，工業(yè)廢水處理廠樣本微生物群落α多樣性較低，與Yang等［9］研究結(jié)果一致。特別是在LJ中，優(yōu)勢菌屬Acinetobacter和Novosphingobium具備降解多環(huán)芳烴的能力［21－22］，Polynucleobacter在降解有機(jī)物方面具有優(yōu)勢［23］，這與其廢水特點(diǎn)具有密切的關(guān)聯(lián)。同時，LLY中特有菌屬M(fèi)eiothermus是造紙廠廢水處理系統(tǒng)中常見的微生物［24］，并在陸地?zé)崛斜话l(fā)現(xiàn)［25］。己內(nèi)酰胺生產(chǎn)過程中有大量有機(jī)物和溫廢水的排放，原因可能是存在大量的Meiothermus。

微生物群落的基因功能主要集中在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁／膜／包膜生物發(fā)生、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等方面，這些功能與廢水的特性存在關(guān)聯(lián)，如參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝等。盡管不同污水處理廠樣本的功能基因多樣性指數(shù)相接近，但功能豐度存在差異。在LJ中，優(yōu)勢功能基因的豐度低于其他樣本，這可能是單一的廢水結(jié)構(gòu)造成的。而在LLY中，氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化功能基因均高于其他樣本，這表明在工業(yè)廢水的影響下相關(guān)的代謝功能得到了增強(qiáng)。此外，以往研究表明，在高鹽環(huán)境的脅迫下，微生物群落可發(fā)展出特定的代謝模式以維持細(xì)胞活性［26］，這也可能是造成工業(yè)廢水處理廠微生物功能差異的潛在原因。

4 結(jié)論

（1）工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中微生物群落多樣性和豐富度均低于市政污水處理廠。本研究中，微生物群落α多樣性指數(shù)與pH和COD呈顯著負(fù)相關(guān)。

（2）來自市政污水處理系統(tǒng)的5個樣本，優(yōu)勢菌屬均為Ferruginibacter、Zavarzinella和Hyphomicrobium。工業(yè)廢水處理系統(tǒng)則存在差異，在LJ中，Acinetobacter、Novosphingobium和Polynucleobacter為優(yōu)勢菌屬，在LLY中，Meiothermus、Hyphomicrobium和Comamonas為優(yōu)勢菌屬。

（3）基于COG數(shù)據(jù)庫的功能基因預(yù)測顯示，工業(yè)廢水處理廠和市政污水處理廠樣本在功能基因多樣性上差異性較小，但在優(yōu)勢功能基因的豐度上存在較大差異。這種差異是由工業(yè)廢水和市政污水特性所導(dǎo)致的。