紫色土上大葉女貞苗接種叢枝菌根真菌后對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

黎 蕾，湯玉喜，李永進(jìn)，唐 潔，梁軍生，楊 艷

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004)

紫色土是發(fā)育于亞熱帶紫色砂頁巖的一種巖性土，其土層薄、顏色較深、吸熱性強(qiáng)、導(dǎo)熱性差、保水能力差，在高溫干旱環(huán)境下極易形成季節(jié)性干旱，從而限制植物的生長發(fā)育[1]。干旱脅迫會(huì)造成植物光合能力下降、降低植物水勢、阻礙植物生長，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成植物死亡[2]。近年來，通過接種叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)解決植物干旱脅迫問題越來越受到重視，相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用也越來越多[3]。AMF能與絕大多數(shù)的陸生植物形成共生體系，在植物應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[4]。大量研究表明，接種AMF能促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高植物的抗旱性[5-7]。在干旱脅迫條件下，AMF根外菌絲體依靠其在土壤中形成的龐大菌絲網(wǎng)絡(luò)改變植物體水分的進(jìn)出速率，增強(qiáng)了宿主植物對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收效率，提高了植物的凈光合速率和光合水分利用效率[8-10]。在干旱脅迫下，葉片是植物對(duì)環(huán)境變化最敏感的部位，具有極強(qiáng)的可塑性[11]，其結(jié)構(gòu)特征能反映植物對(duì)不同環(huán)境變化所形成的生存策略，最能體現(xiàn)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[12-13]。因此，研究葉片形態(tài)特征對(duì)揭示植物的抗旱機(jī)理具有重要意義。大葉女貞(LigustrumLucidum)為木犀科(Oleaceae)女貞屬(Ligustrum)植物，是南方地區(qū)常見的鄉(xiāng)土樹種，具有較強(qiáng)的耐旱性[14]。目前關(guān)于大葉女貞的研究主要集中在其抗寒性、重金屬富集、耐鹽性、滯塵效應(yīng)等方面[15]。大葉女貞在綠地土壤修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用，目前在湖南省衡陽地區(qū)紫色土坡地上廣泛種植，但受限于紫色土保水保肥能力差，通常存在生長遲緩、葉片小且葉色發(fā)黃、幼苗極易缺水而難以存活等問題。本研究分析了接種AMF對(duì)紫色土干旱脅迫環(huán)境下大葉女貞葉片生長與生理特性的影響，以期為紫色土區(qū)大葉女貞抗旱和菌根調(diào)控技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大葉女貞種子于2021年11月采自衡陽市祁東縣紫色土區(qū)。供試的2種AMF購置于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所“亞熱帶叢枝菌根(AM)真菌資源保藏中心”，分別為摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae，F(xiàn)M)、幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum，CE)菌劑。菌劑由菌根真菌孢子、根外菌絲、菌根化根段及砂土組成。摩西斗管囊霉、幼套近明球囊霉菌劑中分別含有孢子65±5、50±5個(gè)·g-1。供試土取自衡陽市祁東縣紫色土區(qū)0～25cm的表層紫色土，經(jīng)自然風(fēng)干并過篩(孔徑<4mm)后混合土樣，帶回實(shí)驗(yàn)室測定其基本理化性質(zhì)。測定結(jié)果見表1。

表1 紫色土土壤基本理化性質(zhì)Tab.1 Basic physical and chemical properties of purple soil有機(jī)質(zhì)含量/(g·kg-1)全氮含量/(g·kg-1)全磷含量/(g·kg-1)全鉀含量/(g·kg-1)pH田間持水量/%土壤容重/(g·cm-3)15.001.050.8526.98.2326.23%1.67

1.2 研究方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)置W1(正常供水，盆內(nèi)土壤相對(duì)含水量為田間持水量的75%±5%)、W2(干旱脅迫，盆內(nèi)土壤相對(duì)含水量為田間持水量的40%±5%)2種水分條件，N0(接種滅菌菌劑10 g)、FM(接種摩西斗管囊霉菌劑10g)、CE(接種幼套近明球囊霉菌劑10g)等3種接種方法，共6種處理，分別為W1N0(CK，接種滅菌菌劑10g和正常澆水)、W1FM(接種FM菌劑10g和正常澆水)、W1CE(接種CE菌劑10g和正常澆水)、W2N0(接種滅菌菌劑10g和干旱脅迫)、W2FM(接種FM菌劑10g和干旱脅迫)、W2CE(接種CE菌劑10g和干旱脅迫)。每種處理接種9盆，共接種54盆。

采用盆栽方式育苗。盆栽用花盆直徑15cm，深14cm，每盆裝供試紫色土1.7kg。挑選外觀均勻一致的大葉女貞種子，使用 10%(V/V)的H2O2溶液對(duì)種子表面消毒10min，以無菌水沖洗多次，再浸泡1d后進(jìn)行催芽處理，然后種植于經(jīng)高溫高壓滅菌處理的土中，3d正常澆水1次，直至地上部分長出15cm，根系完整形成時(shí)接種AMF菌劑。接種方法是將10g菌劑或滅菌菌劑施于根系部位[8]。試驗(yàn)在人工氣候室中進(jìn)行，氣候室中光強(qiáng)為700μmol·m-2·s-1，溫度為26℃，光照時(shí)間12～14h·d-1。各種處理的植株隨機(jī)排列，定植1a后，自2023年5月20日開始選取一半的植株進(jìn)行干旱脅迫，另一半植株仍按正常供水。脅迫開始前充分澆水，土壤相對(duì)含水量達(dá)飽和后停止?jié)菜鑳?nèi)水分自然消耗至所設(shè)定的土壤相對(duì)含水量后，開始進(jìn)行干旱脅迫?？厮椒▍⒖寂Ｋ刎懙萚16]的方法，根據(jù)土壤含水量、田間持水量和設(shè)定的土壤相對(duì)含水量計(jì)算每處理每重復(fù)達(dá)到所設(shè)定的相對(duì)含水量時(shí)的盆土質(zhì)量。隨后每2d稱量盆土質(zhì)量并補(bǔ)水，采用稱量質(zhì)量法保持土壤相對(duì)含水量穩(wěn)定，使土壤相對(duì)含水量控制在各干旱脅迫處理的范圍內(nèi)，連續(xù)控水90d，至2023年8月20日結(jié)束干旱脅迫。干旱脅迫結(jié)束后測定大葉女貞葉片的光合參數(shù)、葉綠素相對(duì)含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并采集各處理植株中上部成熟葉片15片，置于冰盒內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，測量葉片表型性狀和測定葉片干物質(zhì)含量與相對(duì)含水量等。

1.2.2 葉片表型性狀測量及生理特性測定

(1)葉片表型性狀測量。每份葉片樣品選取3～5片健康完整的新鮮葉片，用LI-3000C便攜式葉面積儀(LI-COR，美國)測定葉片寬度(最大寬度和平均寬度)、葉片長度、葉面積(LA)。

(2)干物質(zhì)含量和相對(duì)含水量測定。將采集的新鮮葉片浸入去離子水中，放置8h后稱量其飽和質(zhì)量，然后將葉片置于烘干箱內(nèi)烘48h至恒質(zhì)量，稱量葉片干質(zhì)量，并計(jì)算葉片干物質(zhì)含量(LDMC)和葉片相對(duì)含水量。LDMC=葉片干質(zhì)量/葉片鮮質(zhì)量(g·g-1)。葉片相對(duì)含水量=(葉片鮮質(zhì)量-葉片干質(zhì)量)/(土壤相對(duì)含水量達(dá)到飽和時(shí)的葉片鮮質(zhì)量-葉片干質(zhì)量)×100%[17]。

(3)光合參數(shù)測定。采用便攜式光合作用測定系統(tǒng)Licor-6400(LI-COR，美國)測定光響應(yīng)曲線，每種處理選擇3株，每株選擇2片葉片測定。CO2濃度設(shè)定為400 μmol·mol-1，CO2由系統(tǒng)自動(dòng)控制注入。測定前，用1800μmol·m-2·s-1的光強(qiáng)對(duì)所測葉片進(jìn)行15 min光誘導(dǎo)。設(shè)置光強(qiáng)梯度由高到低依次為2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、100、80、60、40、20、0 μmol·m-2·s-1，每個(gè)梯度光強(qiáng)值設(shè)定數(shù)據(jù)采集時(shí)間3min，測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)等參數(shù)。利用Pn、Tr計(jì)算植物水分利用效率(WUE=Pn/Tr)。

(4)葉綠素相對(duì)含量測定。使用便攜式葉綠素測定儀SPAD-502 Plus(Konica-Minolta，日本)測定葉片的葉綠素相對(duì)含量(SPAD值)。每種處理選擇3株，每株選擇5片葉片測定，每片葉片測定4個(gè)部位的SPAD值，4個(gè)部位SPAD值的平均值為葉片總體SPAD值。

(5)葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定。使用手持式葉綠素?zé)晒鈨xFluorPen FP 110(PSI，捷克)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，每種處理選擇3株，每株選擇3片葉片測定。測定方法為葉片暗適應(yīng)20min后檢測葉片葉綠素?zé)晒?，記錄葉綠素?zé)晒怅P(guān)鍵參數(shù)PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016和OriginPro 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，運(yùn)用SPSS 18.0 軟件對(duì)各參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉女貞苗接種AMF后葉片生長特性對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

由表2可見：干旱脅迫對(duì)紫色土上大葉女貞的葉片數(shù)、葉面積、葉長、最大葉寬、平均葉寬、葉片相對(duì)含水量、葉片干物質(zhì)含量等都有顯著影響(P<0.05)。干旱脅迫使大葉女貞的葉片數(shù)顯著減少(P<0.05)，使葉長、平均葉寬及葉面積均顯著減小(P<0.05)；使葉片相對(duì)含水量顯著降低(P<0.05)，其中接種滅菌菌劑、接種FM和接種CE處理的葉片相對(duì)含水量比正常供水處理的分別降低了9.81%、1.76%和2.54%，接種AMF處理的降低較少，可見接種AMF提高了大葉女貞對(duì)水分變化的適應(yīng)能力。葉片相對(duì)含水量反映了葉片的持水能力，植物受到干旱脅迫時(shí)葉片相對(duì)含水量通常會(huì)降低，降低值越大說明植物對(duì)水分的適應(yīng)性越差[17]。3種處理的葉片干物質(zhì)含量受干旱脅迫后反而都提高，其中接種滅菌菌劑處理和接種FM處理的葉片干物質(zhì)含量受干旱脅迫后都顯著提高(P<0.05)。這些反映了大葉女貞為更好地適應(yīng)干旱環(huán)境形成的生存策略。

表2 不同處理大葉女貞的葉片性狀均值Tab.2 Effects of different treatments on leaf traits of Ligustrum lucidum處理葉片數(shù)葉面積/cm2葉長/cm最大葉寬/cm平均葉寬/cm葉片相對(duì)含水量/%葉干物質(zhì)含量/(g·g-1)W1N021±3 bc15.31±4.52 d6.52±0.95 c3.24±0.44 b2.24±0.38 b84.88±0.9 d0.28±0.01 bW1FM67±9 a29.57±2.53 a10.18±1.08 a4.2±0.18 a3.16±0.18 a92.81±0.63 b0.21±0.01 dW1CE56±13 a23.45±4.35 b8.41±0.19 b4.08±0.48 a2.94±0.28 a94.83±0.17 a0.25±0.02 cW2N017±3 c7.65±0.92 e4.13±0.9 d2.28±0.37 c1.43±0.33 c76.55±0.6 e0.32±0.01 aW2FM31±5 b21.39±0.7 bc8.03±1 bc3.72±0.19 ab2.18±0.14 b91.18±0.51 c0.28±0.01 bW2CE26±3 bc16.55±2.16 cd6.42±0.81 c3.61±0.26 ab2.42±0.04 b92.42±0.21 b0.27±0.02 bc 注: 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05水平)。下同。

由表2還可以看出：在兩種水分條件下，接種AMF都能顯著提高(P<0.05)紫色土上大葉女貞的葉片數(shù)及葉片相對(duì)含水量，顯著增大(P<0.05)其葉面積。正常供水時(shí)，接種FM處理的大葉女貞葉片數(shù)、葉面積、葉長、最大葉寬、平均葉寬和葉片相對(duì)含水量比接種滅菌菌劑處理的分別提高了219.05%、93.14%、56.13%、29.63%、41.07%和9.34%；接種CE處理的比接種滅菌菌劑處理的分別提高了166.67%、53.17%、28.99%、25.93%、31.25%、11.72%。干旱脅迫時(shí)，接種FM處理的大葉女貞葉片數(shù)、葉面積、葉長、最大葉寬、平均葉寬和葉片相對(duì)含水量比接種滅菌菌劑處理的分別提高了82.35%、179.61%、94.43%、63.16%、52.45%和19.11%；接種CE處理的比接種滅菌菌劑處理的分別提高了52.94%、116.34%、55.45%、58.33%、69.23%和20.73%。在2種水分條件下，與接種滅菌菌劑的處理相比，接種AMF處理的大葉女貞葉片干物質(zhì)含量都降低了；接種FM對(duì)大葉女貞的葉片數(shù)增多和葉長、葉寬、葉面積增大等的促進(jìn)效果都優(yōu)于接種CE的，其中，葉面積、葉長、葉片相對(duì)含水量的差異均顯著(P<0.05)。

2.2 大葉女貞苗接種AMF后葉片光合特性對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

在干旱脅迫下，紫色土上大葉女貞葉片的凈光合速率(Pn)對(duì)光合有效輻射強(qiáng)度(PAR)的響應(yīng)曲線如圖1所示。圖1顯示：所有處理都表現(xiàn)為隨著PAR的加大，大葉女貞葉片的Pn均呈先增大再趨于平穩(wěn)的變化趨勢。當(dāng)PAR為0～200 μmol·m-2·s-1時(shí)，葉片的Pn快速升高；當(dāng)PAR為200～800 μmol·m-2·s-1時(shí)，葉片的Pn上升緩慢；當(dāng)PAR超過800 μmol·m-2·s-1時(shí)，葉片的Pn趨于平緩或下降?？梢?，過高的PAR甚至可能會(huì)抑制大葉女貞的光合作用。大葉女貞在受到干旱脅迫時(shí)，其葉片的凈光合速率會(huì)受到抑制，其中接種AMF處理的抑制程度有所減輕。

圖1 不同處理大葉女貞葉片的凈光合速率-光合有效輻射強(qiáng)度響應(yīng)曲線Fig.1 Response curves of net photosynthetic rate-light intensity of Ligustrum lucidum leaves under different treatments

由圖2可知：干旱脅迫顯著降低(P<0.05)了大葉女貞葉片的氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率，顯著提高(P<0.05)了接種AMF處理大葉女貞葉片的水分利用效率。正常供水時(shí)，接種FM處理的大葉女貞葉片氣孔導(dǎo)度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，與對(duì)照相比分別提高了31.27%和21.12%，胞間CO2濃度及蒸騰速率沒有顯著變化；接種CE處理的大葉女貞葉片氣孔導(dǎo)度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，與對(duì)照相比分別提高了34.65%和29.58%；胞間CO2濃度及蒸騰速率沒有顯著變化。干旱脅迫時(shí)，接種FM處理的大葉女貞葉片胞間CO2濃度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，分別比對(duì)照的提高了26.70%和64.90%；接種CE處理的大葉女貞葉片胞間CO2濃度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，分別比對(duì)照的提高了18.72%和35.39%。在兩種水分條件下，與接種滅菌菌劑的處理相比，接種AMF處理的大葉女貞葉片的水分利用效率均顯著提高，特別是在干旱脅迫的環(huán)境下，提高效果更明顯。雖然在兩種水分條件下接種兩種AMF處理的大葉女貞氣體交換參數(shù)和水分利用效率的差異均不顯著，但在干旱脅迫時(shí)，接種FM處理的胞間CO2濃度、蒸騰速率、水分利用效率均大于接種CE的。

圖2 接種不同AMF的大葉女貞在不同水分條件下葉片氣體交換參數(shù)及水分利用效率Fig.2 Leaf gas exchange parameters and water use efficiency of Ligustrum lucidum inoculated with different AMF under different water conditions

2.3 大葉女貞苗接種AMF后葉片的SPAD值及葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

由表3可知：干旱脅迫對(duì)大葉女貞葉片的SPAD值影響顯著(P<0.05)，使葉片的SPAD值反而增大，尤其是接種了AMF的2種處理，其SPAD值均顯著增大(P<0.05)。正常供水時(shí)，接種FM和CE處理的大葉女貞葉片的SPAD值都顯著(P<0.05)大于接種滅菌菌劑處理的，分別比接種滅菌菌劑處理的大6.50%和19.70%；在干旱脅迫時(shí)，接種FM和CE處理的大葉女貞葉片的SPAD值也都顯著大于(P<0.05)對(duì)照處理的，分別比對(duì)照處理的大18.10%和23.74%。在干旱脅迫條件下，接種AMF顯著提高(P<0.05)了大葉女貞葉片的Fv/Fm值，接種FM和CE處理的Fv/Fm值分別比接種滅菌菌劑處理的提高了1.22%和2.44%。在正常供水條件下，不同AMF接種處理的Fv/Fm差異不顯著。Fv/Fm代表PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率，反映了植物是否受到光抑制，當(dāng)植物處于逆境中或被傷害時(shí)，該指標(biāo)會(huì)下降[19-20]。干旱脅迫顯著降低(P<0.05)了大葉女貞葉片的qP。在干旱脅迫下，接種AMF能顯著提高(P<0.05)大葉女貞葉片的qP，其中接種FM和CE處理的分別比接種滅菌菌劑處理的提高16.67%和7.14%。qP代表著PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的部分，反映PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度，qP越大，PSⅡ的電子傳遞活性越大[21]。干旱脅迫顯著提高(P<0.05)了大葉女貞葉片的NPQ，其中，接種滅菌菌劑處理的NPQ提高最多，增量為0.56。NPQ代表PSⅡ天線色素吸收的光能以熱能形式耗散的部分，反映了植物在強(qiáng)光環(huán)境下的自我保護(hù)機(jī)制[22]。

表3 不同處理大葉女貞葉片的SPAD及熒光參數(shù)Tab.3 SPAD and fluorescence parameters of L.lucidum under different treatments處理SPAD值PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)W1N048.03±0.53 d0.83±0.02 ab0.55±0.05 a1.38±0.33 bcW1FM51.15±0.72 c0.84±0.01 a0.58±0.05 a1.16±0.23 cW1CE57.49±1.78 b0.84±0.01 a0.58±0.04 a1.25±0.3 cW2N049.24±0.03 cd0.82±0.02 b0.42±0.01 c1.94±0.21 aW2FM58.15±2.08 b0.83±0.01 a0.49±0.01 b1.66±0.18 abW2CE60.93±2.53 a0.84±0.01 a0.45±0.01 bc1.67±0.08 ab

3 結(jié)論與討論

(1)干旱脅迫使紫色土上大葉女貞的葉片數(shù)顯著減少，使葉面積、葉長、平均葉寬等均顯著減小，使葉片相對(duì)含水量顯著降低，但葉干物質(zhì)含量受干旱脅迫后反而提高。干旱脅迫下，植物可通過改變?nèi)~片性狀來適應(yīng)環(huán)境變化，紫色土上大葉女貞通過減少葉面積來適應(yīng)干旱環(huán)境。在正常供水和干旱脅迫時(shí)，接種AMF都能使大葉女貞葉片數(shù)增多，使葉片相對(duì)含水量提高，使葉面積增大。其中，接種FM對(duì)大葉女貞的葉片數(shù)增多和葉長、葉寬、葉面積增大等的促進(jìn)效果都優(yōu)于接種CE的。

(2)紫色土上大葉女貞在受到干旱脅迫時(shí)，其葉片凈光合速率會(huì)受到抑制，接種AMF后抑制程度有所減輕。干旱脅迫顯著降低了大葉女貞葉片的氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率。接種AMF顯著提高了紫色土上大葉女貞的水分利用效率，特別是在干旱脅迫的環(huán)境下，促進(jìn)作用更顯著，且接種FM對(duì)大葉女貞水分利用效率的提升效果優(yōu)于接種CE的。已有研究表明，接種AMF可以提高很多植物，如云南藍(lán)果樹(Nyssayunnanensis)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)等植物的葉片水分利用效率(WUE)[23-24]。

(3)干旱脅迫對(duì)紫色土上大葉女貞葉片葉綠素相對(duì)含量(SPAD值)的影響顯著，大葉女貞葉片的SPAD值在干旱脅迫下反而增大。孔艷菊等[25]的研究結(jié)果顯示，干旱脅迫下，黃櫨(Cotinuscoggygriavar.cinereus)葉片中的葉綠素含量會(huì)升高，這與本研究的結(jié)論一致，可能是由于干旱脅迫使得葉片相對(duì)含水量降低，葉片擴(kuò)展生長受限，葉片單位面積的葉綠素含量升高，這樣雖然葉綠素含量升高了，卻因水分相對(duì)含量減少又使得葉綠素的活性降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在紫色土區(qū)的大葉女貞接種AMF后顯著促進(jìn)了葉綠素的合成，這與賀學(xué)禮等[26]關(guān)于檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)在水分脅迫下接種AMF對(duì)其葉綠素合成的效果一致。

(4)干旱脅迫顯著降低了紫色土區(qū)大葉女貞葉片的qP，但顯著提高了大葉女貞葉片的NPQ。在受到干旱脅迫時(shí)，接種AMF能顯著提高大葉女貞葉片的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。這與馬坤等[27]對(duì)干旱脅迫下木棉(Bombaxceiba)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的研究結(jié)果一致。