仔豬源鏈球菌分離鑒定與耐藥性試驗(yàn)

王曉艷

(山東省莒南縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東臨沂 276600）

鏈球菌（Streptococcus）是臨床中常見(jiàn)的人畜共患病原菌之一，該菌廣泛存在于自然界的土壤、水源及養(yǎng)殖環(huán)境中，且大多數(shù)的健康動(dòng)物體內(nèi)也存在該細(xì)菌[1]。鏈球菌可以感染多種家畜（豬、牛、羊、鹿）、家禽（雞、鴨、鵝）甚至感染人，并引起畜禽發(fā)病，該菌可以引起多種動(dòng)物和人的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、乳房炎、腹瀉、化膿及毒素引起的休克等一系列的臨床癥狀，同時(shí)該菌可以引起人患病，嚴(yán)重危害著動(dòng)物和人類(lèi)健康，因此，臨床上對(duì)該病的防控具有重要意義[2,3]。豬鏈球菌病是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的細(xì)菌性疾病之一，該病是由不同血清型的鏈球菌引起的，對(duì)各個(gè)階段的豬只均有感染，其中對(duì)仔豬危害較大，臨床上多以急性癥狀中的腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和慢性癥狀的關(guān)節(jié)炎為常見(jiàn)，其感染率和死亡率均較高，死亡率高達(dá)80%以上，且在臨床中經(jīng)常與病毒性疾?。ㄘi繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型）混合感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-7]。

近年來(lái)，對(duì)于豬鏈球菌病的報(bào)道越來(lái)越多，鏈球菌可以感染不同階段的豬，其中對(duì)仔豬最易感，尤其4～10日齡仔豬，臨床中以肺炎、化膿性感染、滲出性皮炎及脫水為主要癥狀，其死亡率較高[8,9]。國(guó)內(nèi)外研究表明，鏈球菌有較強(qiáng)的耐藥性，且已經(jīng)普遍存在并呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，鏈球菌的耐藥性給臨床治療該病帶來(lái)一定困難，且其耐藥性可以在動(dòng)物和人之間相互傳播，已成為公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[10,11]。本試驗(yàn)對(duì)采集患病仔豬病料樣品進(jìn)行鏈球菌分離鑒定，并檢測(cè)其致病性和耐藥性，以期為山東莒南地區(qū)仔豬源鏈球菌的合理用藥提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2020-2021年采集山東莒南縣部分養(yǎng)豬場(chǎng)病死仔豬的鼻拭子、肺臟和肝臟等組織病料127 份，采集的病料組織經(jīng)處理后，進(jìn)行鏈球菌的分離鑒定。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

將采集的樣品進(jìn)行處理后，無(wú)菌條件下接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基上，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h 后，挑取單個(gè)菌落接種于鏈球菌培養(yǎng)基中進(jìn)行鑒別培養(yǎng)（12～18 h），然后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

1.3 生化試驗(yàn)鑒定

參照Raid ID 32 STREP 陽(yáng)性菌鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，將分離菌株接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為0.5 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，無(wú)菌條件下，接種于試紙條中，37℃培養(yǎng)12～18 h，然后進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4 細(xì)菌PCR 鑒定

設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物（表1）。用水煮法提取分離菌株的基因組并進(jìn)行PCR 鑒定?；厥誔CR 產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，通過(guò)BLAST 搜索比對(duì)結(jié)果，以確定為鏈球菌菌株。

表1 引物序列

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

1.5 致病性試驗(yàn)

將分離菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL，每株分離菌株腹腔注射給2 只昆明系小鼠，劑量為0.25 mL/ 只（107CFU/mL），對(duì)照組小鼠腹腔注射等量的無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)期7 d，觀察小鼠的發(fā)病情況。

1.6 藥敏試驗(yàn)

分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2013年推薦的藥敏試驗(yàn)法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作與結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似鏈球菌的菌株通過(guò)7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉鑒別培養(yǎng)基分離培養(yǎng)及鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)結(jié)果，均符合鏈球菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)特征。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)

通過(guò)Raid ID 32 STREP 陽(yáng)性菌鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定，68 株分離菌株初步鑒定為鏈球菌。

2.3 細(xì)菌PCR 鑒定

對(duì)初步鑒定為鏈球菌的菌落，用PCR 進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示分離的68 株分離菌株均擴(kuò)增出大約為1 500 bp的目的條帶（圖1）。通過(guò)測(cè)序?qū)Ρ?8 株分離菌株與參考株（鏈球菌）的同源性均大于98%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）說(shuō)明分離株為鏈球菌，此試驗(yàn)鏈球菌的檢出率為53.5%（68/127）。

圖1 部分分離菌株P(guān)CR 鑒定結(jié)果

圖2 分離菌株代表株（JM202010）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 致病性試驗(yàn)

攻毒組小鼠在攻毒2～3 d 后，出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病，且個(gè)別攻毒小鼠不表現(xiàn)任何癥狀而出現(xiàn)急性死亡，剖檢死亡小鼠后采集病料組織，分離得到鏈球菌，攻毒試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組小鼠仍健康存活。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，有50株鏈球菌能引起小鼠死亡，確定為致病性菌株。

2.5 藥敏試驗(yàn)

分離菌株的耐藥性分析顯示，50 株致病性鏈球菌對(duì)新霉素、氟苯尼考、大觀霉素、氨芐西林、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素等9 種藥物的耐藥率為52.0%～84.0%，對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素5 種藥物耐藥率為4.0%～30%；說(shuō)明臨床中分離的50 株致病性鏈球菌對(duì)臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

鏈球菌是一種臨床上常見(jiàn)的人畜共患的條件性致病菌，該菌廣泛存在于動(dòng)物和人類(lèi)的體內(nèi)及環(huán)境中，可以通過(guò)多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、創(chuàng)傷皮膚和黏膜、臍帶等感染）在不同動(dòng)物（雞、豬）之間傳播[10,11]。鏈球菌可以引起豬、牛、羊、雞、鴨、兔等多種動(dòng)物感染，急性病例具有發(fā)病比較急、死亡較迅速等特征，為臨床中畜禽常見(jiàn)的急性、敗血性疾病[12]。陳申申等[13]報(bào)道了從患有腦膜炎的仔豬體內(nèi)分離得到致病較強(qiáng)的鏈球菌。王飛鴻等[14]從規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)死亡的仔豬中分離得到致病性較強(qiáng)的鏈球菌。豬鏈球菌病成為養(yǎng)豬業(yè)中常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一，尤其對(duì)仔豬的危害較大。本試驗(yàn)采集山東莒南地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)病死仔豬的鼻拭子、肺臟和肝臟等病料組織127 份，分離到50 株致病性鏈球菌，說(shuō)明鏈球菌在該地區(qū)豬場(chǎng)中流行較嚴(yán)重，可能對(duì)仔豬存在潛在威脅，養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)注意豬鏈球菌的防控，同時(shí)注意環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高仔豬的免疫力。

臨床中豬鏈球菌病主要通過(guò)抗生素藥物進(jìn)行防治，隨著抗生素的不合理使用或過(guò)量添加，豬場(chǎng)中的一些細(xì)菌對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等藥物產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，其耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的細(xì)菌，其耐藥性也存在差異，降低了抗生素對(duì)豬病的治療效果[7]。本研究表明，50 株致病鏈球菌對(duì)新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9 種藥物耐藥率在52.0%以上，對(duì)其他的藥物耐藥率為4.0%～30%。說(shuō)明從該地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)中分離的鏈球菌對(duì)臨床中常用的藥物存在不同耐藥性，且耐藥嚴(yán)重。因此，在臨床中治療豬鏈球菌病應(yīng)該進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感的藥物進(jìn)行交替使用，同時(shí)應(yīng)該配合環(huán)境消毒，提高治療效果。

4 小結(jié)

綜上所述，豬鏈球菌在養(yǎng)豬場(chǎng)中普遍存在，從山東省莒南縣養(yǎng)豬場(chǎng)中采集的豬病料中，分離出50 株致病性鏈球菌，且其對(duì)新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9 種藥物的耐藥性較高。因此，養(yǎng)豬企業(yè)應(yīng)重視豬場(chǎng)中的細(xì)菌性疾病，尤其人畜共患的鏈球菌病，在防治方面應(yīng)做好環(huán)境衛(wèi)生和合理使用抗生素藥物。