氟苯尼考和硫酸粘菌素對(duì)豬源大腸桿菌、鏈球菌的體外抑菌試驗(yàn)

楊春利

(魯山縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南平頂山 467300）

大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）是腸桿菌科腸桿菌屬革蘭氏陰性鞭毛狀細(xì)菌，能引起豬的多種疾病，主要感染哺乳仔豬、斷奶仔豬，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致哺乳仔豬和斷奶仔豬死亡的重要致病菌[1]。豬大腸桿菌病根據(jù)臨床表現(xiàn)不同分為仔豬白痢、仔豬黃痢和豬水腫病[2]。豬鏈球菌（Streptococcus suis,S.suis）是世界范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的又一重要病原菌，它也被認(rèn)為是一種新興的人畜共患病原體，患病豬表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥及支氣管肺炎等多種病理特征[3,4]。以上2 種細(xì)菌性傳染病在我國(guó)各地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)廣泛分布，且存在混合感染病例，發(fā)病率和病死率較高，給養(yǎng)豬生產(chǎn)者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且威脅公共衛(wèi)生安全?？股厮幬锓乐问桥R床獸醫(yī)實(shí)踐中常用的防控大腸桿菌病和豬鏈球菌病的方法，氟苯尼考（florfenicol）是新一代動(dòng)物專(zhuān)用的酰胺醇類(lèi)廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和支原體均有作用，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、炭疽桿菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌及衣原體等多種病原體均有敏感性[5]。硫酸粘菌素（Colistin Sulfate）為多粘桿菌產(chǎn)生的由多種氨基酸和脂肪酸組成的堿性多肽類(lèi)抗生素[6]，主要用于防治動(dòng)物腸道細(xì)菌感染和促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，對(duì)于大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑制作用[7]。但是，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期使用或者濫用抗生素導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥譜增寬、耐藥性增強(qiáng)、多重耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重，使得抗生素治療動(dòng)物疫病的效果下降，給動(dòng)物的疫病診治帶來(lái)困難。正確的抗生素聯(lián)合用藥可以降低藥物副作用，減少細(xì)菌耐藥性的發(fā)生，發(fā)揮協(xié)同或相加的藥效，提高治療效果[8]。為了提高抗生素藥效、用藥安全性及抗菌活性，降低豬大腸桿菌、鏈球菌帶來(lái)的危害，本試驗(yàn)通過(guò)微量肉湯稀釋法，觀(guān)察了氟苯尼考和硫酸粘菌素聯(lián)合用藥對(duì)治療豬大腸桿菌、鏈球菌的效果，以期為獸醫(yī)臨床科學(xué)用藥提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)抗生素

試驗(yàn)用抗生素由河南華牧生物科技有限公司生產(chǎn)，分別為含量99.00%的氟苯尼考，批號(hào)：2206121；含量98.00%的硫酸粘菌素，批號(hào)：2207152。

1.2 試驗(yàn)菌種

豬大腸桿菌12 株，豬鏈球菌15 株，均采自河南省平頂山市魯山縣部分養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)病豬的病料，經(jīng)過(guò)臨床分離鑒定后備用。大腸埃希菌質(zhì)控菌ATCC25922、鏈球菌質(zhì)控菌CVCC3223 均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 培養(yǎng)基

MH 肉湯培養(yǎng)基、MH 瓊脂平板、KF 鏈球菌瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 藥物儲(chǔ)備液的制備

稱(chēng)取氟苯尼考2.56 g，以丙酮-水溶解、定容至1 000mL，配成濃度為2 560 μg/mL 的氟苯尼考儲(chǔ)備液，-20℃保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取硫酸粘菌素2.56 g，用去離子水溶解、定容至1 000mL，配制硫酸粘菌素儲(chǔ)備液，最終濃度為2 560 μg/mL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌液的制備

將大腸桿菌菌液、鏈球菌菌液復(fù)蘇后分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、KF 鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落分別接種于MH 肉湯培養(yǎng)基中，增菌培養(yǎng)24～36 h，再挑取菌液分別接種于MH 瓊脂平板、含5%犢牛血清的MH 瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，然后分別挑取菌落接種于MH 肉湯培養(yǎng)基中，大腸桿菌37℃培養(yǎng)8 h、鏈球菌37℃培養(yǎng)16 h，平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，最后用PBS 稀釋菌液濃度至1×106CFU/mL。

1.6 單藥最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用96（8×12）U 型孔板微量肉湯2 倍稀釋法測(cè)定每種藥物的MIC 值。每排的第1～10 孔加入肉湯50 μL，第1 孔加入50 μL 終濃度為2 560 μg/mL 的硫酸粘菌素儲(chǔ)備液，2 倍比稀釋?zhuān)来蜗♂屩恋?0 孔。然后在第1～10 孔加入事先稀釋好的1×106CFU/mL 的菌液50 μL，第11、12 孔分別設(shè)置為陽(yáng)性（有菌無(wú)藥）、陰性（無(wú)菌無(wú)藥）對(duì)照組。每種抗生素對(duì)每個(gè)菌株做3 個(gè)重復(fù)。同時(shí)以鏈球菌質(zhì)控菌CVCC3223 做質(zhì)量控制，37℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察每孔內(nèi)培養(yǎng)液渾濁程度的變化。氟苯尼考的MIC 值測(cè)定參考上述操作方法進(jìn)行。當(dāng)質(zhì)控菌MIC 在美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）制定的藥物敏感性范圍內(nèi)[9]，且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)培養(yǎng)液渾濁（細(xì)菌生長(zhǎng)良好），陰性對(duì)照孔內(nèi)培養(yǎng)液清亮（無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)）時(shí)，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔中的最低濃度藥物即為藥物的MIC 值。細(xì)菌敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI 判斷。見(jiàn)表1。

表1 藥物敏感性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)（μg/mL）

1.7 聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

隨機(jī)取1.6 中完成單藥抑菌試驗(yàn)的菌株6 株（大腸桿菌、鏈球菌各3 株），利用棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行測(cè)定氟苯尼考、硫酸粘菌素聯(lián)合用藥效果。以每種藥所對(duì)應(yīng)大腸桿菌、鏈球菌MIC 值為藥物稀釋度，藥物最高濃度為MIC 值的2 倍，依次2 倍比稀釋藥液最高濃度，分別為1、1/2、1/4、1/8、1/16，共設(shè)5 個(gè)稀釋濃度。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上將2 種藥物按照橫排和豎排分別進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)，每孔加入濃度為1×106CFU/mL 的菌液，37℃培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照，觀(guān)察孔內(nèi)培養(yǎng)液變化。采用聯(lián)合用藥的抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration,FIC），以判定聯(lián)合用藥的藥效安全性。FIC＝（聯(lián)合時(shí)A 藥MIC÷單用時(shí)A 藥MIC）＋（聯(lián)合時(shí)B 藥MIC÷單用時(shí)B 藥MIC）。FIC≤0.5，為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1，為相加作用，1＜FIC≤2，為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2 為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種藥物單用最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

由表2 可知，氟苯尼考對(duì)大腸桿菌、鏈球菌的MIC值分別為2～＞128 μg/mL、0.125～1 μg/mL，有3 株大腸桿菌對(duì)氟苯尼考敏感，占25.0%（3/12），有2 株鏈球菌對(duì)氟苯尼考敏感，占16.7%（2/12）；硫酸粘菌素對(duì)大腸桿菌、鏈球菌的MIC 值分別為0.5 ～8 μg/mL、64～＞128 μg/mL，有2 株大腸桿菌對(duì)硫酸粘菌素敏感，占13.3%（2/15），有2 株鏈球菌對(duì)硫酸粘菌素敏感。

表2 單獨(dú)用藥最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果與菌株數(shù)

2.2 2 種藥物聯(lián)合體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

分別挑取完成單獨(dú)用藥抑菌試驗(yàn)的大腸桿菌、鏈球菌各3 株進(jìn)行聯(lián)合用藥對(duì)2 種細(xì)菌的敏感試驗(yàn)，由表3可知，聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌、鏈球菌的FIC 值分別為0.5 μg/mL、0.75 μg/mL 或1.0 μg/mL，發(fā)生協(xié)同或者相加作用，均未出現(xiàn)拮抗、無(wú)關(guān)作用，表明聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥對(duì)防治2 種細(xì)菌性疾病的效果好。

表3 2 種藥物聯(lián)合體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在當(dāng)前豬混合感染疫病嚴(yán)重的形勢(shì)下，由于聯(lián)合用藥能夠降低藥物的使用劑量和細(xì)菌的耐藥性，并擴(kuò)大疫病防治種類(lèi)，因此，臨床上抗生素聯(lián)合用藥，研制復(fù)方藥物成為熱點(diǎn)。氟苯尼考的抗菌機(jī)制是與細(xì)菌70S 核蛋白體50S 亞基上的A 位點(diǎn)結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶活性，從而抑制肽鏈的延伸，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[10]。內(nèi)服和肌肉注射均能表現(xiàn)出吸收迅速、擴(kuò)散廣泛、半衰期長(zhǎng)、血藥濃度高等特點(diǎn)，且能較長(zhǎng)時(shí)間地維持血藥濃度[11]。豬內(nèi)服氟苯尼考后吸收迅速，給藥5 min 后即可在血液中測(cè)到，且血藥濃度較高，Cmax為9.87 mg／L，AUC 值為132.08 mg/（h·L），消除緩慢[12]。硫酸粘菌素抗菌機(jī)制在于其吸附在細(xì)胞膜表面，藥物分子中帶正電荷的游離氨基可與細(xì)菌細(xì)胞膜中帶負(fù)電荷的磷酸鹽結(jié)合，使細(xì)胞膜的表面張力降低和通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物外漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[13]。2 種抗生素抗菌作用機(jī)制不同，為聯(lián)合用藥提供了條件和可能。

單獨(dú)使用抗生素的耐藥性試驗(yàn)表明，氟苯尼考對(duì)大腸桿菌的MIC 值在1～128 μg/mL，抗菌效果較差，而對(duì)鏈球菌的MIC 值在0.125～1 μg/mL，比較敏感，抗菌效果優(yōu)于大腸桿菌。硫酸粘菌素對(duì)鏈球菌的MIC 在32～128 μg/mL，抗菌效果很差，不如對(duì)大腸桿菌的效果好。這與養(yǎng)豬場(chǎng)抗生素使用不科學(xué)及長(zhǎng)期使用一種抗生素有關(guān)，應(yīng)引起注意，盡量輪換用藥，不盲目加大劑量。

聯(lián)合用藥的敏感性研究結(jié)果顯示，2 種抗生素FIC值均小于或等于1 μg/mL，說(shuō)明聯(lián)合用藥可以協(xié)同或增加藥物效果。康宇[14]等報(bào)道，氟苯尼考與硫酸粘菌素聯(lián)用對(duì)豬大腸桿菌、鏈球菌均比單獨(dú)用藥效果有明顯增強(qiáng)，均呈現(xiàn)協(xié)同作用。李賽等[15]報(bào)道，硫酸粘菌素與氟苯尼考聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌的FIC 值≤0.5，為協(xié)同作用，抑菌效果比單一用藥提高2～8 倍。本研究結(jié)果與上述結(jié)果基本一致。

4 小結(jié)

本研究中，通過(guò)對(duì)2 種藥物單獨(dú)使用和聯(lián)合使用的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2 種藥物聯(lián)合使用對(duì)大腸桿菌和鏈球菌的抑菌效果優(yōu)于單獨(dú)使用。因此，在治療豬只的大腸桿菌和鏈球菌感染性細(xì)菌疫病時(shí)，建議聯(lián)合用藥，這樣既可以減少藥物單獨(dú)使用時(shí)的劑量，又能克服目前氟苯尼考或粘菌素抗菌活性降低的缺點(diǎn)。