豬源葡萄球菌的分離與鑒定

楊江宇 焦海宏 肖 靜 萬金隆

(1 塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2 兵團南疆動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆阿拉爾 843300）

1 前言

葡萄球菌病是由葡萄球菌引起的人和動物多種疾病的總稱，如皮膚的化膿性炎癥、菌血癥、敗血癥和各種內(nèi)臟器官的嚴(yán)重感染。豬源葡萄球菌感染仔豬會引起滲出性皮炎，同時也叫“豬油皮病”，是一種仔豬急性接觸性傳染病。該菌常寄居于皮膚、黏膜上，當(dāng)動物機體的抵抗力低下或皮膚、黏膜等破損時，病菌便乘虛而入，滲出性皮炎是該病菌引起豬發(fā)病的主要癥狀[1]。一旦仔豬感染葡萄球菌病，不僅會出現(xiàn)皮膚感染，還會影響身體的正常生長發(fā)育，嚴(yán)重的導(dǎo)致死亡。

1.1 病原

豬源葡萄球菌是微球菌科葡萄球菌屬的一群革蘭氏陽性球菌，是一種圓球形、無鞭毛、無莢膜、不能運動、無芽孢的病原菌，該病原菌對培養(yǎng)基要求不高，普通培養(yǎng)基上可正常生長；在含血液瓊脂固體培養(yǎng)基上生長成表面光滑、邊緣濕潤、圓形無溶血環(huán)的菌落；肉湯培養(yǎng)基上生長成渾濁菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上無法良好生長。該病原菌對環(huán)境要求不嚴(yán)格，具有良好的耐受力，在pH 值4.5～9.0 的環(huán)境中，均能生長，生長最適溫度為37℃左右，加熱至80℃30 min 才能殺滅，瞬間殺滅需要加熱至100℃，該菌在干燥膿汁內(nèi)可存活20～80 d[2]。

1.2 流行病學(xué)

葡萄球菌在自然環(huán)境中分布極為廣泛，在空氣、土壤、食物、污水、塵埃中都有存在，也是人和動物體表及上呼吸道的常駐菌。仔豬感染豬源葡萄球菌的因素很多，如飼養(yǎng)管理與飼養(yǎng)圈舍的環(huán)境、飼養(yǎng)工具、豬群免疫力等[3]。葡萄球菌主要危害5～10日齡的乳豬，其次是斷奶仔豬，在急性期的發(fā)病率可高達100%，死亡率達70%～100%，一年四季都可能發(fā)生，但是發(fā)病最多的是在夏季和秋季溫暖潮濕的季節(jié)，沒有明顯的地域特征，傳播途徑主要通過豬與豬之間的接觸感染，在母豬的皮膚和耳朵等處隱藏的細(xì)菌為主要的傳染源[4,5]。因為發(fā)病率和致死率極高，所以給我國規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[6]。

1.3 臨床癥狀和病理變化

感染葡萄球菌的豬發(fā)病初期皮膚紅腫，滲出粘稠的液體，形成結(jié)痂，有一股惡臭，呈橫紋龜裂，用力將痂皮剝掉，露出紅色的傷口，里面有粘稠的液體和膿性分泌物的紅色創(chuàng)面，隨著病程延長，在傷口上會形成一塊塊黑色紐扣狀結(jié)痂[7]。病豬眼結(jié)膜蒼白，眼部水腫，病變結(jié)痂揭開后可暴露鮮紅色創(chuàng)面，創(chuàng)口皮膚濕潤，黏膜漿性膿液，病豬體表淋巴結(jié)體積變大，并出現(xiàn)腫脹和出血，肝臟、腎臟、脾臟等組織腫脹，輸尿管體積變大，并有細(xì)胞碎片，部分病豬腎臟淤血，腎盂內(nèi)有許多化膿病灶，呈黃豆粒狀。病豬胃腸空虛，部分病豬腹腔內(nèi)有化膿性病灶[8]。

1.4 分離鑒定豬源葡萄球菌的目的和意義

采集阿克蘇地區(qū)某豬場3 只患病豬的病料，對其進行細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗以及藥敏試驗和PCR 測序，分離出豬源葡萄球菌。近年來，滲出性皮炎的危害雖然未達到嚴(yán)重影響生產(chǎn)的程度，但在某些豬場已成為一個嚴(yán)重問題，也已成為豬的一種常見病。該病通常呈散發(fā)性，豬一旦感染該病，其藥物的治療效果較差，病死率仍較高，導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)發(fā)生嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[9]。我國豬滲出性皮炎發(fā)病率增多已是客觀存在，研究和關(guān)注該病的病原、流行病學(xué)及發(fā)病機理對其防治具有重要意義。

2 試驗材料

2.1 試驗動物

本試驗材料來源于新疆阿克蘇地區(qū)某豬場，從保育舍挑選典型病例活豬3 頭。

2.2 試驗儀器與試劑

GSP 9080WBE 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海博訊實業(yè)有限公司生產(chǎn)，CX31 數(shù)碼生物顯微鏡由上海尼康儀器有限公司生產(chǎn)，C1000 Touch PCR 儀由Bio-Rad 中國公司生產(chǎn)，DYY12 型電泳儀由北京六一儀器廠生產(chǎn)，Pico17 型高速離心機由賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)，C1000 TouchTM 型全自動凝膠成像分析儀由Bio-Rad中國公司生產(chǎn)。

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）由Solarbio 生產(chǎn)，LB 瓊脂由青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，革蘭氏染色試劑由上海生物工程有限公司生產(chǎn)，DL2000 Marker 由北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)，細(xì)菌16S rRNA 通用引物（27F,1492R）由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)，核酸染液GelvlewI 由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)，藥敏紙片由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

3 試驗方法

3.1 剖檢采樣

無菌條件下采集病豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織，劃線接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。同時，將組織樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 分離培養(yǎng)

配制TSB 固體培養(yǎng)基、5% LB 綿羊血平板培養(yǎng)基和TSB 液體培養(yǎng)基備用。把采集好的病料放入操作臺中，做好無菌防護。把采集的病料用刀切下一塊，用高溫灼燒冷卻后的接種環(huán)從切面直接插入病料組織中，抽出后用三線法接種于TSB 培養(yǎng)基和5% LB 綿羊血平板培養(yǎng)基上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)10 h，觀察第1 代培養(yǎng)菌在培養(yǎng)基上的生長情況。用革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌的顏色、大小、形態(tài)[9]，再用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上的菌落接種于TSB 培養(yǎng)基和5% LB 綿羊血平板培養(yǎng)基上進一步純化培養(yǎng)，鏡檢觀察第2 代培養(yǎng)菌。取純化后的菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基上，通過37℃搖床增菌，然后革蘭氏染色鏡檢，即可得到純化的第3 代培養(yǎng)菌。

3.3 形態(tài)學(xué)觀察

固體培養(yǎng)基上形態(tài)學(xué)觀察，選擇干凈滅菌的載玻片，往載玻片上滴1 滴蒸餾水備用，用高溫滅菌后的接種環(huán)在培養(yǎng)基上挑選生長情況良好的菌落蘸取其一半，于蒸餾水中稀釋，用火焰固定法固定，然后用革蘭氏染色法進行染色，結(jié)晶紫1～2 min、碘液1～3 min、酒精30～60 s、復(fù)紅染液15～30 s，自然風(fēng)干后用顯微鏡觀察其顏色、形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)。液體培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)觀察，取出純化的菌液放入操作臺中，選擇干凈的載玻片備用，用移液槍取10 μL 菌液放入載玻片上，用滅菌的接種環(huán)順時針旋轉(zhuǎn)抹開，用火焰法固定，然后用革蘭氏染色法進行染色，風(fēng)干后顯微鏡下觀察，與固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌進行對比。

3.4 生化試驗

嚴(yán)格按照無菌操作，在無菌操作臺上進行。準(zhǔn)備好葡萄球菌生化試驗所需要的微量生化鑒定管、山梨醇、木糖、葡萄糖蛋白胨水（VP）、尿素、葡萄糖產(chǎn)氣、硫化氫等，將分離好的純種菌液用移液槍取50 μL 分別接種于微量生化管中，用封口膜密封好放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，即可取出觀察。VP 試驗的葡萄糖蛋白胨水微量管取出后還需要先加入VP 試劑甲液3 滴，再加VP 試劑乙液1 滴，然后再放回恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h取出觀察結(jié)果。

3.5 分子生物學(xué)鑒定

3.5.1 DNA 提取

⑴取菌液300 μL 于200 mL 離心管中，加入DNA zol 700 μL，顛倒3 次使其混勻然后靜置5 min，放入離心機中12 000 rpm 離心10 min；

⑵取上清液800 μL，加入到新的2 mL 離心管中；⑶再加入500 μL 無水乙醇，顛倒混勻5 次，靜置3 min，放入離心機7 500 rpm 離心3 min 棄上清液；

⑷加入800 μL 75%無水乙醇，顛倒混勻，放入離心機12 000 rpm 離心5 min 棄上清液；

⑸重復(fù)第（4）步；

⑹開蓋靜置使無水乙醇揮發(fā)；

⑺加入40 μL 8 mM 的NaOH，用移液槍重復(fù)稀釋混勻即可得到提取的DNA；

⑻過夜保存放入4℃冰箱，長期保存放入-20℃冰箱。

3.5.2 PCR

檢測16S rRNA 的擴增所需反應(yīng)體系及反應(yīng)條件[10]，見表1、表2。

表1 PCR 反應(yīng)體系

表2 PCR 反應(yīng)條件

3.5.3 電泳

⑴制作凝膠：稱取0.5 g 瓊脂糖，倒入50 mL（1×TAE）緩沖液，放入微波爐加熱2 min，待其完全溶解再次加熱至清澈透明無沉淀；選擇大小合適的齒梳插入膠板中卡好，備用；靜待瓊脂糖溶液冷卻1 min 后加入5 μL 核酸染液充分混勻；倒入制膠板中，確認(rèn)凝膠中無氣泡或無異物，等待15～30 min 凝固后拔出梳子[11]。

⑵點樣：第一個泳道加入DL2000 marker，其余泳道加PCR 產(chǎn)物，最后一個泳道加空白對照；

⑶把點樣好的凝膠板放入DYY12 型電泳儀中30 min；

⑷電泳瓊脂糖凝膠板放入C1000 TouchTM 型全自動凝膠成像分析儀進行觀察；

⑸把擴增所得基因片段送測序公司進行測序。

3.5.4 測序及序列比對

把測序的基因片段，用數(shù)據(jù)庫NCBI 的序列進行同源性比對。

3.6 藥敏試驗

采用藥敏紙片擴散法進行藥敏試驗，嚴(yán)格按照無菌操作，在無菌操作臺上進行。首先選好該試驗所需要的藥敏紙片：氧氟沙星、慶大霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、紅霉素、克林霉素、頭孢他啶、新霉素、青霉素、四環(huán)素、林可霉素[12]。選擇3 個BD 培養(yǎng)基，用移液槍取100 μL 分離好的葡萄球菌菌液接種于BD 培養(yǎng)基上，然后用高溫滅菌后的涂布棒均勻涂布（必須均勻涂布不然會影響試驗結(jié)果），涂布均勻后，在培養(yǎng)基上選擇4 個適當(dāng)位置放上藥敏紙片（放藥敏紙片的時候按壓一下以防脫落），放好紙片后，把培養(yǎng)基放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h 取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑即可。結(jié)果判定參照美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員（NCCLS）推薦的規(guī)定進行判斷，即抑菌圈直徑＞20 mm 為極敏，在15～20 mm 之間為高敏，在10～14 mm 之間為中敏，＜10 mm 為低敏，無抑菌圈為耐藥[13,14]。

4 結(jié)果

4.1 剖檢結(jié)果

體表觀察有劃水現(xiàn)象、呼吸急促、喘氣、站立困難、精神萎靡不振、眼結(jié)膜蒼白、消瘦、口鼻眼有黏液、皮膚各處有創(chuàng)傷結(jié)痂、皮膚外表泛紅呈紅斑、前肢肘關(guān)節(jié)處有許多透明小水泡，如下圖1。

圖1 病豬體表觀察

肝臟色澤不均一、有淤血，部分肝臟顏色偏黃、部分肝臟顏色呈暗紅色、質(zhì)地實，切開肝臟，血液顏色偏黑紅，膽囊腫大、膽汁顏色為藍綠色，肺臟質(zhì)地實而硬、顏色不均一、有大面積出血塊。肺葉外緣蒼白無色。心臟心包膜與心臟分離明顯、心臟顏色偏灰白。脾臟上有白色結(jié)節(jié)、有水泡、顏色偏灰紫。腎臟色澤不均一、有散狀出血斑、腎乳頭呈灰白色、腎盂有膿性分泌物（尿酸鹽沉積）。有些腸段鼓氣、空虛、透明、充血，有些腸段內(nèi)含有暗褐色的比較干硬的圓球狀內(nèi)容物，腸系膜出血嚴(yán)重、血管明顯腫大。胃中黏液增多、有黃色液體殘渣、出血嚴(yán)重。

4.2 分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果

4.2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

將病料組織液接種于TSB 培養(yǎng)基和5%綿羊血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 h，發(fā)現(xiàn)TSB 培養(yǎng)基表面長有圓形、不透明、表面隆起、光滑、圓珠狀菌落，直徑1.0～2.0 mm；5%綿羊血平板培養(yǎng)基表面長有圓形、乳白色、針尖狀菌落、稍粘、無溶血環(huán)。

4.2.2 鏡檢觀察結(jié)果

用革蘭氏染色法進行染色觀察，發(fā)現(xiàn)菌體呈藍紫色，菌株屬于革蘭氏陽性菌，其形態(tài)特征主要為雙球或短鏈狀排列或數(shù)個球狀細(xì)菌串聯(lián)成葡萄狀，可將其初步判定為豬源葡萄球菌。

4.3 生化試驗結(jié)果

生化鑒定結(jié)果見表3，7 株生化試驗結(jié)果一樣，均符合豬源葡萄球菌的生化特性。

表3 生化試驗結(jié)果

4.4 PCR 檢測結(jié)果

用顯微鏡觀察得到的7 個樣本葡萄球菌基因組作為模板，一個空白對照，用PCR 法對16S rRNA 基因序列進行擴增，通過電泳30 min，用C1000 TouchTM 型全自動凝膠成像分析儀進行觀察，該試驗菌株16S rRNA基因PCR 產(chǎn)物的大小約為1 500 bp，與預(yù)期片段大小基本符合，而且陽性對照和陰性對照結(jié)果成立。

進一步送北京測序公司測序得到7 株細(xì)菌基因片段，用數(shù)據(jù)庫NCBI 的序列進行多重比對，得出結(jié)果為分離出來的菌株DNA 與葡萄球菌的核苷酸同源性高為99.93%，由此推斷本試驗獲得的菌株為豬源葡萄球菌。

4.5 藥敏試驗結(jié)果

采用藥敏紙片擴散法檢測分離菌株對不同抗生素藥物的敏感性，試驗結(jié)果如表4所示，分離菌株對抗生素氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、萬古霉素、新霉素高度敏感；對青霉素、四環(huán)素、克林霉素、頭孢他啶中度敏感；對慶大霉素、林可霉素、紅霉素產(chǎn)生耐藥。

表4 分離菌株耐藥性分析

5 討論

本試驗為了分離豬源葡萄球菌，從阿克蘇某豬場挑選3 頭疑似葡萄球菌感染的患病仔豬。通過解剖觀察內(nèi)臟病變情況，發(fā)現(xiàn)病變明顯的部位主要有腸、脾臟、肝臟、肺臟和膽囊，實驗室細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌落顏色、形態(tài)、大小，初步判斷分離得到葡萄球菌；然后通過生化試驗鑒定和PCR 測序結(jié)果得出7 株與豬源葡萄球菌的同源性達99.93%的菌株。藥敏試驗顯示該菌株對慶大霉素、青霉素、四環(huán)素、林可霉素、紅霉素、克林霉素、頭孢他啶均有耐藥性，而對頭孢唑啉、萬古霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、新霉素表現(xiàn)敏感；頭孢唑啉、新霉素與查找資料中標(biāo)準(zhǔn)抗菌譜結(jié)果存在差異[15]，病菌應(yīng)該對該2 種抗生素產(chǎn)生低敏和耐藥性，但在試驗中卻對其表現(xiàn)高敏性。此外，其他文獻報道葡萄球菌對克林霉素、慶大霉素及四環(huán)素敏感性較高，但本試驗的菌株對以上3 種抗生素卻產(chǎn)生低敏和耐藥性[16]。通過了解發(fā)現(xiàn)，3 頭病豬在豬場治療時使用的抗生素為慶大霉素和四環(huán)素，可能是由于該原因?qū)е虏【l(fā)生變異，對藥敏試驗結(jié)果造成一定影響。病豬臨床癥狀的不明顯和解剖病變結(jié)果的差異也可能是由于病豬在豬場接受治療所引起。由此可推斷該3 頭患病仔豬是由葡萄球菌和其他病菌共同感染所致。

6 結(jié)論

本試驗從3 頭病豬料中分離出7 株豬源葡萄球菌，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、PCR 檢測都與豬源葡萄球菌性狀一致。最后進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，該菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、新霉素高度敏感，對青霉素、四環(huán)素、克林霉素、頭孢他啶中度敏感，對慶大霉素、林可霉素、紅霉素耐藥。