基于5-HT 探討電針刺激天樞、足三里對(duì)IBS-D 大鼠的影響

張之涵，劉羽彤，顧 玲，趙旭宇，花 煬，葛 飛*，陳美娟*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬海安市中醫(yī)院，江蘇 海安 226600

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome, IBS)是一種臨床上較為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)紊亂的功能障礙性綜合征，病變部位以胃腸為主[1]。 其臨床表現(xiàn)為慢性或間歇性的腹痛，腹部不適，并伴有大便性狀和排便習(xí)慣的異常變化，且受環(huán)境、飲食、情緒等諸多因素影響。 臨床上，根據(jù)排便特點(diǎn)和糞便性狀分為腹瀉型、便秘型和混合型3 種。 其中，腹瀉型腸易激綜合征（diarrheal irritable bowel syndrome, IBS-D）在我國(guó)IBS 患者中占比最多[2]。除消化系統(tǒng)癥狀外，IBS-D患者大多數(shù)還存在情緒易激動(dòng)、煩躁易怒等精神心理癥狀，這對(duì)患者及其家屬的生活質(zhì)量、精神狀態(tài)產(chǎn)生極大的影響[3]。

IBS-D 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。目前認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制與胃腸動(dòng)力學(xué)異常、內(nèi)臟超敏反應(yīng)等相關(guān)[4]。 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與腸道運(yùn)動(dòng)和內(nèi)臟感覺(jué)功能密切相關(guān)。5-HT 通過(guò)激活腸道神經(jīng)元上的5-HT 受體，如5-羥色胺受體3A 型（5-hydroxytryptamine 3A receptor,5-HT3AR），增加腸道神經(jīng)元的興奮性。 導(dǎo)致腸道神經(jīng)傳導(dǎo)異常，使腸道對(duì)觸摸、壓力和其他刺激產(chǎn)生過(guò)度的反應(yīng)，從而導(dǎo)致腸道高敏感[5]。 研究表明，可通過(guò)針刺天樞、內(nèi)關(guān)、足三里等穴位，作用于白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、5-HT、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）等多個(gè)靶點(diǎn)，保護(hù)腸黏膜抑制炎癥反應(yīng)，從而有效緩解腸道高敏感性[6]。

相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示，針灸治療消化系統(tǒng)疾病具有療效佳、預(yù)后好、難復(fù)發(fā)、成本低、患者依從性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[7]。 腧穴的選擇作為針灸處方的第一組成要素，與針灸的治療效果密切相關(guān)。 本研究在中醫(yī)學(xué)“合募配穴”的指導(dǎo)思想下，基于IBS-D 發(fā)病機(jī)制的多樣性，提出“同經(jīng)異腑合募配穴”的刺灸方案，選擇手陽(yáng)明大腸經(jīng)募穴天樞和足陽(yáng)明胃經(jīng)下合穴足三里，以期更好地改善IBS-D 的臨床癥狀。 傳統(tǒng)針灸是通過(guò)在人體穴位上針刺來(lái)刺激經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)，以達(dá)到治療疾病的目的。 而電針則在傳統(tǒng)針灸的基礎(chǔ)上引入了現(xiàn)代的電子設(shè)備，通過(guò)電流刺激穴位，從而增強(qiáng)治療效果。電針是針灸的一種現(xiàn)代形式，是傳統(tǒng)中醫(yī)融入現(xiàn)代科技的典型代表，故本研究將采用電針來(lái)刺激穴位。

為進(jìn)一步探究電針對(duì)IBS-D 降低腸道高敏感性、緩解腹瀉癥狀等優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)以IBS-D 大鼠作為研究對(duì)象，觀察經(jīng)“同經(jīng)異腑合募配穴”電針干預(yù)后，對(duì)IBS-D 大鼠一般體征、內(nèi)臟高敏感性及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)等影響，初步從5-HT/5-HT3R 通路探討電針治療IBS-D 的作用機(jī)制，以期為電針治療IBS-D的臨床應(yīng)用提供科學(xué)客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6～8 周齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠共24 只，體質(zhì)量（190±90） g。 由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，噪音低于50 dB，光照時(shí)間與黑暗時(shí)間各12 h，并給予正常飲食飲水，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的所有處置均嚴(yán)格遵循2006年中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[8]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：202309A023）。

1.2 藥物制備

根據(jù)需要進(jìn)行造模的各組大鼠體質(zhì)量計(jì)算所需番瀉葉藥液量（按10 mL/kg 計(jì)算），再計(jì)算出番瀉葉（海安市中醫(yī)院中藥房，批號(hào)：20221008）生藥量，稱取后用約4 倍番瀉葉體積的沸水浸泡番瀉葉30 min，用紗布過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾藥渣，再煎煮濃縮，制成生藥含量為0.45 g/mL 的番瀉葉藥液。 稱取一定質(zhì)量的阿洛司瓊（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：A125218），用純水溶解最終配制成2 mg/mL 的濃溶液。 稱取一定質(zhì)量的烏來(lái)糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S30HS196618），用純水溶解最終配制成20%的烏來(lái)糖溶液。 以上藥液制備完成后放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，阿洛司瓊使用時(shí)用純水將2 mg/mL 的濃溶液稀釋成1 mg/mL 的阿洛司瓊?cè)芤骸?/p>

1.3 主要試劑及藥品

Western 及IP 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：21309264、111622221213）；5-HT ELISA 檢測(cè)試劑盒（武漢Elabscience生物有限公司，批號(hào)：PA088P8J0805）；5-HT3A 一抗（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：1017902-1）；GAPDH 單克隆抗體（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：00119680）；HRP 山羊抗兔IgG二抗 （美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)：C15140851）。

1.4 主要儀器

凝膠成像分析儀器、垂直電泳儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)：Universal Hood Ⅱ、PowerPacTM Basic]；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司，型號(hào)：BioTek-Elx800）；高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：Scientz-48）；電子分析天平（上海YEASEN 生物科技有限公司，型號(hào)：FA2004N）；制冰機(jī)[斯科茨曼制冰系統(tǒng)（上海）有限公司，型號(hào)：AF100AS）]；標(biāo)準(zhǔn)型旋轉(zhuǎn)混勻儀、金屬浴恒溫器[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司，型號(hào)分別為：MX-S、5012101200]；臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：LX-100）；低溫高速離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：D3024R]；超純水儀（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PLUS-E2-10TJ）；華佗牌毫針（蘇州針灸用品廠，規(guī)格：0.25 mm×25 mm）；華佗牌電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號(hào)：SDZ-Ⅱ)。

2 方法

2.1 分組與造模方法

SD 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將24 只大鼠隨機(jī)分為4 組，分別為空白組、模型組、阿洛司瓊組及電針組，每組各6 只。選擇灌服番瀉葉煎劑聯(lián)合慢性束縛及避水應(yīng)激建立IBS-D 動(dòng)物模型。第1～21 天，將模型組、阿洛司瓊組及電針組大鼠束縛在自制鼠瓶?jī)?nèi)，限制其活動(dòng)，時(shí)長(zhǎng)為2 h；第8～21 天，以上3 組大鼠束縛后灌服番瀉葉溶液，給藥體積為10 mL/kg；第15～21 天，在一個(gè)透明的塑料容器（73 cm×54 cm×44 cm）中心位置固定一個(gè)圓形平臺(tái)（12 cm×12 cm×20 cm)，在容器里加入室溫以下的水，水面低于平臺(tái)面1 cm，將大鼠放置在平臺(tái)上1 h，并避免外界干擾，連續(xù)造模21 d。將每組大鼠分開(kāi)放置于代謝籠中，分別記錄各組大鼠6 h內(nèi)排出的稀便數(shù)與總排便數(shù)。 以稀便率（稀便數(shù)/總排便數(shù)×100%）≥25%作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[9]。

2.2 干預(yù)方法

造模成功后，對(duì)空白組、模型組與電針組大鼠予以生理鹽水按1 mL/100 g 體質(zhì)量灌胃，對(duì)阿洛司瓊組大鼠予以1 mg/mL 濃度的阿洛司瓊?cè)芤喊? mL/100 g 體質(zhì)量灌胃，1 次/d，連續(xù)灌胃14 d。對(duì)電針組大鼠每日16:00 開(kāi)始進(jìn)行電針治療，大鼠在5%異氟烷伴70%氮?dú)夂?0%氧氣誘導(dǎo)麻醉后，以1%～2%的濃度維持麻醉。取大鼠仰臥位，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜，選取實(shí)驗(yàn)大鼠的單側(cè)足三里、天樞，次日選取對(duì)側(cè)穴位。用0.25 mm×25 mm華佗牌毫針直刺，天樞直刺3 mm、足三里直刺5 mm后進(jìn)行電針干預(yù)治療，正極連天樞，負(fù)極連足三里，兩毫針間隔超過(guò)0.5 mm 且不接觸，避免短路。 電針參數(shù)為疏密波（疏波10 Hz/密波50 Hz），強(qiáng)度定于該治療儀“1”檔左右，頻率2/100 Hz，電源電壓9 V，電針時(shí)間15 min，1 次/d，連續(xù)治療14 d。

2.3 大鼠內(nèi)臟敏感性評(píng)估

腹壁回撤反射（abdominal wall retraction reflex,AWR）實(shí)驗(yàn)[11]：0 分為無(wú)行為反應(yīng)，4 分為骨盆抬起、身體呈弓狀，0～4 分隨著大鼠結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)的行為表現(xiàn)增強(qiáng)而評(píng)分增加。具體過(guò)程如下：大鼠評(píng)分前18 h禁食不禁水，用乙醇棉片對(duì)大鼠肛門(mén)進(jìn)行消毒，再將8 號(hào)導(dǎo)尿管前端用甘油進(jìn)行潤(rùn)滑，然后將導(dǎo)尿管從大鼠肛門(mén)慢慢插入，直至球囊距肛門(mén)1 cm 左右時(shí)停止（應(yīng)輕柔不可暴力），此時(shí)實(shí)驗(yàn)人員用手將導(dǎo)尿管與大鼠尾根部固定在一起。 待大鼠平靜后用5 mL注射器連接好導(dǎo)尿管并向球囊內(nèi)緩慢均勻注水使其擴(kuò)張，觀察并記錄大鼠AWR 實(shí)驗(yàn)達(dá)到4分時(shí)所需的注水量。連續(xù)測(cè)量3 次，每次20 s，每次間隔5 min，最終結(jié)果取3 次測(cè)量結(jié)果的平均值。AWR 實(shí)驗(yàn)為相同施術(shù)者進(jìn)行操作以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

2.4 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 動(dòng)物取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 天，各組大鼠禁食不禁水。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天用20%烏來(lái)糖溶液進(jìn)行麻醉，劑量按大鼠體質(zhì)量1 mL/100 g 計(jì)算。 于大鼠頸動(dòng)脈取血后，在離心機(jī)中以4 000 r/min 離心10 min（離心半徑40 cm），分離血清。 再將標(biāo)本放置-80 ℃冰箱保存，用于5-HT ELISA 試劑盒檢測(cè)。解剖分離大鼠末端結(jié)腸，均剪取同一部位約1 cm 結(jié)腸末端組織，用生理鹽水將結(jié)腸組織沖洗干凈后；一半放置于濃度為10%的中性甲醛溶液中固定，用于結(jié)腸HE染色；另一半直接放置在1.5 mL 離心管并置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot 實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 一般指標(biāo)檢測(cè) （1）一般情況觀察：觀察每天各組大鼠外觀、活動(dòng)情況、情志等變化。（2）體質(zhì)量增長(zhǎng)率（%）=（2 周后的大鼠體質(zhì)量-2 周前的大鼠體質(zhì)量）/2 周前的大鼠體質(zhì)量×100%。

2.4.3 糞便含水量 取小鼠的新鮮糞便，稱取濕重（g），于烘箱烘干72 h 后再稱取其干重（g）以計(jì)算糞便含水量。 糞便含水量（%）=（新鮮糞便-糞便干重）/新鮮糞便×100%。

2.4.4 HE 染色觀察結(jié)腸組織形態(tài) 將4%多聚甲醛固定大鼠結(jié)腸組織經(jīng)石蠟包埋、切片后，經(jīng)過(guò)PBS、蘇木精染液浸泡，清洗過(guò)后，再由酸性乙醇浸潤(rùn)，碳酸鋰、伊紅染液浸泡后由乙醇、二甲苯溶液浸泡封片后。 在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織形態(tài)病變情況。

2.4.5 血清中5-HT 濃度的測(cè)定 ELISA 法檢測(cè)血漿中5-HT 含量。分別按照試劑盒操作步驟，檢測(cè)血清中5-HT 含量的變化。

2.4.6 Western blot 驗(yàn)證目的蛋白含量的改變 （1）組織總蛋白的提取：用RIPA 裂解緩沖液提取大鼠結(jié)腸組織中的總蛋白。（2）蛋白含量測(cè)定：用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。 （3）SDS-PAGE 電泳：電泳過(guò)后，將總蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上轉(zhuǎn)膜過(guò)程90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜浸泡在含一抗（1∶1000）溶液中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 清洗后再與二抗（1∶1000）孵育2 h。最后，曝光后分析蛋白5-HT3AR 的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用GraphPad Prism 9.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析。 以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況觀察

空白組實(shí)驗(yàn)期間活動(dòng)正常，精神正常，毛發(fā)有光澤，反應(yīng)敏捷，大便成型，肛門(mén)無(wú)糞染。 造模成功后的大鼠（模型組、阿洛司瓊組、電針組)出現(xiàn)精神疲倦，活動(dòng)減少，扎堆蜷縮于角落，易激惹，未見(jiàn)黏液血便，肛門(mén)可見(jiàn)不成形糞便黏附，糞染明顯，墊料污染嚴(yán)重。 電針治療期間及電針治療后，模型組一般情況無(wú)明顯改善；阿洛司瓊組精神一般，較造模后好動(dòng)，大便成形，為糞粒狀；電針組精神良好，活動(dòng)正常，毛色恢復(fù)光澤，大便干濕適中，為成形糞粒。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較

與治療前比較，治療后空白組、模型組、阿洛司瓊組及電針組體質(zhì)量增長(zhǎng)率顯著降低（P<0.001）；與空白組比較，模型組與阿洛司瓊組體質(zhì)量增長(zhǎng)率降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組、阿洛司瓊組大鼠比較，電針組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率升高（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率變化（±s，%）

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率變化（±s，%）

注：與治療前比較，△△△P<0.001；與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與阿洛司瓊組比較，&P<0.05。

組別空白組模型組阿洛司瓊組電針組n6666治療后0.090±0.004△△△-0.010±0.006△△△**0.010±0.014△△△*0.070±0.049△△△#&治療前0.450±0.050 0.310±0.060 0.320±0.030 0.320±0.020

3.3 各組大鼠糞便含水量比較

與治療前比較，電針組糞便含水量顯著降低（P<0.01）；與空白組比較，模型組及阿洛司瓊組糞便含水量高（P<0.001，P<0.05）；與模型組、阿洛司瓊組比較，電針組的糞便含水量降低（P<0.001，P<0.05）。 詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠糞便含水量變化（±s，%）

表2 各組大鼠糞便含水量變化（±s，%）

注：與治療前比較，△△P<0.01；與空白組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，##P<0.01；與阿洛司瓊組比較，&P<0.05。

組別空白組模型組阿洛司瓊組電針組n6666治療前0.43±0.23 0.82±0.15 0.81±0.10 0.82±0.06治療后0.37±0.12 0.82±0.06***0.66±0.10*0.42±0.09△△##&

3.4 各組大鼠腸道敏感性比較

與治療前比較，治療后空白組、模型組、阿洛司瓊組及電針組大鼠腸道容量閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組腸道容量閾值顯著降低（P<0.001）；與模型組比較，阿洛司瓊組與電針組腸道容量閾值升高（P<0.05）；與阿洛司瓊組比較，電針組大鼠腸道容量閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腸道容量閾值變化（±s，mL）

表3 各組大鼠腸道容量閾值變化（±s，mL）

注：與空白組比較，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

組別空白組模型組阿洛司瓊組電針組n6666治療前2.63±0.15 1.67±0.42 1.47±0.42 1.60±0.35治療后2.57±0.21 1.27±0.16***2.00±0.35#2.00±0.26#

3.5 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)比較

空白組結(jié)腸黏膜上皮完整、吸收細(xì)胞呈柱狀，上皮內(nèi)混有少量杯狀細(xì)胞，上皮下的隱窩排列規(guī)則、高度正常，隱窩內(nèi)含大量杯狀細(xì)胞，細(xì)胞密度適中。 模型組可見(jiàn)黏膜局部糜爛壞死，壞死灶疏松、毛細(xì)血管擴(kuò)張、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。阿洛司瓊組可見(jiàn)隱窩局部壞死、間質(zhì)疏松、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。電針組黏膜上皮完整，吸收細(xì)胞呈柱狀，黏膜皺壁中可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞。 與模型組比較，阿洛司瓊組黏膜上皮完整，壞死范圍明顯減小。 與模型組比較，電針組上皮尚且完好，且無(wú)壞死灶。 與阿洛司瓊組比較，電針組上皮完整，無(wú)壞死炎性損傷程度輕。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)相比（HE，×200，標(biāo)尺=50 μm）

3.6 各組大鼠血清中5-HT 含量比較

與空白組比較，模型組血清中5-HT 的含量上升（P<0.05）；與模型組比較，電針組血清中5-HT 含量下降（P<0.05）；與阿洛司瓊組比較，電針組血清中5-HT 的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清5-HT 含量（±s，ng/mL）

表4 各組大鼠血清5-HT 含量（±s，ng/mL）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別空白組模型組阿洛司瓊組電針組n6666 5-HT 256.60±92.12 1 656.00±1 109.00*307.80±134.70 467.80±149.20#

3.7 各組大鼠結(jié)腸5-HT3AR 蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組結(jié)腸的5-HT3AR 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；與模型組比較，阿洛司瓊組和電針組結(jié)腸的5-HT3AR 蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.001）；與阿洛司瓊組比較，電針組結(jié)腸5-HT3AR蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.001）。 詳見(jiàn)圖2、表5。

圖2 各組大鼠結(jié)腸5-HT3AR 蛋白表達(dá)量結(jié)果

表5 各組大鼠結(jié)腸5-HT3AR 蛋白表達(dá)量（±s）

表5 各組大鼠結(jié)腸5-HT3AR 蛋白表達(dá)量（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，###P<0.001；與阿洛司瓊組比較，&&&P<0.001。

組別空白組模型組阿洛司瓊組電針組n6666 5-HT3AR/GAPDH 2.04±0.16 2.32±0.11*1.76±0.07###1.29±0.04###&&&

4 討論

IBS-D 病機(jī)復(fù)雜，內(nèi)臟敏感性增高是其主要病理生理機(jī)制之一[12]。 慢性束縛應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)紊亂，出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒障礙，進(jìn)而影響內(nèi)臟感覺(jué)傳入神經(jīng)的功能，導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性[13]。結(jié)合課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用長(zhǎng)期單一的慢性應(yīng)激并不能穩(wěn)定制備大鼠內(nèi)臟高敏感模型。 避水應(yīng)激作為一種急性應(yīng)激源，可加重大鼠的心理壓力，進(jìn)一步加重內(nèi)臟高敏感性[14]。以上兩種手段結(jié)合造模結(jié)束后，各組大鼠結(jié)腸容量閾值較空白組顯著降低，說(shuō)明慢性束縛疊加避水應(yīng)激成功誘導(dǎo)IBS-D大鼠的內(nèi)臟高敏感性。番瀉葉是一種天然的瀉藥，其主要成分為番瀉苷，具有刺激腸道蠕動(dòng)和分泌的作用。番瀉葉灌胃后，番瀉苷可以迅速吸收進(jìn)入血液循環(huán)，作用于腸道平滑肌，增加腸道蠕動(dòng)頻率和力度，引發(fā)腹瀉[15]。 用以上3 種方法相結(jié)合的造模方式造模結(jié)束后，與空白組大鼠相比各實(shí)驗(yàn)組大鼠的糞便含水量顯著升高，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功建立IBS-D 大鼠模型。研究表明，針刺對(duì)IBS-D 患者具有顯著的治療效果，但其機(jī)制并不明確[16]。5-HT 是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與腸道運(yùn)動(dòng)和內(nèi)臟感覺(jué)功能密切相關(guān)。在IBS-D患者中，5-HT 含量與受體5-HT3AR 蛋白表達(dá)異常升高，導(dǎo)致出現(xiàn)腸道動(dòng)力學(xué)紊亂和腹瀉癥狀[17]。 本研究發(fā)現(xiàn)，電針可以顯著降低IBS-D模型大鼠血清中5-HT 含量，并下調(diào)IBS-D 模型大鼠結(jié)腸5-HT3AR蛋白表達(dá)。同時(shí)，提高IBS-D 模型大鼠的體質(zhì)量，降低其糞便含水量及其內(nèi)臟敏感性，改善IBS-D 模型大鼠的狀態(tài)，為電針治療IBS-D 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 阿洛司瓊是一種選擇性5-HT3 受體拮抗劑，通過(guò)阻斷腸道神經(jīng)元上的5-HT3 受體，減少5-HT 在腸道中的生物活性，從而達(dá)到緩解腹瀉的作用[18]。這與本研究中電針治療IBS-D 的機(jī)制相似，為電針治療IBSD 提供了有效的參照。電針作為一種非藥物療法，具有副作用小、安全性高的特點(diǎn)，在各方面相較于阿洛司瓊具有一定的優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)學(xué)將IBS-D 歸屬于“腹痛”“腹脹”“泄瀉”等中焦失養(yǎng)范疇，病位以脾胃、大小腸為主，五臟六腑氣機(jī)失調(diào)是此病發(fā)病的關(guān)鍵[19]。 IBS-D 初期病機(jī)為肝失疏泄、氣機(jī)紊亂引發(fā)肝氣乘脾煩胃，繼則脾胃失職，清揚(yáng)不升，濁陰不降，腸腑失司，泄瀉不止。 脾為氣血生化之源，后期病機(jī)為脾虛日久，脾陽(yáng)虧虛，腎陽(yáng)失于溫煦，疾病由虛轉(zhuǎn)實(shí)，綿延難愈。 中醫(yī)論治，先辨其臟腑，IBS-D 病在胃腸，胃腸屬六腑，六腑瀉而不藏，以通為用，其病多實(shí)。 所以，IBS-D 的中醫(yī)治療原則是通降腑氣以治療胃腸實(shí)證。 針灸在調(diào)虛實(shí)、通氣機(jī)等方面，有重要作用。 而腧穴的選擇是針灸處方的第一組成要素，與針灸的治療效果直接相關(guān)。 腧穴的選擇主要涵蓋選穴原則和配穴方法兩部分。 在選穴原則方面，可以從臨證選穴的原因入手。天樞屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，為大腸的募穴。張景岳注釋《素問(wèn)·六微旨大論篇》寫(xiě)道“樞，樞機(jī)也。 居陰陽(yáng)升降之中，是為天樞”，說(shuō)明天樞有調(diào)節(jié)情志、和胃止痛、健脾止瀉的功效，可用于治療腹痛、便秘、腹瀉等胃腸病[20]。 足三里為下合穴，屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，《素問(wèn)·咳論篇》云：“治腑者，治其合。 ”說(shuō)明下合穴是治療腑病的關(guān)鍵， 故足三里可以作為調(diào)理胃腸的腧穴。此外《靈樞·五亂》提及：“氣在于腸胃者……不下者，取之三里。”也解釋了此穴可引腑氣下行，調(diào)三焦腑氣，治肚腑疾病[21]。

本研究從配穴方法的角度出發(fā)，對(duì)“同經(jīng)異腑合募配穴”法進(jìn)行深入的剖析和探索。 《靈樞·本輸》記載“大腸小腸，皆屬于胃，是足陽(yáng)明也”，提示IBS-D可以通過(guò)足陽(yáng)明胃經(jīng)治療[22]。古今多有醫(yī)家記載“合募配穴”的協(xié)同作用，但此次選用的“同經(jīng)異腑合募配穴”法也能體現(xiàn)相互配合、疏通經(jīng)脈、提高療效、易于操作等優(yōu)勢(shì)。 下合穴其位居于下，縱向作用于內(nèi)腑，偏于通降。 足三里為胃經(jīng)的下合穴，有降胃氣之效。 《會(huì)元針灸學(xué)·足陽(yáng)明胃經(jīng)》曰：“天樞者………清氣達(dá)胃府，上通肺金，轉(zhuǎn)濁氣通腸部，故名‘天樞’?！闭f(shuō)明天樞具有轉(zhuǎn)運(yùn)胃氣入腸腑的功效。足三里與天樞相配，調(diào)暢胃經(jīng)上胃腑與下腸腑氣機(jī)的通暢，一上一下，一遠(yuǎn)一近，升降氣機(jī)，斡旋上下，氣機(jī)通暢，陰陽(yáng)相合，可有效改善IBS-D 患者腹痛、腹瀉與情志不舒的癥狀，這與當(dāng)代醫(yī)學(xué)所提倡的舒緩情志的方式相契合[23]。在此之前，“合募配穴”法是治療腸道疾病的常用方法之一。 合募配穴是指將本腑的下合穴與募穴相配。所以，單純的胃腑疾病一般取胃的合募兩穴：中脘和足三里。 但根據(jù)已有研究發(fā)現(xiàn)，此二穴在病理?xiàng)l件下，對(duì)胃的運(yùn)動(dòng)和內(nèi)臟感覺(jué)基本是無(wú)異的[24]，二者配伍也并未達(dá)到“1+1＞1”的效果[25]?；趯?duì)IBS-D 的辨臟腑分析，該病并非是單純的胃腑疾病，故本實(shí)驗(yàn)針對(duì)IBS-D 病位的不單一性提出一種新型的“合募配穴”，也就是用同經(jīng)異腑的合募相配，比如用大腸經(jīng)的募穴配伍胃經(jīng)的下合穴或者用胃經(jīng)的募穴和大腸經(jīng)的下合穴相配。 此前也有大數(shù)據(jù)顯示，天樞、足三里是治療IBS 常用穴中的首要穴位[26]。 最終，本實(shí)驗(yàn)在“合募配穴”的指導(dǎo)思想下，秉承著針灸“辨證與辨經(jīng)相結(jié)合”的診治原則，提出了“同經(jīng)異腑合募配穴”法，選擇用電針刺激足陽(yáng)明胃經(jīng)的天樞、足三里，以期為電針提高IBS-D 的臨床療效奠定良好的基礎(chǔ)與可供借鑒的思路。

本實(shí)驗(yàn)提出“同經(jīng)異腑合募配穴”法治療IBS-D，有效降低了IBS－D 模型大鼠的內(nèi)臟高敏感，緩解其腹痛、腹瀉癥狀。 在前人的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，針灸可以降低IBS-D 患者的血清5-HT 水平[27]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，證明針灸在調(diào)節(jié)5-HT 水平方面具有普遍性。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于5-HT 這一通路的深入研究，大多數(shù)是探究針灸對(duì)于5-HT 上游合成通路的影響[28]，而本研究則是首次探究電針對(duì)于IBS-D模型大鼠5-HT3AR 這一5-HT 受體的調(diào)控作用，這為今后進(jìn)一步探討針灸調(diào)節(jié)IBS-D 的機(jī)制提供了方向。隨著人們對(duì)健康認(rèn)識(shí)的深化，針灸的補(bǔ)瀉手法走進(jìn)大眾的視野中， 目前通過(guò)補(bǔ)瀉手法提高IBS-D的療效的機(jī)制尚不明確，未來(lái)可以結(jié)合“同經(jīng)異腑合募配穴”法進(jìn)一步展開(kāi)研究，希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)転橥蟮膶W(xué)者提供相關(guān)領(lǐng)域的研究方向

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)“同經(jīng)異腑合募配穴”法進(jìn)行電針干預(yù)治療后，IBS-D 模型大鼠血清中5-HT 含量及結(jié)腸5-HT3AR 蛋白表達(dá)均顯著降低，提示“同經(jīng)異腑合募配穴”電針?lè)▽?duì)IBS-D 患者可能表現(xiàn)出更好的臨床療效，這為日后電針治療IBS-D提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)思路。