推拿法介導(dǎo)機(jī)械敏感性離子通道Piezo1 對(duì)骨骼肌損傷模型大鼠細(xì)胞凋亡的影響

黃 博，阮 磊，王蘭蘭，薛惠天，孫夢(mèng)龍，段苗苗，彭 亮*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

骨骼肌損傷是骨骼肌纖維受到外力擊打或長(zhǎng)期耐力牽拉引起損傷的一類(lèi)創(chuàng)傷性疾病， 是人們?nèi)粘ｅ憻捇蜻\(yùn)動(dòng)員專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練中常見(jiàn)的損傷。 在運(yùn)動(dòng)所受的損傷類(lèi)型中，最主要的是骨骼肌損傷，占所有損傷的40.9%[1]。機(jī)械門(mén)控離子通道Piezo1 可將細(xì)胞膜接收到的機(jī)械力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)或化學(xué)信號(hào)，傳遞至胞內(nèi)引起一系列生化反應(yīng)。 國(guó)外研究報(bào)道，肌肉損傷可由細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)[2]。而Piezo1 可能參與骨骼肌損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，在損傷后，Piezo1表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致更多的骨骼肌細(xì)胞凋亡[3]。 由于Piezo1 可直接感受到膜張力的變化而進(jìn)行門(mén)控，因此，任何改變膜張力的生理作用力理論上都可激活Piezo1 通道[4]。

推拿是中醫(yī)傳統(tǒng)治療手法，有其獨(dú)特的生物力學(xué)特征[5]，同樣屬于細(xì)胞外力學(xué)機(jī)械刺激，在骨骼肌肉疾病中進(jìn)行推拿治療可以緩解疼痛并改善功能[6]，其中，法是臨床上治療骨骼肌損傷的常用手法。本課題組前期研究表明，推拿法可促進(jìn)骨骼肌損傷后的修復(fù)進(jìn)程，減少炎癥反應(yīng)，抑制組織纖維化，加快功能恢復(fù)[7-8]。 本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，復(fù)制虎蛇毒素（notexin, NTX）誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌損傷模型，觀察作為細(xì)胞外力學(xué)機(jī)械刺激的推拿手法——法對(duì)大鼠骨骼肌損傷后運(yùn)動(dòng)功能、組織形態(tài)學(xué)、Piezo1、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 （B-lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤2 相關(guān)X 蛋白質(zhì)（B-lymphoma-2 related X protein, Bax）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3）的影響，探討推拿法治療骨骼肌損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量220～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。 每籠4 只，飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃，濕度50%～70%的環(huán)境中，所有大鼠均按標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)，并保持12 h 光照/12 h 黑暗周期。 本研究已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)（審批號(hào)：LLBH-202106070002)。

1.2 主要試劑與儀器

NTX（法國(guó)Latoxan 公司，批號(hào)：L8104-100UG）；戊巴比妥鈉（德國(guó)Merck KGaA 公司，批號(hào)：P3761）；4%多聚甲醛（安徽白鯊生物有限公司，批號(hào)：BL539A）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)：G1005）；TUNEL 試劑盒（瑞士Roche 公司，批號(hào)：11684817910）；DAPI 染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C1002）；Bax 抗體（美國(guó)AAB 公司，批號(hào)：A23917）；Caspase-3 抗體（批號(hào)：AD6311）、Bcl-2 抗體（批號(hào)：DF14173）、Piezo1 抗體（批號(hào)：DF12083）均購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司；β-actin 抗體（批號(hào)：MD6553）、HRP 山羊抗兔二抗（批號(hào)：MD912565）、HRP 山羊抗小鼠二抗（批號(hào)：MD912566）均購(gòu)自英國(guó)MDL 公司；PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司，批號(hào)：ISEQ00010）。

1.3 分組及造模

32 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組、模型組、法組、法+抑制劑組，每組8 只。 除正常組外，其余各組建立SD 大鼠腓腸肌損傷模型[9]。 具體操作如下：在大鼠的右側(cè)下肢腓腸肌部位進(jìn)行剃毛處理，用馬克筆畫(huà)圈標(biāo)記。 以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，保證每只大鼠注射部位一致。 在大鼠的右側(cè)下肢腓腸肌以10 μg/mL 肌內(nèi)注射200 μL NTX，造成肌內(nèi)損傷，肌內(nèi)注射N(xiāo)TX 時(shí)緩慢推進(jìn)液體，并在注射完畢后停留3 s 再拔出針頭，以保證每只大鼠腓腸肌充分吸收藥物。 肌內(nèi)注射24 h 后觀察平衡木測(cè)試結(jié)果，大鼠行走時(shí)間延長(zhǎng)、滑爪次數(shù)增加，表明造模成功[10-11]。正常組大鼠在同樣位置注射200 μL 生理鹽水。

1.4 干預(yù)方法

1.5 觀察指標(biāo)及方法

最后一次干預(yù)結(jié)束后，禁食不禁水24 h，采用平衡木測(cè)試進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估以觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死各組大鼠，立即手術(shù)切取腓腸肌標(biāo)記部位組織，平均分成兩份：一份浸潤(rùn)于4%多聚甲醛中用于HE染色和TUNEL 染色；另一份組織放入-80 ℃冰箱凍存，待測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.5.1 行為學(xué)測(cè)試 干預(yù)前以及最后一次干預(yù)結(jié)束后，對(duì)4 組大鼠進(jìn)行平衡木測(cè)試[11]。平衡木測(cè)試主要評(píng)估大鼠骨骼肌損傷后的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。 將木梁（2 cm×120 cm）提升到離地面120 cm 的高度，記錄大鼠穿過(guò)木梁后到達(dá)暗箱所需的時(shí)間以及爪子滑動(dòng)的次數(shù)。在測(cè)試前1 天進(jìn)行3 次適應(yīng)性試驗(yàn)，目的是讓大鼠熟悉木梁和暗箱。每次試驗(yàn)后用75%乙醇清洗木梁和暗箱。

1.5.2 組織學(xué)觀察 將浸潤(rùn)于4%多聚甲醛中的腓腸肌組織塊進(jìn)行石蠟包埋，制成5 μm 厚切片，先后進(jìn)行蘇木素染色和伊紅染色，脫水封片，光鏡下觀察腓腸肌組織的病理變化。

1.5.3 TUNEL 染色 取4%多聚甲醛固定的腓腸肌組織，橫切為5 μm 厚度的切片，石蠟包埋。 嚴(yán)格按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 染色結(jié)束后用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每個(gè)切片取5 個(gè)不同視野區(qū)域，并利用Image J 軟件記錄陽(yáng)性（綠色）細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，計(jì)算公式：細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.4 Western blot 檢測(cè)SD 大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達(dá) 組織加液氮進(jìn)行勻漿后， 加入裂解液，4 ℃，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑7 cm），收集上清液；BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度；配制SDS-PAGE 凝膠，樣品輕輕加至凝膠孔中，調(diào)制電泳儀（電壓約8 V/cm）使樣品通過(guò)凝膠；電泳結(jié)束后，將分離到的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，65 V 轉(zhuǎn)膜2 h；室溫、搖床封閉1 h；一抗[Piezo1 抗體、Bax 抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-3抗體、β-actin 抗體（稀釋比例均為1∶1 000）]4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；二抗用TBST 稀釋300倍，室溫、避光緩慢搖動(dòng)1 h；按1∶1 混合ECL 試劑盒中兩種液體，均勻鋪在PDVF 膜表面，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取目的蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 計(jì)量資料均符合正態(tài)分布時(shí)用“±s”表示，組間比較用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選擇Tamhane T2 法；不符合正態(tài)分布時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠平衡木測(cè)試結(jié)果比較

圖1 各組大鼠平衡木時(shí)間及滑爪次數(shù)結(jié)果比較（n=8）

2.2 各組大鼠腓腸肌組織顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

正常組大鼠肌細(xì)胞大小均勻，排列緊密，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠大量肌細(xì)胞破裂、壞死、大小不一，排列稀疏、無(wú)規(guī)律，周?chē)写罅恐行粤＜?xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；法組大鼠肌細(xì)胞病理情況好轉(zhuǎn)，有少量細(xì)胞破裂、萎縮、壞死，細(xì)胞間隔縮小，輕度局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；法+抑制劑組大鼠有較多肌細(xì)胞萎縮、壞死、大小不一，排列間隔較大，周?chē)兄行粤＜?xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌組織HE 染色結(jié)果（×400）

2.3 各組大鼠腓腸肌組織細(xì)胞凋亡率比較

表1 各組大鼠腓腸肌組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠腓腸肌組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與法組比較，△△P<0.01。

分組正常組模型組images/BZ_117_410_2555_441_2588.png法組images/BZ_117_351_2614_382_2647.png法+抑制劑組細(xì)胞凋亡率/%2.31±1.74 43.41±25.02**10.18±9.37##39.06±19.62**△△

圖3 各組大鼠腓腸肌組織TUNEL 染色（×400）

2.4 各組大鼠Piezo1、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較

表2 各組大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與法組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

分組正常組模型組images/BZ_117_1256_2288_1285_2322.png法組images/BZ_117_1256_2347_1285_2381.png法+抑制劑組Piezo1 0.43±0.06 0.30±0.08**0.40±0.05##0.33±0.06**△Bax 0.24±0.06 0.35±0.07**0.28±0.06#0.32±0.06*Bcl-2 0.34±0.06 0.22±0.07**0.31±0.06##0.26±0.05**Caspase-3 0.30±0.04 0.43±0.05**0.34±0.04##0.40±0.04**△△

圖4 各組大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白電泳圖

3 討論

骨骼肌損傷時(shí)會(huì)經(jīng)歷退化、炎癥、再生和纖維化的連續(xù)過(guò)程[12]，過(guò)度的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡不利于骨骼肌的修復(fù)和再生[13-14]，因此，抗炎與抗凋亡治療對(duì)骨骼肌再生和促進(jìn)損傷后的愈合非常重要。 推拿法是中醫(yī)推拿在臨床上使用極為廣泛的手法之一，可產(chǎn)生行氣活血、舒筋活絡(luò)、緩解痙攣的功效，對(duì)骨骼肌損傷療效顯著[15]。 本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，推拿法可改善骨骼肌損傷后的炎癥及纖維化情況，促進(jìn)骨骼肌的修復(fù)[7-8]。Piezo1 在肌細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞中均有表達(dá)[16]，Piezo1 的激活既可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化[17]，也參與調(diào)控骨骼肌組織中的細(xì)胞凋亡過(guò)程。 有研究表明，在缺失Piezo1 的小鼠中，骨骼肌組織中促凋亡因子Bax 和Caspase-3 表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加[18]。 基于此，本研究進(jìn)一步觀察Piezo1 對(duì)推拿法干預(yù)后骨骼肌損傷細(xì)胞凋亡的影響，以豐富前期研究?jī)?nèi)容。

NTX 作為一種肌肉毒素，注射入骨骼肌后可導(dǎo)致肌纖維的損害而不影響神經(jīng)和血管，避免如擠壓、撕裂中常見(jiàn)的缺血與纖維化的競(jìng)爭(zhēng)性并發(fā)癥，另外還可使損傷程度及范圍保持一致性[19]，因而廣泛應(yīng)用于骨骼肌損傷模型中[9]。 平衡木測(cè)試可評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與平衡能力，因此，可用于測(cè)試骨骼肌自身?yè)p傷后的運(yùn)動(dòng)功能變化，以此評(píng)估骨骼肌損傷程度[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，平衡木測(cè)試結(jié)果顯示，相比正常組，模型組大鼠行走時(shí)間明顯延長(zhǎng)、 滑爪次數(shù)顯著增多，HE 染色顯示，模型組大鼠肌細(xì)胞萎縮、破裂、壞死、大小不一，排列稀疏、無(wú)規(guī)律，周?chē)写罅恐行粤＜?xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，這些提示模型組大鼠腓腸肌炎癥顯著，運(yùn)動(dòng)功能下降，損傷明顯。 在推拿法干預(yù)后，腓腸肌損傷大鼠的平衡木行走時(shí)間縮短、滑爪次數(shù)減少，HE 染色顯示，大鼠肌細(xì)胞病理情況相比模型組明顯好轉(zhuǎn)，僅有少量細(xì)胞破裂、萎縮、壞死，細(xì)胞間隔縮小，炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明推拿法可減輕骨骼肌損傷，使運(yùn)動(dòng)功能得以改善。

Piezo1 作為一種大型跨膜蛋白，可接受力學(xué)機(jī)械刺激，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的傳導(dǎo)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1 可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化[17]和成肌細(xì)胞融合[21]，是骨骼肌再生和修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在任何可以改變膜張力的作用下，理論上都能激活Piezo1 通道，如剪切力、機(jī)械拉伸等[4]，而GsMTx4 是目前唯一已知的Piezo1 特異性抑制劑。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，法+抑制劑組的行走時(shí)間和滑爪次數(shù)顯著高于法組，并且從組織病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)上觀察發(fā)現(xiàn)，法+抑制劑組的肌細(xì)胞仍有較多中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，萎縮、壞死的肌細(xì)胞占據(jù)大半。 由此可以推測(cè)，在抑制Piezo1 后，法對(duì)損傷骨骼肌的療效有所降低，Piezo1 可能參與推拿法修復(fù)骨骼肌損傷過(guò)程。

在骨骼肌損傷重構(gòu)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡也發(fā)揮著重要作用。 如Caspases 的激活可參與肌源性分化的初始重塑階段，并防止過(guò)度的細(xì)胞分解和隨后的細(xì)胞死亡；Bcl-2 蛋白家族可通過(guò)調(diào)控線粒體凋亡信號(hào)的起始步驟，影響調(diào)節(jié)肌肉再生[22]。 Bcl-2 家族調(diào)控線粒體膜通透性，影響內(nèi)源性凋亡途徑，家族中Bax可促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C 的釋放，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Caspase-9 形成復(fù)合物，激活與外源性通路共同介導(dǎo)的Caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 Bcl-2 家族中的Bcl-2 則可通過(guò)抑制Bax 而起到抗凋亡作用[23]。BARTOLI 等[18]發(fā)現(xiàn)，Piezo1 的缺失可上調(diào)Bax 和Caspase-3，促進(jìn)骨骼肌組織中的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的肌細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，且與正常組相比，模型組的Bax、Caspase-3 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著下降；而法治療可減少腓腸肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，升高Bcl-2 表達(dá)，降低Bax、Caspase-3 的表達(dá)，提示法對(duì)骨骼肌損傷后細(xì)胞凋亡起到抑制作用；相比法組，法+抑制劑組中細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，Caspase-3 的表達(dá)顯著上升，Bax 和Bcl-2 的表達(dá)水平與法組比較，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但同樣有升高和下降的趨勢(shì)。故本課題組推斷，可能是樣本量不足導(dǎo)致的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也可能是由于有多種共同介導(dǎo)Caspase-3 表達(dá)的細(xì)胞凋亡途徑，除了Bcl-2 和Bax 介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑之外，外源性途徑同樣可影響終末Caspase-3來(lái)決定細(xì)胞是否凋亡。